(12) PATENTTIJULKAISU (10) FI (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats. (51) Kv.Ik. Int.kl.

Transkriptio

1 (12) PATENTTIJULKAISU 11 M F I B PATENTSKRIFT (10) FI (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (51) Kv.Ik. Int.kl. CO7K 14/18 ( ) C12N 15/40 ( ) A61K 39/00 ( ) (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet AT 1352/94 P AT 871/95 P (73) Haltija - Innehavare 1 Baxter Aktiengesellschaft, Industriestrasse 67, 1221 Wien, ITÄVALTA, (AT) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Heinz,Franz Xaver, Josefstädterstrasse 51/1/35, 1080 Wien, ITÄVALTA, (AT) 2 Allison,Steven, Klabundgasse 5-7/4/10, 1190 Wien, ITÄVALTA, (AT) 3 Mandl,Christian, Lienfeldergasse 47/41, 1160 Wien, ITÄVALTA, (AT) 4 Kunz,Christian, Naaffgasse 71, 1180 Wien, ITÄVALTA, (AT) (74) Asiamies - Ombud: Seppo Laine Oy Itämerenkatu 3 B, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Parannettu rokote immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmä sen valmistamiseksi Förbättrat vaccin för immunisering mot TBE-virusinfektioner och förfarande för dess framställning (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer (57) Tiivistelmä - Sammandraa Keksintö koskee rokotetta, joka immunisoi TBE-virusinfektioita vastaan ja joka käsittää ei-infektoivan, subviraalisen partikkelin, joka käsittää proteiinin E ja mandollisesti proteiinin prm/m, ja rokotetta, joka käsittää proteiinia E ja proteiinia prm/m koodaavan nukleiinihapon, joka on johdettu TBE-viruksesta, jolloin proteiini E on tai se koodautuu vähintään olennai- sesti täydellisessä, natiivissa muodossa. Uppfinningen avser ett vaccin för immuni- sering mot TBE-virusinfektioner, vilket vaccin omfattar en itke-infektios, subviral partikel, som omfattar protein E och eventuellt protein prm/m, och ett vaccin, som omfattar en från TBE-viruset härledd nukleinsyra, som kodar för protein E och protein prm/m, varvid protein E är resp. kodcs ätminstone väsentiigen i fullständig nativ form.

2 44,11, Parannettu rokote immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan ja menetelmä sen valmistamiseksi - Förbättrat vaccin för immunisering mot TBE-virusinfektioner och förfarande för dess framställning Keksintö koskee parannettua rokotetta, joka immunisoi TBEvirusinfektioita vastaan ja menetelmää sen valmistamiseksi. 10 TBE (Tick-Borne-Encephalitis)-virus on endeeminen monessa Euroopan maissa, entisessä Neuvostoliitossa ja Kiinassa. Sairaus muodostaa merkittävän ongelman yleisen terveyden kannalta eräissä Keski-Euroopan maissa, kuten Itävallassa, Tsekissä, Slovakiassa, Sloveniassa ja Unkarissa, joissa 15 joka vuosi rekisteröidään useita satoja sairaalatapauksia (WHO: EURO Reports and Studies, 104, 1983). TBE-virus, josta on olemassa läntinen, eurooppalainen, ja kaukoidän alatyyppi, kuuluu Flavivirussukuun, jotka viruk- 20 set ovat pallomaisia lipidivaippaisia RNA-viruksia (Monath, T.P.: Flaviviruses. In: Fields, B.N. (ed.) Virology, Raven Press, N.Y. 1990, s ). Flavivirusvirioni koostuu yleensä nukleokapsidista, joka 25 sisältää positiivisäikeisen-rna-genomin liitettynä viraaliseen kapsidi-(c)-proteiiniin. Nukleokapsidia ympäröi lipidivaippa, joka sisältää membraaniin assosioidut proteiinit E (50-60 kd) ja M (7-8 kd) (Heinz ja Roehrig in: van Regenmortel ja Neurath (ed.) "Immunochemstry of Viruses The Basis for Seradiagnosis and Vaccines. Elsevier Sciences, Amsterdam (1990), ). Pääasiallisesti vaippaproteiini E:llä on keskeinen merkitys Flavivirusten biologiassa, koska se välittää tärkeitä 35 viraalisia sisääntunkeutumisfunktioita ja laukaisee isännässä suojaavan immuunivasteen. On jo olemassa huomattava määrä tietoa koskien TBE-viruksen vaippaproteiini E:n rakennetta ja on ehdotettu rakennemalli lukuisiin biokemiallisiin ja immunologisiin tietoihin perustuen (Mandi

3 et al., J. Virol. 63 (1989), ). 2 Sairaus voidaan tehokkaasti estää rokottamalla erittäin puhtaalla formaliinilla inaktivoidulla kokovirusrokotteella 5 (Kunz et al., J. Med. Virol. 6 (1980), ), joka indusoi immuunivasteen viruksen rakenneproteiinia vastaan (Kunz, Ch. Acta leidensia 60 No.2, 1-14, 1992). Tämä rokote on osoittautunut hyväksi, mutta valmistusprosessin aikana suuria määriä infektoivia ja potentiaalisesti vaarallisia 10 virussuspensioita täytyy kuitenkin käsitellä. Siten tarvitaan laajat ja kalliit turvallisuustoimenpiteet. Virusta neutraloivien vasta-aineiden toimintakyky riippuu siitä, miten tehokkaasti ne tunnistavat viruksen pinnassa 15 olevien proteiinien natiivit rakenteet. TBE-virusten ja muiden Flavivirusten tapauksessa on tällöin kyse erityisesti proteiini E:stä (Heinz ja Mandl, APMIS, 101 (1994), ). Immunisoimalla indusoitujen mandollisimman tehokkaasti vaikuttavien vasta-aineiden saamiseksi on siten toivot- 20 tavaa, että rokote sisältää tätä proteiinia samanmuotoisena 25 kuin se on infektoivan viruksen pinnassa. Kokoviruskuollutrokotteiden haittana on, että pakollinen inaktivointimenetelmä saattaa johtaa osittain muutettuun proteiinirakenteeseen verrattuna natiiviin muotoon. Rekombinantti-DNA-tekniikka tarjoaa mandollisuuden korvata kokoviruskuollutrokotteet rekombinanttiproteiineilla, jotka sisältävät immuunivastetta indusoivien proteiinien olennaiset osat. Yksittäisten virusproteiinien geeniteknisen 30 ilmentämisen avulla ei ole varmaa, että näin muodostuneiden rekombinanttiproteiinien antigeenirakenne vastaa jokaista vastaavaa proteiinia viruksen pinnassa. TBE-virusten rekombinanttipintaproteiinien ilmentäminen 35 tunnetaan esimerkiksi julkaisusta Allison et al., Gemeinsame Jahrestagung ÖBG-ÖGGT (1993) P114. Tästä käy ilmi, että ilmennettäessä vakio-olosuhteissa proteiini E ja

4 proteiini M erittyvät erimuotoisina mm. myös ei-infektoivina subviraalisina partikkeleina. 3 Tällaisia subviraalisia partikkeleita tunnetaan TBE- 5 virusten kaukaisissa sukulaisissa, nimittäin Japanin Encephalitisviruksessa (JEV), keltakuumeviruksessa ja Dengue-viruksessa (Konishi et al., Virology 188 (1992), tai WO 92/03545). 10 Konishi et al. ovat tosin esittäneet, että tällaiset subviraaliset partikkelit, jotka on emulsifioitu Freudin täydellisellä adjuvantilla ja sisältävät koko proteiini E:n, aikaansaavat tietyn immuunivasteen hiirissä. Toisaalta osoitettiin, että C-terminaalista osittain lyhennetyllä 15 proteiini E:llä voidaan aikaansaada huomattavasti tehok- kaampi suoja Flaviviruksen infektiota vastaan kuin koko proteiini E:n avulla (WO 92/03161). Esillä olevan keksinnön tehtävänä on tarjota käytettäväksi 20 parannettua rokotetta TBE-infektioita vastaan. Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaisesti rokotteen avulla, joka immunisoi Tick-Borne-Encephalitis-virus (TBEvirus) -infektioita vastaan, ja joka käsittää ei-infektoi- 25 vaa subviraalista partikkelia, joka olennaisesti sisältää täydellisessä, natiivissa muodossa olevaa proteiini E:tä ja mandollisesti proteiini prm/m:ää, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta. Olennaista on tällöin, että proteiini E on täydellisessä, natiivissa muodossaan, koska ainoastaan 30 silloin voidaan aikaansaada tehokas suoja. Keksinnön mukai- sessa rokotteessa voitiin vahvistaa proteiini E:n natiivimuoto erilaisten analyysien avulla, nimittäin a) antigeenirakenteen analyysi käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, 35 b) kyky happoindusoituihin konformaatiomuutoksiin ja c) hemagglutinaatioaktiivisuus

5 4 5 Tosiasia, että keksinnön mukainen rokote ei koostumuksensa johdosta voi olla infektoiva, on tärkeä näkökohta rokotteen turvallisuuden kannalta verrattuna tunnettuihin rokotteisiin. Proteiini E ja mandollinen proteiini prm/m ovat edullisesti rekombinanttiproteiineja. Erityisen edullisen suoritusmuodon mukaan proteiini E on 10 johdettu TBE-viruksesta, jolloin - käyttöalueen mukaan - käytetään sekä läntistä (eurooppalaista) että kaukoidän alatyyppiä. Rokote käsittää edullisesti myös lipidikomponentin, joka edullisesti on vesikulaarisessa muodossa. 15 On osoittautunut - vastoin ammattimaailman käsitystä - että TBE-viruksesta johdettu rekombinanttiproteiini E voi tarjota riittävän immunisoinnin infektioita vastaan ainoastaan tämän ei-infektoivan subviraalisen partikkelin muodossa. Osittain lyhennettyä proteiini E-muotoa, josta, kuten 20 julkaisussa WO 92/03161 on kuvattu, C-terminaalinen memb- raaniankkuri on poistettu, ei voida käyttää tehokkaan rokotteen valmistamiseksi. Keksinnön mukainen rokote sisältää edullisesti ei-infektoivia partikkeleita, jotka olennaisesti ovat vapaita PCR:n avulla havaittavissa olevista 25 TBE-viruksesta peräisin olevista nukleiinihapoista. Tämä on esimerkiksi osoitettavissa menetelmillä, joita on kuvannut Konishi et al. Toisen näkökohdan mukaan keksintö koskee menetelmää TBE- 30 rokotteen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että tarjotaan käyttöön soluviljelyjärjestelmä, joka sisältää proteiinien prm ja E koodaussekvenssit, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta, proteiini E ilmennetään täydellisessä, natiivissa 35 muodossaan, jolloin muodostuu subviraalisia ei-infektoivia partikkeleita, jotka olennaisesti sisältävät rekombi-

6 nanttiproteiini E:tä täydellisessä, natiivissa muodossaan ja mandollisesti rekombinanttiproteiini prm/m:ää ja partikkelit kerätään ja niitä käytetään suoraan 5 immunisointiin tarkoitetun koostumuksen valmistamiseksi. Keksinnön mukaisen menetelmän suuri etu on, ettei virusten inaktivointivaihe, esimerkiksi formaliinilla, ole väittämä- 10 tön, mikä toisaalta huomattavasti parantaa rokotteen laatua (proteiini E on natiivimuodossa eikä formaliinikäsittelyssä muutetussa ainakin osittain denaturoidussa muodossa) ja toisaalta tämän rokotteen valmistus yksinkertaistuu selvästi teknisesti, koska partikkeleita voidaan suoraan käyttää 15 (siis ilman formaliinikäsittelyä) farmaseuttisen valmisteen tuottamiseksi. Erityisen edullista menetelmän toteuttamisessa on, että käytetään soluviljelyjärjestelmää, joka sisältää rekombi- 20 nanttiproteiinien prm ja E koodaussekvenssit THE-viruksesta kromosomaalisesti integroidussa muodossa. On kuitenkin olemassa myös keksinnön mukaisten partikkeleiden valmistukseen tarkoitettuja soluviljelyjärjestelmiä,.. 25 joissa käytetään viraalisia vektoreita, tai soluviljelyjär- r jestelmiä, joissa työskennellään ilman virusta, esimerkiksi 0 1 plasmidivektorin avulla. : 0.9* : * Ste 0 5 $ 0 Menetelmän edullisen suoritusmuodon mukaan sekä proteiinien 30 ilmentäminen että partikkeleiden muodostuminen tapahtuvat jatkuvasti. Toisen näkökohdan mukaan keksintö käsittää ei-infektoivien subviraalisten partikkeleiden käyttämisen rokotteen valmis- 35 tamiseksi aktiiviseen immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan, jotka partikkelit olennaisesti sisältävät täydellisessä, natiivissa muodossa olevaa proteiini E:tä ja

7 mandollisesti proteiini prm/m:ää, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta. 6 Tällöin proteiini E ja mandollinen proteiini prm/m ovat 5 edullisesti rekombinanttiproteiineja. Keksintö käsittää edelleen ei-infektoivien subviraalisten partikkeleiden lääkinnällisen käyttämisen, erityisesti anti-tbe-virusimmunoglobuliinia sisältävien valmisteiden 10 tuottamiseksi, jotka partikkelit olennaisesti sisältävät täydellisessä, natiivissa muodossa olevaa proteiini Estä ja mandollisesti proteiini prm/m:ää, jotka proteiinit on johdettu TBE-viruksesta. Myös tällöin on edullista, jos proteiini E ja mandollinen proteiini prm/m ovat rekombinantti- 15 proteiineja. Huomattiin yllättäen, että nukleiinihappoa, joka käsittää mainittuja koodaussekvenssejä, voidaan käyttää sellaisenaan immunisointiin TBE-virusinfektioita vastaan. 20 Tekniikan tason mukaan tiedetään, että paljaan DNA:n vieminen hiiriin voi aikaansaada immuunivasteen. Esimerkiksi hiiret pystyivät tuottamaan vasta-aineita ihmisen kasvuhormonia (hgh) vastaan, kun hiiriin oli injisoitu plasmidi, 25 joka sisälsi hgh:n genomikopion (Nature 356 (1992), ). On edelleen kuvattu muutamia onnistuneita "geneettisiä immunisointeja" paljaan DNA:n avulla. Tässä geneettisessä 30 immunisoinnissa annettiin DNA:ta, joka koodaa yhtä tai useampaa virusantigeeniä, jolloin vastaavat virusantigeenit syntetisoituivat in vivo, jotka virusantigeenit jokainen erikseen saivat aikaan immuunivasteen ja voivat siten sen jälkeen suojata virusinfektioita vastaan. Onnistuneen 35 suojaavan immuniteetin aikaansaanti hiirissä injektoimalla lihaksensisäisesti influenssaviruksen DNA:ta on kuvattu julkaisussa PNAS 91 (1994), s (Raz et al.).

8 7 Julkaisussa Vaccine 12 (16), (1994), s (Davis et al.) on myös kuvattu onnistunut rottien ja hiirien immunisointi hepatiitti B-viruksen (HBV)-pinta-antigeenia vastaan injektoimalla lihaksensisäisesti plasmidi-dna:ta, joka 5 sisältää HBV-pinta-antigeeniä koodaavan sekvenssin. Monet yritykset immunisoida paljaalla patogeenista antigeeniä koodaavalla DNA:lla eivät kuitenkaan onnistuneet. On esimerkiksi kuvattu (WO 93/17706) immunisointikokeita HIV:iä vastaan suoran DNA-siirron avulla kehon soluihin; onnistu- 10 nutta rokotetta ei kuitenkaan tällä menetelmällä ole vielä saatu aikaan. Vaikuttaa erityisesti siltä, että puhtaan DNA-rokotteen onnistuneen immunisoivan vaikutuksen aikaansaamiseksi on erityisen edullista - DNA:n soluun viemisen ohella - että immuunivastetta aikaansaava antigeeni esiin- 15 tyy immuunijärjestelmässä natiivimuodossaan. Natiivin muodon tai natiivin muodon ja rakenteen muodostamiseksi vaadittavan biosynteettisen muodon täsmällinen rakenne tunnetaan vain harvoille patogeeneille, joten tehokas immunisointi paljaan nukleiinihapon avulla osoittautuu 20 monessa tapauksessa erittäin vaikeaksi, ellei - johtuen puuttuvista täsmällisistä tiedoista antigeenirakenteesta - jopa mandottomaksi nykyisen tiedon valossa. Esillä olevan keksinnön puitteissa ilmeni, että immuni- 25 sointi nukleiinihapposekvenssin avulla, joka koodaa ainoas- taan olennaisen immuunivasteen TBE-infektioissa aikaansaavaa proteiini Estä, ei riitä suojaavan immuunivasteen aikaansaamiseksi sairautta vastaan. 30 Yllättäen voitiin aikaansaada onnistunut immuunivaste ainoastaan antamalla nukleiinihapposekvenssiä, joka käsittää täydellisessä, natiivissa muodossaan olevan proteiini E:n koodaussekvenssin ohella myös proteiini prm/m:n koodaussekvenssin. Osoittautui lisäksi, ettei 35 onnistunutta immunisointia voitu saada aikaan myöskään nukleiinihapolla, joka sisältää proteiini E:n koodaussekvenssin, jossa proteiini E:n ankkurialue on deletoitu.

9 8 Esillä oleva keksintö koskee siten edelleen rokotetta immunisointiin tick-borne-encephalitis-viruksen (THEviruksen) infektioita vastaan, käsittäen nukleiinihapon, joka koodaa proteiini E:n ja proteiini prm/m:n, jotka on 5 johdettu THE-viruksesta ja jotka vähintään ovat olennaisesti täydellisessä, natiivissa muodossaan. Esillä olevan keksinnön avulla pystyttiin ensimmäistä kertaa osoittamaan nukleiinihappoimmunisoinnin yleisesti 10 Flaviviruksia vastaan. Keksinnön mukainen immunisointijärjestelmä on siten periaatteessa käyttökelpoinen ei ainoastaan immunisointiin TBE-virusta vastaan, vaan - johtuen kaikkien Flavivirusten suuresta homologiasta koskien proteiini E:tä ja prm/m:ää (Chambers et al., Annual 15 Review of Microbiology, Vol. 44, (1990), s : Flavivirus Genome Organisation, Expression and Replication) - yleisesti immunisointiin Flavivirusten infektioita vastaan. THE-virusta vastaan immunisoivalle nukleiinihapporokot- 20 teelle on olennaista, että proteiini E koodautuu olennaisesti täydellisessä, natiivissa muodossaan nukleiinihaposta. Luonnollisesti esillä olevaan keksintöön kuuluvat myös nukleiinihapporokotteet, joissa esiintyy geneettisen koodin degeneraatiota, joissa ei-rakenteellisesti tärkeitä amino- 25 happokodoneja vaihtuu ja joissa on luonnollisia tai laboratoriossa aikaansaatuja mutaatioita, edellyttäen, että proteiini E:n koodaussekvenssin nukleiinihappomodifikaatiot pystyvät aikaansaamaan onnistuneen immuunivasteen. Keksinnön piiriin kuuluvat myös rokotteet, joissa on nukleiini- 30 happoja, joissa on deleetioita tai insertioita proteiini E:n koodaussekvenssissä, jotka säilyttävät proteiini E:n immunisointiin vaadittavan rakenteen antigeenisen epitooppialueen olennaisesti muuttumattomana, kunhan nämä modifikaatiot voidaan pitää johdettuna TEE-viruksen 35 sekvenssistä. Vastaavaa koskee luonnollisesti myös proteiini prm/m:n koodaussekvenssiä. Proteiini prm/m on tärkeä subviraalisen partikkelin luotettavan muodostumisen ja

10 9 erittymisen kannalta, jolloin sekvenssipoikkeamat koskien proteiini prm/m:ää eivät ole niin ratkaisevia kuin koskien proteiini Estä, kunhan vain partikkeleiden onnistunut kokoaminen voidaan taata. Nukleiinihapon luonne ei ole 5 olennainen keksinnön kannalta. Sekä RNA:ta että DNA:ta voidaan yhtä hyvin käyttää monella käyttöalueella, jolloin DNA paremman stabiilisuutensa johdosta on edullisempi kuin RNA. Nukleiinihappo voidaan valmistaa joko biologisesti tai kemiallisen synteesin avulla. 10 Proteiini E:tä koodaava nukleiinihappo on edullisesti johdettu TBE-viruksen eurooppalaisesta tai kaukoidän alatyypistä, koska nämä ovat erityisen laajasti esiintyviä alatyyppejä. 15 Erityisen edullisia nukleiinihapporokotteita ovat sellaiset, joissa nukleiinihappo on plasmidivektori. Erityisen. sopiviksi ovat osoittautuneet ne plasmidivektorit, joissa on tehokkaita promoottoreita, kuten 20 esimerkiksi HSV-, RSV-, EBV-, B-aktiini-, Adeno-, MMTV-, hsp- ja hgh-promoottori. Tehokkaat promoottorit mandollistavat tehokkaan geeniekspression. Sopivimpia vektoreita tai promoottoreita ovat plasmidista 25 pcmvb (MacGregor et al.) johdettuja plasmideja, joissa on CMV-"Immediate Early"-promoottori. Luonnollisesti keksinnön mukaisten nukleiinihapporokotteiden nukleiinihapot voivat käsittää myös muita koodaavia tai 30 ei-koodaavia sekvenssejä, erityisesti jos nukleiinihappona käytetään nukleiinihappovektoria. Esimerkkeinä muista sekvensseistä promoottoreiden ohella - mainitaan vielä markkerigeeni, muita transkription, 35 translaation ja posttranslaatiomodifikaation ym. säätäjiä. Näiden monimutkaisempien nukleiinihapporakenteiden suhteen on kuitenkin aina huomioitava, että siinä yhteydessä kun

11 10 nukleiinihappo viedään kohdesoluun ei infektoivaa virusta voi muodostua nukleiinihapon translaation avulla, eli että rokote on "kuollutrokote" ja pysyy sellaisena Keksinnön mukainen nukleiinihapporokote voi yksinkertaisimmassa muodossaan sisältää "paljaan" nukleiinihapon, mandollisesti sopivassa puskurissa. Voi tietenkin esiintyä myös muita aineosia, kuten lääkeaineteknisiä lisäaineita, kantaja-aineita tai erityisiä antotapaan liittyviä aineita. Keksinnön mukaisia nukleiinihapporokotteita annetaan edullisesti injektiona, erityisesti lihaksensisäisesti, ihonsisäisesti tai ihonalaisesti, mutta sitä voidaan antaa myös suun kautta. Annettu määrä keksinnön mukaista nukleiinihapporokotetta on riippuvainen antomuodosta ja käytetystä adjuvantista. Saman suojaavan immuunivasteen aikaansaamiseksi tarvitaan yleensä suurempi annos lihaksensisäisesti kuin ihonalaisesti. Edul- 20 Linen määrä on alueella 0,01 ng - 10 mg/annos, yleensä edullisesti alueella 1 ng 1 mg/annos. :: Keksinnön mukaisella nukleiinihapporokotteella on se olen- nainen etu, ettei tarvita soluviljelyjärjestelmää sub- 25 viraalisten partikkeleiden valmistamiseksi, vaan partik- kelit muodostuvat in vivo ja voivat siten suoraan aikaansaada immuunivasteen. Keksinnön mukaisella nukleiinihapporokotteella on lisäksi 30 se etu, että ne, verrattuna proteiinipohjaisiin rokottei- suin, omaavat suuren stabiilisuuden, erityisesti jos nukleiinihappo on DNA. Siten on mandollista varastoida rokotetta pitkiksi ajoiksi ilman suuria jäähdytyskustannuksia, jolloin aktiivisuuden olennaista alenemista ei ole 35 odotettavissa. Nukleiinihappoa erityisesti lyofilisoidussa muodossa voidaan varastoida pilaantumatta jopa huoneen lämpötilassa käytännöllisesti katsottuna rajoittamattomaksi

12 11 ajaksi. Lyofilisoidun keksinnön mukaisen nukleiinihapporokotteen rekonstituutio on paljon helpommin toteutettavissa kuin lyofilisoidun proteiiniliuoksen rekonstituutio, joka kokemuksen mukaan usein voi osoittautua ongelmalliseksi proteiinin luonteesta johtuen. Keksinnön mukaisen nukleiinihapporokotteen etuna on edelleen, verrattuna perinteisiin kuollutrokotteisiin, että immunisoiva antigeeni syntetisoituu in vivo ja johtaa 10 tehokkaan solutason immuunivasteen kehittymiseen (Science vol. 258, , s , Research News: Naked DNA Points Way to Vaccines). Edelleen toisen näkökohdan mukaan keksintö koskee 15 nukleiinihapposekvenssiä, erityisesti nukleiinihappovektoreita, käsittäen TBE-viruksesta johdettujen proteiinien E ja prm/m koko koodaussekvenssin, lääkeaineena. Toistaiseksi ei tekniikan tasossa ole mainintaa ainoastakaan onnistuneesta nukleiinihappoimmunisoinnista 20 Flaviviruksen DNA:11a. Näiden nukleiinihappojen (nukleiinihappovektoreiden) lääkinnällinen käyttö muodostaa siten yllättävän uuden käyttömandollisuuden. Keksinnössä vektorilla ymmärretään mitä tahansa nukleiinihappovehikkeliä, eli erityisesti plasmideja, viruksia tai 25 transposoneja. Tähän asti on kuvattu ainoastaan SV40:stä johdettu plasmidivektori, joka sisältää TBE-viruksesta johdettujen proteiinien prm/m ja E proteiinisekvenssin (Allison et al., 30 Virus-Genes 8 (3), (1994), s ). Näiden SV40-plasmidien yhteydessä ei kuitenkaan keskusteltu mandollisuudesta aikaansaada immunisointitehoa. Keksinnön mukaiset plasmidivektorit eroavat aikaisemmin 35 kuvatuista plasmidivektoreista erityisesti, koska ne ovat sopivia immunisointiin. Siten keksinnön mukaiset plasmidivektorit esiintyvät erityisesti käyttövalmiina

13 12 liuoksina tai lyofilisaatteina ruiskuissa tai ampulleissa. Keksinnön mukaisesti plasmidivektoreina toimii tehokkaita promoottoreita, valittuna ryhmästä CMV-, HSV-, RSV-, EBV-, 5 B-aktiini-, Adeno-, MMTV-, hsp- ja hgh-promoottori, jolloin erityisesti CMV-"Immediate Early"-promoottori on osoittautunut tehokkaaksi. Edelleen toisen näkökohdan mukaan esillä oleva keksintö 10 koskee nukleiinihapon, käsittäen TBE-viruksesta johdettujen proteiinien E ja prm/m koko koodaussekvenssin, käyttämistä rokotteen valmistamiseksi. Keksintöä valaistaan jäljempänä olevien suoritusesimerkkien 15 avulla viittaamalla kuvioihin: Kuvio 1 on ilmentämisplasmideissa käytettyjen inserttien kaaviomainen esitys. Kuvio 2 on kuviossa 1 esitettyjen rakenteiden ilmentämiseen käytetyn plasmidin psvi3 kaaviomainen esitys. Kuviossa 3a, b ja c on kuviossa 1 esitetyn 20 rakenteen SV-PEwt koko nukleotidi- ja aminohapposekvenssi. Kuviossa 4 on sekä kuviossa 1 esitettyjen rakenteiden avulla transfektoitujen että TBE-viruksen avulla infektoidun (COS/TBE) Triton X-100:11a solubilisoitujen solulysaattien immunopresipitaatio. Kuvio 5 esittää käyrää, joka osoittaa 25 proteiini E:n läsnäoloa 4-kerros-ELISA:11a määritettynä kuviossa 1 olevilla rakenteilla transfektoitujen COSsolujen viljelyalustasta. Kuviossa 6 on SV-PEwt:llä ja SV- PEst:llä transfektoitujen COS-solujen viljelyalustasta tehty immunopresipitaatio. Kuviossa 7 on COS-soluviljely- 30 alustasta tehty sedimentaatioanalyysikäyrä, jolloin COSsolut on transfektoitu SV-PEwt:llä tai SV-PEst:llä tai infektoitu TBE-viruksella. Sedimentaatiosuunta on vasemmalta oikealle. Kuviossa 8 on rsp:n (SV-PEwt) sedimentaatioanalyysi ilman Triton käsittelyä ja 0,5 %:n Triton X käsittelyn jälkeen. Sedimentaatiosuunta on vasemmalta oikealle. Kuviossa 9 on kuva puhdistetun THE-viruksen ja puhdistettujen rsp:ien SDS-PAGE-analyysista; Coomassie-

14 13 Blue-värjäys. Kuviossa 10 on vertailu COS-solujen rsp:ien ja stabiilisti transfektoidun CHO-solulinjan rsp:ien välillä. Kuvio 11 esittää 19 proteiini E-spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen reaktiivisuutta 4-kerros- 5 ELISA:lla TBE-viruksen, formaliinilla inaktivoidun TBEviruksen, rsp:n ja re*:n kanssa. Kuvio 12 esittää TBEviruksen ja rsp:n reaktiivisuuden 4-kerros-ELISA:lla monoklonaalisten vasta-aineiden B3, 12, 1C3 ja C6 kanssa ilman käsittelyä (ph 8,0) ja käsittelyn jälkeen ph-arvossa 10 6,0. Kuvio 13 esittää pe*:n reaktiivisuuden 4-kerros- ELISA:lla monoklonaalisten vasta-aineiden B3, 12, IC3 ja C6 kanssa ilman käsittelyä (ph 8,0) ja käsittelyn jälkeen pharvossa 6,0. 15 Keksintöä kuvataan tarkemmin seuraavilla esimerkeillä. 1. Partikkeleiden valmistus Valmistettiin neljä ilmentämispiasmidia, jotka sisältävät 20 joko proteiini E:n tai proteiini E:n membraaniankkurivapaan muodon pelkästään tai yhdessä prm:n kanssa (kuvio 1). 25 Esimerkin näiden plasmidien valmistuksesta on kuvannut Allison et al., Virus Genes 8 (3) (1994) s Siinä kuvattu lähtöplasmidi psv8 on esitetty kuviossa 2. Ilmentämiskloonien konstruoimiseksi käytettiin vektorina psv46. Tämä vektori on SV40:een perustuvan eukaryoottisen 30 ilmentämisvektorin psv8:n (Clontech) johdannainen, josta on poistettu 13-galaktosidaasigeeniä sisältävä insertti (MacGregor G. R. ja Caskey C. T., Nucleic Acids Res 17, 2365, 1989) pilkkomalla restriktioentsyymillä NotI. Osa polylinkkeristä, joka sijaitsee translaation lopetuskohdas- 35 ta alavirtaan, poistettiin myös restriktioentsyymeillä XbaI ja HindIII, Klenowin täydennyksellä ja ligatoitiin uudelleen.

15 Tähän vektoriin sisällytettiin PCR-tuotteita, jotka saatiin seuraavalla tavalla: Synteettisiä oligonukleotidialukkeita käytettiin cdna:n 5 monistamiseen, joka cdna vastaa joko TBE-viruksen prm+e- aluetta tai ainoastaan E-aluetta. Mandi et al. (Mandl C. W., Heinz F. X. ja Kunz C., Virology 166, , 1988) on tutkinut käytettyjä nukleotidikoordinaatteja, ja ne sisältävät TBE-genomin 20 ensimmäistä nukleotidiä (Mandl C. W., 10 Heinz F. X., Stock' E. ja Kunz C., Virology 173). 5' - Alukkeet prm+e- ja ainoastaan-e-rakenteille olivat 27- meerejä joiden sekvenssit ovat AAGCGGCCGCCATGGTTGGCTTGCAAA ja AAGCGGCCGCCATGGTTACCGTTGTGT. Kummankin sekvenssin 11 ensimmäistä nukleotidiä ovat keinotekoisia ja sisältävät 15 restriktioentsyymin NotI tunnistuskohdan (GCGGCCGC) ja sen jälkeen seuraa 16 nukleotidiä pitkä sekvenssi, joka vastaa joko nukleotidejä (SV-PE-ketju) tai (SV-Eketju). Luonnossa esiintyvää ATG-kodonia käytettiin molemmissa tapauksissa aloituskodonina sijoitettuna vastaavaan 20 geeniin nähden ylävirtaan, ja aluketta muotoiltiin siten, että ATG on sijoitettu sopivaan ympäristöön (GCCGCCATGG) tehokkaan translaatioinitiaation kannalta COS-soluissa (Kozak M., Cell 44, , 1986; Kozak M., J Mol Biol 196, , 1987). Molemmissa rakenteissa käytettiin 25 samaa 28 nukleotidiä pitkää oligonukleotidiä (ATGCGGCCGC 30 TAGTCATACC ATTCTGAG) 3'-alukkeena. Tämä aluke oli 3'- päästään komplementaarinen nukleotideille ja sisälsi 5'-päässään NotI-kohdan ja TAG-lopetuskodonin komplementin (CTA) samassa lukukehyksessä. PCR-monistuminen suoritettiin olennaisesti standardiolosuhteissa Cetus-protokollan mukaisesti (Saiki R. K., Gelfand D. H., Stoffel S., Scharf S. J., Higuchi R., Horn G. T., Mullis K. S. ja Erlich H. A., Science 239, , ). Reaktioseokset sisälsivät 50 mm KC1, 10 mm Tris-HC1, ph 8,3, 1,5 mm MgC1 2, joskus 200 pm dntp, 10 ng jokaista aluketta, 10 pl cdna-matriisin 1000-kertaista laimennosta

16 15 ja 3 E AmpliTaq-polymeraasia (Perkin Elmer Cetus) kokonaistilavuudessa 100 pl. Näytteet peitettiin 100 pl:lla parafiiniöljyä Perkin Elmerin termisessä kierrätyslaitteessa. 5 Näytteet pidettiin 6,5 min 94 C:ssa, sitten jäähdytettiin liittämislämpötilaan 40 C ennen kuin Taq-polymeraasia lisättiin. Kaikenkaikkiaan suoritettiin 35 monistussykliä. Jokainen sykli koostui 1,5 minuutista 94 C:ssa, 3 minuutista 40 C:ssa ja 7 minuutista 68 C:ssa. Näytteet puhdis- 10 tettiin uuttamalla fenolilla ja kloroformilla, saostamalla etanolilla ja uudelleenliuottamalla steriiliin kahteen kertaan tislattuun veteen. PCR-tuotteiden laatu ja määrä selvitettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja näytteet säilytettiin -20 C:ssa kunnes niitä käytettiin seuraavassa 15 kloonausvaiheessa. Polymeraasiketjureaktiota käytettiin cdna-plasmidikloonien minipankin muodostamiseksi, jotka kloonit sisältävät inserttejä, jotka vastaavat TBE-virusgenomin joko prm+e- 20 aluetta (SV-PE-ketju), nukleotidit , tai E-aluetta (SV-E-ketju), nukleotidit (Kuvio 1). Normaalisti TBE-viruksen rakenneproteiineja tuotetaan suurten polyproteiiniesiasteiden kotranslaation kautta; nyt 25 tuotiin kuitenkin translaation aloitus- ja lopetuskohdat PCR-tuotteen päihin sisällyttämällä näitä kohtia oligonukleotidialukkeisiin. Jokaiseen rakenteeseen lisättiin luonnollinen ATG-kodoni, joka sijoitettiin sopivaan ympäristöön, jotta se toimisi initiointikodonina, sisäiseen 30 signaalisekvenssiin nähden ylävirtaan, luonnollisen proses- soinnin mandollistamiseksi isännän signalaasin avulla ja oikean erittymistien aikaansaamiseksi. Vastaavalla tavalla sijoitettiin TAG-lopetuskodoni jokaiseen rakenteeseen signalaasi-pilkkomiskohtaan nähden alavirtaan, joka pilkko- 35 miskohta muodostaa proteiini E:n karboksipään. Päihin sisällytettiin myös restriktioentsyymin NotI tunnistuskohdat PCR-tuotteiden seuraavaksi suoritettavan kloonauksen

17 16 helpottamiseksi. PCR-DNA:t katkaistiin Noti:llä ja ligatoitiin plasmidivektorin psv46 NotI-kloonauskohtaan, mikä mandollisti sen, 5 että oikein insertoidut geenit ilmentyivät aikaisen SV40- promoottorin ohjauksen alaisena (MacGregor G.R. ja Caskey C. T., Nucleic Acids Res 17, 2365, 1989). Vektori tarjosi myös käyttöön polyadenylointisignaalin tehokasta ilmentämistä varten ja SV40-replikointilähteen rekombinantti- 10 plasmidien replikaation mandollistamiseksi transfektoiduissa COS-soluissa, jotka konstitutiivisesti ilmentävät suuren SV40-T-antigeenin (Gluzman Y., Cell 23, , 1981). 15 Ligatointiseosta käytettiin E. colin HB 101 transformaatioon ja yksittäisiä ampicilliiniresistenttejä pesäkkeitä eristettiin, jotka vastaavat yksittäisiä klooneja. Inserttien orientoituminen jokaisessa plasmidissa määritettiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja agaroosigeelielektro- 20 foreesilla. Oikein orientoutuneita inserttejä sisältävät kloonit säilytettiin lisäanalysointia varten. Oikein orientoutuneita insertteja sisältävät plasmidit identifioitiin restriktioanalyysin avulla ja puhdistettiin 25 CsCl-gradienttisentrifugoinnin avulla. Jokaisesta plasmidirakenteesta käytettiin yksittäisestä preparaatista puhdistettua kaksisäikeistä plasmidi-dna:ta DNA-sekvenssimääritystä varten. Sekvensointireaktiot suoni- 30 tettiin Perkin-Elmerin termisessä kierrätyslaitteessa käyt- tämällä TBE-spesifisiä alukkeita, AmpliTaq-polymeraasia (Perkin Elmer Cetus) ja fluoresoivalla väriaineella merkittyjä dideoksiterminaattoreita valmistajan ohjeiden mukaisesti (Applied Biosystems). Sekvensointireaktion tuotteet 35 analysoitiin Applied Biosystemsin automaattisella DNA- sekvensointilaitteella 373A.

18 PCR:llä tuotettujen mutaatioiden analysointi 17 Valittiin 13 yksittäistä E. coli-kloonia, jotka sisältävät SV-PE-sarjan plasmideja, ja 9, jotka sisältävät SV-E-sarjan 5 plasmideja, kloonattujen inserttien tarkan analyysin suorittamiseksi ja Taq-polymeraasilla tapahtuvan mutatoinnin tehokkuuden arvioimiseksi. Plasmidi-DNA jokaisesta kloonista puhdistettiin ja analysoitiin kloonattujen inserttien molemmat säikeet täydellisellä sekvensoinnilla. 10 Sitten verrattiin cdna-sekvenssejä vastaaviin emokantana toimivan villityypin TBE-viruskannan Neudärfl'n RNAsekvensseihin (Mandl C. W., Heinz F. X. ja Kunz C., Virology 166, , 1988). 15 Jokaisen plasmidikloonin nukleotidisekvenssissä oli odotetusti useita eroja verrattuna villityypin TBE-virussekvenssuin. Nämä muutokset olivat muutamin poikkeuksin (ks. jäljempänä) yleensä yksittäismutaatioita, joita ilmeisesti muodostui PCR-monistuksen aikana ja jotka oli löydettävissä 20 ainoastaan yksittäisissä klooneissa.

19 18 Taulukko 1. Yhteenveto PCR:llä tuotetuista mutaatioista Nukleotidi- Aminohappomuutokset b Klooni muutokset' prm 5 SV-PE G->A 1122 G->C Gln 50->His 1395 C->T T->C Val 352->Ala 2480 A->G T->A Val 24->G1u 1080 G-A 1153 T-->C T-C Ser 66->Pro 1690 A->G Arg 240- Gly 2458 G-del Ala 495->lukukehyksen T-C Cys158->Arg siirtymä 976 C->T Arg 2->Cys A- G Lys 64- Arg 1679 A->G Asn 236->Ser 1889 T->A Met 306->Lys 04 d 1434 C->T 2275 A->T Lys 435->lopetus G->A 05 c 701 T->C Leu 74->Pro 1488 C->A 1492 T->C 1893 T->A Cys 307->lopetus T-C Leu101->Pro 865 A->G Lys129->Glu 1002 C->T 1972 G-A Gly 334->Arg 07c 1327 G->del Ala 119->luku.siir G->A Ala 426->Thr T->A Leu 74- Gln 2092 A->G Met 374->Val 2124 T->C T- C' A- ' A- G 2086 A->G Ile 372->Val 2142 T->C 2290 G->A Val 440->Ile A->G SV-PE 10 c 1625 A->G Asp 218- Gly 2475 T->C 11' 50 12' 1203 G->A Met 77->Ile 13' 1366 T->C Tyr 132->His 1381 A->G Ile 137->Val 1728 G->A Met 252- Ile 2134 C->T

20 Nukleotidi- Klooni muutokset' Aminohappomuutokset b prm 5 SV-E 01 d 1239 C->T A->T Met 41->leu 2301 C->T G->A Val 117->Ile 1688 A->G Glu 239->Gly 1717 G->A Ala 249->Thr 2053 A->G Asn 361->Asp 2092 A->G Met 374->Val T->C 2438 C->T Ala 489->Val T->C (Leu153->Pro) f 973 T->C Ser 1->Pro 2401 T->G Ser 477->Ala C->T 1151 G->A Cys 60->Tyr 1364 T->C Val 131->Ala 1567 A->G Ile 199->Val 2045 T->C Ile 358->Thr T->C 1694 T->C Leu 241->Pro 1794 A->G 2159 G->T Gly 396->Val A->G A->G A->del` a Nukleotidikoordinaatit koskien koko TBE-genomia 35 b Aminohappokoordinaatit koskien prm tai E Aminohappomuuutokset NS1- tai C-geenissä 6 SV-PEO4 uudelleennimitetty "SV-PEst":ksi ja SV-E01 "SV- Ewt":ksi e Muita mutaatioita kuin PCR:llä aikaansaatuja ei ole 40 esitetty (vrt. teksti) f Tässä rakenteessa oli vain prm:n C-terminaalinen osa läsnä 45 Kuten taulukossa 1 on esitetty 22 sekvensoidussa insertissä (yhteensä emäsparia) oli 71 yksittäistä nukleotidimuutosta, joita voitiin lukea Taq-polymeraasin virheiksi. Näistä muutoksista 42 (59 %) johti substituutioihin ennus- 50 tetussa aminohapposekvenssissä ja 3 johti deleetioihin, jotka aiheuttivat lukukehyksen siirtymisen (taulukko 2).

21 Taulukko 2. PCR-mutaatioiden yleisyys 20 Esiintyminen' Yleisyys Emäsparin muutokset kpl(%) (per emäspari) 5 G/C->A/T 20 (28 %) 4,59 x 10" G/C->T/A 2 (2,8 %) 4,59 x 10-5 G/C->C/G 1 (1,4 %) 2,30 x 10-5 A/T->G/C 37 (52 %) 8,50 x 10" 10 A/T->C/G 1 (1,4 %) 2,30 x 10-5 A/T->T/A 7 (9,9 %) 1,61 x 10" G/C deleetio 2 (2,8 %) 4,59 x 10-5 A/T deleetio 1 (1,4 %) 2,30 x 10-5 Siirtymiä 57 (80 %) 1,31 x Transversioita 11 (15 %) 2,53 x 10" Kaikki mutaatiot 71 (100 %) 1,63 x 10-3 Aminohapposubstituut. 42 (59 %) 9,64 x 10" Hiljaisia mutaatioita 24 (34 %) 5,51 x 10" Lukukehyksen siirtymiä 3 (4,2 %) 6,89 x 10-5 Lopetuskodoneja 2 (2,8 %) 4,59 x '43549 emäsparia sekvensoitiin 25 Mutaatioiden jakauma oli kääntynyt voimakkaasti A/T->G/Cja G/C->A/T-siirtymämutaatioiden eduksi, kuten jo aikaisemmin on todettu (Dunning A. M., Talmudd P. ja Humphries S. E., Nucleic Acids Res 16, 10393, 1988; Chen J., Sahota A., Stambrook P. J. ja Tischfield J. A., Mutat Res 249, , 1991; Cadwell R. C. ja Joyce G. F., PCR Methods Applic 2, 28-33, 1992). Kokonaismutaatioiden yleisyys oli 1,63 x 10-3 per emäspari 35-syklisessä monistuksessa (4,7 x 10-5 per emäspari ja sykli), mikä vastaa Taq-polymeraasin virheiden yleisyydestä julkistettuja arvoja (15,32). Keski- 35 määräinen aminohapposubstituutiomäärä oli 0,46 per geeni prm:lle (164 aminohappoa pitkä) ja 1,59 E:lle (496 aminohappoa pitkä). Hiljainen mutaatio nukleotidin 930 kohdalla esiintyi 40 kaikissa klooneissa ja on oletettu, että se on muodostunut luonnollisena mutaationa viruskasvatuksen aikana. Lisäksi todettiin, että SV-PE-sarjan viidessä kloonissa, SV-PE05, SV-PE07, SV - PE11, SV-PE12 ja SV-PE13, oli seitsemän yhteistä identtistä mutaatiota nukleotideissä 849, 1285,

22 , 1404, 1909, 2247 ja Kloonissa SV-PE10 oli kolme näistä mutaatioista (1909, 2247 ja 2255), mutta muissa SV- PE-klooneissa ei ollut mutaatioita näissä kohdissa eikä yhdessäkään SV-E-kloonissa. Eräs näistä muutoksista, 5 nukleotidin deleetio kohdassa 1346, aiheuttaa lukukehyksen siirtymisen E-geenin kodonissa 125, ja on siten odotettavissa, että tästä muodostunut E-proteiini ei ole toimiva. Koska klooni, jossa on eräs näistä seitsemästä mutaatiosta, saatiin riippumatta siitä, mistä erillisistä cdna- ja PCR- 10 preparaateista se valmistettiin (ei esitetty tuloksia), 15 vaikuttaa siltä, että nämä variantit esiintyivät jo virus- RNA-populaatiossa ennen monistumista. Näitä erikoisia mutaatioita ei siten ole sisällytetty PCR:llä saatujen mutaatioiden analyyseihin. Rakenteita, jotka koodaavat villityypin ja deletoituja E- proteiineja Yksittäisiä aminohappomuutoksia koodaavien kloonien lisäksi 20 olimme myös kiinnostuneita prm + E- ja ainoastaan--e-rakenteiden valmistuksesta, jotka rakenteet koodaavat villityypin ja deletoituja proteiineja. Koska kuitenkin kaikki PCR:llä saaduissa SV-PE-sarjan klooneissa oli mutaatioita, jotka johtaisivat aminohappomuutoksiin, käytettiin suoraa 25 subkloonausta villityyppi-rakenteen valmistamiseksi, joka rakenne kodaa modifioimattomia prm- ja E-proteiineja sekä ainoastaan-e-rakenteen deletoitua muotoa. Plasmidin SV-PE04 DNA-sekvenssissä oli kanden hiljaisen 30 mutaation lisäksi A/T-substituutio nukleotidissä 2275, jolloin AAC-kodoni, joka vastaa proteiini E:n lysiiniä 435, muuttui TAG-lopetuskodoniksi (taulukko 1). On siten ennustettu, että SV-PEO4 koodaa villityyppi-prm-proteiinia ja deletoitua E-proteiinia, josta karboksipään 61 aminohappo- 35 jäännöstä puuttuu, joka puuttuva osa sisältää oletetun membraaniin kiinnittyvän alueen (Mandi C. W., Guirakhoo F., Holzmann H., Heinz F. X. ja Kunz C., Virol 63, ,

23 ). Osoittautui, että plasmidissa SV-E01, josta suurin osa prm-geenistä puuttuu, on vain hiljainen mutaatio E- geenissä, jolloin se koodaa villityyppi-e-proteiinia. 5 Villityypin aminohapposekvenssin koko pituuden käsittävän prm + E-rakenteen ja lopetuskodonin nukleotidikohdassa 2275 omaavan, ilman prm:ää olevan ainoastaan-e-rakenteen luomiseksi siirrettiin restriktiofragmentteja SV-PE04:stä ja SV- E01:stä (tästä lähtien nimetty SV-PEst:ksi ja SV-Ewt:ksi). 10 Tätä tarkoitusta varten käytettiin kahta restriktio- entsyymin CfrlOI katkaisukohtaa, toinen nukleotidien 960 ja 961 välissä, lähellä prm- ja E-geenien rajaa, ja toinen vektorin ampicilliiniresistenssigeenissä. Toinen aikaansaaduista plasmidirakenteista, SV-PEwt, sisältää villityyp- 15 pi-prm-geenin SV-PEst:stä ja villityyppi-e-geenin SV- Ewt:stä, kun toinen, SV-Est, josta puuttuu prm-geeni, sisältää lopetuskodonin sisältävän E-geenin SV-PEst:stä. Nämä muutokset vahvistettiin sekvensoimalla molempien plasmidien insertit. Näiden rakenteiden avulla saatiin 20 neljä ilmentämisplasmidia, joiden avulla voitiin verrata ilmennettyjen E-proteiinien muokkaamista ja rakenteita, joka vertailuproteiini on saatu villityyppi-rakenteesta (SV-PEwt) ja vertailun kohteena olevat proteiinit, ovat proteiineja, joista puuttuu prm (SV-Ewt), E-ankkurialue 25 (SV-PEst) tai molemmat (SV-Est). PEwt-insertin koko sekvenssi on esitetty kuviossa 3a, b ja c. 30 COS-soluja transfektoitiin sopivilla piasmideilla ja rekombinanttiproteiinien ilmentyminen analysoitiin seuraavalla tavalla: 35 DNA-transfektio COS-1-solut (Gluzman Y., Cell 23, , 1981) pidettiin COS-alustassa, joka koostuu alustasta Dulbecco's MEM

24 23 (Gibco-BRL) täydennettynä 10 %:11a fetaalista naudanseerumia, penisilliinillä (100 E/ml) ja streptomysiinillä (100 pg/ml) 37 C:ssa ja 5 %:ssa CO 2. 5 Kloonattuja THE-geenejä sisältävät plasmidit tuotiin COS-1- soluihin liposomivälitteisellä transfektiolla käyttämällä modifikaatiota Felgner et al:n menetelmästä (Felgner P. L., Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H. W., Wenz M., Northrop J. P., Ringold G. M. ja Danielsen M., Proc Natl 10 Acad Sci USA 84, , 1987) BioRad Gene Pulserlaitteen avulla. Lipofectin-reagenssi (Gibco-BRL) laimennettiin pitoisuuteen 20 pg/ml Opti-MEM-I-puutteiseen seerumialustaan (Gibco-BRL) ja sekoitettiin vastaavaan tilavuuteen OptiMEM-I:tä, joka sisältää 8 pg/ml kyseessä 15 olevaa plasmidi-dna:ta. Transfektointiin käytettiin 5 pg Lipofektiniä ja 2 pg plasmidi-dna:ta. Seoksen annettiin seistä 15 min huoneenlämmössä DNA-Lipofectin-kompleksien muodostamiseksi ja 0,5 ml tätä seosta lisättiin soluviljelylevyn (Nunc) jokaiseen 24 syvennykseen, joissa oli 20 soluja, jotka oli pesty kaksi kertaa 1 ml:11a OptiMEM kasvualustan seerumijäänteiden poistamiseksi. Solut inkuboitiin DNA-Lipofectin-seoksen kanssa 5 h 37 C:ssa, 5 %:ssa CO 2, jonka jälkeen lisättiin 1 ml täydellistä COSalustaa ja inkubointia jatkettiin yön yli. 24 h trans- 25 fektion jälkeen alusta poistettiin ja korvattiin uudella COS-alustalla, ja inkubaatiota jatkettiin n. 46 h transfektion jälkeen, jolloin solut joko preparoitiin immunofluoresenssianalyysia varten tai liuotettiin intrasellulaaristen antigeenien analysoimiseksi ELISA:11a. 30 Menetelmä COS-solujen infektoimiseksi TBE-viruksella immunofluoresenssin vertailunäytteen tekemiseksi suoritettiin olennaisesti samalla tavalla kuin transfektointi, kuitenkin sillä erolla, että plasmidi-dna:n ja Lipofectinin 35 sijasta käytettiin TBE-virusta hiiri-imettäväisen aivosuspension muodossa, joka oli laimennettu 100 kertaa Opti- MEM-I-alustaan.

25 Ilmennettyjen proteiinien analysointi 24 a. Solulysaattien immunopresipitaatio 5 Transfektoidut solut merkittiin 35S-kysteiinillä, solu- bilisoitiin Triton X-100:11a ja tehtiin immunopresipitaatio polyklonaalisen kaniseerumin kanssa, joka oli spesifinen TBE-viruksen proteiineille E ja prm. Kuten kuviosta 4 nähdään, rakenteiden SV-PEwt ja SV-Ewt ilmentäminen johti 10 autenttisen kokoisen proteiinin E syntetisointiin. SV- PEst:stä ja SV-Est:stä syntetisoidut proteiinit olivat, kuten odotettavissa oli, hieman pienempiä kuin villityyppi- E-proteiini johtuen niiden lyhennetystä C-terminaalista. 15 b. Rekombinanttiproteiinin erityksen analysoiminen solujen kasvatusalustasta Proteiini E:n läsnäolo transfektoitujen solujen kasvatusalustasta analysoitiin kvantitatiivisesti päivinä transfektion jälkeen käyttämällä neljäkerroksista ELISA:a, kuten Heinz et al., 3. Biol. Stand. (1986), 14: on kuvannut. Kuviossa 5 annetut tulokset osoittavat, että vain ne rakenteet, jotka myös ilmentävät prm-proteiinia, johtivat proteiini E:n erittymiseen. Kasvualustan immunopresi- 25 pitaatio (kuvio 6) vahvisti sen, että eristetyt proteiinit olivat samankokoisia vastaavien solunsisäisten proteiinien kanssa (vrt, kuvio 4). Rekombinanttiproteiinien erittyminen on valtavaksi hyödyksi 30 tuotantoa ajatellen, koska silloin voidaan välttää solujen rikkominen ja kontaminoivan solumateriaalin poistaminen kalutun proteiinin saamiseksi. Sopivissa olosuhteissa tämä mandollistaa myös rekombinanttiproteiinin jatkuvan saannin soluja rikkomatta. 35

26 c. Eristyneiden rekombinanttiproteiinien karakterisointi 25 Kuviossa 5 esitetyt kasvualustat sakkaroosi-tiheysgradientti-vyöhykesentrifugoitiin käyttämällä (paino/paino) sakkaroosigradienttia ja Beckmanin SW-40- roottoria. Sentrifugointi suoritettiin U/min ja 4 C:ssa 100 min. Gradientit fraktioitiin ja proteiini E määritettiin kvantitatiivisesti jokaisesta fraktiosta neljäkerroksisella ELISA:lla (ks. Heinz et al., J. Biol. 10 Stand. (1986) 14: ). Viruksella infektoitujen solujen kasvualustaa käytettiin kontrollina, joka antoi kaksi proteiini E-pitoista piikkiä (kuvio 7), joista toinen vastaa koko virusta ja toinen vastaa nk. ei-infektoivaa "hitaasti sedimentoivaa hemagglutiniinia" ("slowly- 15 sedimenting hemagglutinin" (SHA)) (ks. Russel et al. (1980), Chemical and antigenic structure of Flaviviruses. In: Schlesinger, R. W. (ed.) The Togaviruses, , Academic Press). SV-PEwt:llä transfektoitujen solujen kasvatusalusta sisälsi E:n partikulaarisen muodon, jonka 20 sedimentaationopeus vastaa viraalisen SHA:n nopeutta, kun taas C-terminaalista lyhennetty proteiini E, joka oli saatu SV-PEst:stä, ei muodostanut stabiilia partikkelia ja jäi gradientin yläpuolelle. 25 SV-PEwt:stä saatua partikulaarista muotoa kutsuttiin "rekombinanttiseksi subviraaliksi partikkeliksi" (rsp) ja SV-PEst:stä saatua liukoista muotoa "rekombinantti-e * :ksi" (re * ) 30 Käsittelemällä rsp:tä 0,5 %:11a Triton X-100 partikkelit dissosioituivat, kuten käy ilmi kuvion 8 sedimentaatio- analyysista, mikä viittaa lipidimembraanin läsnäoloon. 35 rsp:n ja re * :n preparointi a. rsp:n puhdistus

27 26 SV-PEwt:llä transfektoitujen COS-solujen kasvualusta selkeytettiin sentrifugoimalla 30 min U/min 4 C:ssa Sorvallin korkeanopeussentrifugilla ja partikkelit saatiin sitten sentrifugoimalla 120 min U/min 4 C:ssa, 5 jolloin käytettiin Beckmanin Ti45-roottoria. rsp-pitoinen pelletti-fraktio resuspendoitiin TAN-puskuriin, ph 8,0 ja vietiin 5-20 sakkaroosigradienttiin, joka oli tehty samaan puskuriin. Sentrifugoimisen jälkeen Beckmanin SW40- roottorissa (90 min, U/min ja 4 C) näytteet frak- 10 tioitiin, ja piikin muodostavat fraktiot identifioitiin testaamalla HA-aktiivisuus (Clarke ja Casals, 1958, Aver. J. Trop. Med. Hyg, 7: ). Vyöhykegradientista saadut piikki-fraktiot puhdistettiin edelleen tasapaino-sentrifugoimalla (35000 U/min, 4 C, yön yli), ja fraktiot 15 identifioitiin taas HA:n avulla. Proteiini E:n kokonaismäärä määritettiin kvantitatiivisesti 4-kerroksisella ELISA:lla ja puhtaus määritettiin SDS-PAGE:n avulla käyttämällä Coomassie-Blue-värjäystä (kuvio 9). 20 b. re * :n preparointi 25 SV-PEst:llä transfektoitujen COS-solujen seerumivapaita kasvatusalustoja selkeytettiin kuten yllä on kuvattu ja konsentroitiin n. 15-kertaiseksi ultrasuodattamalla. Kromosomaalisesti integroitua prm- ja E-geeniä sisältävien solulinjojen valmistus Stabiilisti transfektoitujen rsp:itä tuottavien solujen 30 valmistamiseksi käytettiin dihydrofolaattireduktaasi (DHFR)-selektiojärjestelmää (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.) sekä jokaista rakennetta, joka sisältää proteiinien prm ja E koko geenit (kuvio 1) ja joka johtaa rsp:iden syntetisointiin ja erittymiseen. DHFR- 35 geenin siirto tapahtui plasmidin psv2-dhfr (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1, , 1981) avulla, prm- ja E- geenien siirto tapahtui plasmidin CMV-PEwt avulla, joka oli

28 27 valmistettu uudelleenkloonaamalla plasmidista SV-PEwt saatu insertti plasmidissa pcmvf3 (Clontech). DHFR-puutteellista hamsterisolulinjaa CflO-DG44 (Som. Cell. 5 Moi. Get. 12, , 1986) kasvatettiin HAM:n F12-alus- tassa, johon oli lisätty 10 % fetaalista vasikanseerumia (FVS) ja transfektoitiin pcmv-pewt:llä ja psv2-dhfr:llä suhteessa 20:1 elektroporaatiolla käyttämällä BioRad Gene Pulser-laitetta. Sen jälkeen transfektoidut solut kasvatet- 10 tiin edelleen 2 päivää HAM:n F12-alustassa 10 % FVS, trypsinisoitiin, laimennettiin paljon ja siirrettiin selektioalustaan (MEM-a ilman ribo- ja deoksiribonukleotidejä + 10 % dialysoitua FVS) Petrimaljoihin yksittäisten DHFR ja ilmentävien solukloonien eristämiseksi. Noin päivän jälkeen siirrettiin mikroskoopissa näkyviä yksit- 20 täisiä solupesäkkeitä pieniin soluviljelyastioihin ja kasvatettiin edelleen. Ne solukloonit, jotka tuottavat FSME-spesifistä antigeeniä, identifioitiin analysoimalla solukasvatusalustaa ELISA:11a. Erästä näistä soluklooneista (CHO-37) käytettiin tuötta- miensa rsp:ien eristämiseen ja karakterisointiin. Sen lisäksi solut kasvatettiin yllä mainitussa selektioalustassa ja rsp:t puhdistettiin siitä samalla tavalla kuin 25 COS-soluista eristettyjen rsp:ien osalta on kuvattu. Sakkaroosi-tiheysgradienttisentrifugoinnin tulos on esitetty kuviossa 10, jossa on verrattu COS-soluista saatuja rsp:itä stabiilisti transfektoidusta solulinjasta CH0-37 saatuihin rsp:hin. Käytetyt sentrifugointiolosuhteet 30 olivat seuraavat: % sakkaroosi, Beckman TI-40- roottori, UpM yli yön. Sentrifugoinnin jälkeen fraktioitiin gradientit ja yksittäiset fraktiot analysoi- tiin hemagglutinaatiokokeella ja ELISA:lla FSME-virusspesifisellä antigeenillä. Kuten kuviosta ilmenee, 35 preparaattien sedimentaatioreaktiot eivät spesifisen tiheyden eivätkä spesifisen hemagglutinaatioaktiivisuuden suhteen eronneet toisistaan.

29 2. Karakterisointi verrattuna natiiviin proteiinirakenteeseen 28 Tällä tavalla valmistetut preparaatit analysoitiin 5 seuraavalla tavalla: a. antigeenirakenteen analyysi käyttämällä monoklonaalisia vasta-aineita, b. kyky happoindusoituihin konformaatiomuutoksiin 10 c. hemagglutinaatioaktiivisuus a. Anticieenirakenne Formaliinilla inaktivoidun kokoviruksen antigeenirakennetta 15 verrattiin natiivin infektoivan viruksen antigeenirakenteeseen käyttämällä 19 spesifistä vasta-ainetta proteiini Estä vastaan (Mandl et el. 1989, J. Virol. 63: ; omat kokeet). Jokaisen yksittäisen monoklonaalisen vasta-aineen reaktiivisuus analysoitiin yllä olevien preparaattien 20 avulla 4-kerroksisen ELISA:n avulla kuten Heinz et al. on kuvannut J. Biol. Stand. (1986), 14: Tällöin käytettiin kaikista antigeenipreparaateista proteiini E:n suhteen ennestään määritettyä vakiopitoisuutta 1 pg/ml ja käytettin sellaista vasta-aineen laimennosta, jossa on 25 jokaista monoklonaalista vasta-ainetta sen verran, että saadaan natiivin infektoivan viruksen kanssa ekstinktioarvo, joka on alueella 0,5-1,6. Kuten kuviosta 11 käy ilmi, monoklonaalisten vasta-aineiden 30 reaktiomallit rsp:n ja infektoivan viruksen kanssa ovat käytännöllisesti katsoen identtiset, joten on oletettavaa, että proteiini E esiintyy samassa natiivissa muodossa rsp:issä kuin infektoivassa viruksessa. 35 Formaliini-inaktivointi vaikuttaa sitä vastoin merkittä- västi antigeenirakenteeseen, jossa myös esiintyy epitooppeja, jotka sitovat neutraloivia vasta-aineita. Tämä koskee

30 sekä neutraloivaa monoklonaalista vasta-ainetta i2 (Mandl et al., 1989, J. Virol. 63: ), jonka epitooppi tuhoutuu formaliinikäsittelyssä, että myös epitooppeja 29 domeeni A:n ja domeeni B:n alueella (Mandl et al., 1989, J. 5 Virol. 63: ), joiden reaktiivisuus on ainakin pienentynyt. Tämä analyysi osoittaa myös sen, että E * :n rakenne ei ollenkaan vastaa viruspinnassa olevaa natiivia proteiini E:tä. 10 b. Happoindusoidut konformaatiomuutokset TBE-virus tunkeutuu soluihin reseptorivälitteisen endosytoosin avulla ja pääsee siten endosomeihin, joiden hapan ph (<6,4) indusoi spesifisen konformaatiomuutoksen, joka 15 vaaditaan virusmembraanin ja endosomimembraanin fuusioimiseksi ja siten viruksen infektiivisyyden aikaansaamiseksi. Nämä rakenteelliset muutokset voivat olla seurausta siitä, että yksittäisten monoklonaalisten vasta-aineiden reaktiivisuus muuttuu (Heinz et al., 1994, Virology 198: ) ja vaikuttaa mm. epitooppeihin i2 ja IC3 (reaktiivisuuden voimakas lasku) ja C6 (voimistunut reaktiivisuus), mutta ei epitooppiin B3. Nämä muutokset ovat olennaisia proteiini E:n toiminnalle. 25 Kyky reagoida esitetyllä tavalla happamassa ph:ssa on siten myös merkki siitä onko proteiini E natiivissa muodossa, joka vastaa infektoivaa virusta. rsp:tä, re * :tä ja infektoivaa virusta sisältävät preparaatit trietanoliamiinipuskurissa ph 8,0 sekoitettiin puskuriin, jossa oli 0,05 m 30 mes, 0,1 m NaC1 ja 0,1 % naudanalbumiinia, siten että saatiin ph-arvo 6,0, inkuboitiin 10 min 37 C:ssa ja trietanoliamiinin avulla säädettiin sitten ph-arvo uudestaan 8,0:ksi. Sitten analysoitiin näiden preparaattien reaktiivisuus ennen inkubointia ja inkuboinnin jälkeen happa- 35 massa ph:ssa monoklonaalisten vasta-aineiden B3, i2, IC3 ja C6 kanssa 4-kerroksisen ELISA:n avulla kuten kohdassa "Antigeenirakenne" on kuvattu. Tulokset on esitetty