Näytteiden inaktivointi tutkimusanalyyseihin

Koko: px

Aloita esitys sivulta:

Download "Näytteiden inaktivointi tutkimusanalyyseihin"

Hannes Hovinen
4 vuotta sitten
Katselukertoja:

1 Näytteiden inaktivointi tutkimusanalyyseihin Pamela Österlund Pamela Österlund 1

2 Pamela Österlund 2

3 Mikrobien Inaktivaatiomenetelmiä Kemialliset yhdisteet Klooriyhdisteet Alkoholit Formaldehydi Hapot, peroksidiyhdisteet, fenoli Kvartaariset ammoniumyhdisteet, detergentit Fysikaaliset menetelmät Lämpö Paine Säteily Kuivuminen Pamela Österlund 3

4 Haasteita Näytemateriaalin säilyminen tutkittavassa muodossa Inaktivaatiomenetelmän tehokkuuden varmistaminen Jokaiselle näyte-erälle SOP ja pistotarkastus Erilaiset ja eripitoiset näytemateriaalit Carry-overs näyteputkien/astioiden mukana Virheiden poissulkeminen Tuplavarmistus Pamela Österlund 4

5 Pamela Österlund 5

6 Pamela Österlund 6

7 Näytteiden siirto BSL-3:sta alemmalle turvatasolle THL:ssä Inaktivaatiomenetelmät testataan mikrobikohtainen Usein käytettävistä inaktivaatiomenetelmistä laaditaan SOP Näytemateriaalikohtainen Nestemäiset näytteet siirretään puhtaisiin putkiin ennen ja jälkeen ulostuonnin Adherentit näytteet (mikrsokooppilasit, platat) käsitellään kiinnityspohjineen (esim upotetaan fiksatiiviin) Kaksinkertainen riskinhallinta Kaksi erillistä inaktivaatiota Yksi inaktivaatio + BSL-2 suojaus Pamela Österlund 7

8 Inaktivaatiomenetelmän testaus: Koejärjestely Infektoidut solut tai virusnäyte Pamela Österlund 8

9 Pamela Österlund 9

10 Inaktivaatiomenetelmän testaus: Koejärjestely Infektoidut solut tai virusnäyte Inaktivaatiokäsittely, (kemikaalien pesu) Käsiteltyjen näytteiden laimennussarja ja inkubaatio kasvatussoluilla (jatkokasvatus) Mikroskopointi CPE, TCID50, PFU Solujen totrna keräys Suppinäytteiden keräys vrna qpcr Virus titraus HA TCID50 PFU vrna qpcr Pamela Österlund 10

UV-käsittelyn testaus Influenssavirukselle UV kroslinkkaa proteiineja ja vaurioittaa DNA/RNAta 1. testi: 1x0,12J ja 3x0,12J ja 5x0,12J Ei mitattavaa PFU/ml arvoa 2.

11 UV-käsittelyn testaus Influenssavirukselle UV kroslinkkaa proteiineja ja vaurioittaa DNA/RNAta 1. testi: 1x0,12J ja 3x0,12J ja 5x0,12J Ei mitattavaa PFU/ml arvoa 2. testi: 0,01J; 0,03J; 0,05J; 0,07J; 0,09J; 0,15J ja 0,3J 0,01J: 3,8*10^4 PFU/ml 0,03-0,3J: Ei mitattavaa PFU/ml arvoa IAV vrna Varmistus: viruksen replikaation tarkastus qpcr:llä Relative viral RNA min 2h 4h 8h 1 0 J 0,03 J 0,05 J 0,1 J Pamela Österlund 11

12 UV-käsittelyn testaus Influenssavirukselle UV-käsittely 0,6J Ei mitattavaa PFU/ml arvoa eikä replikoituvaa virusrnata Konsentraatiolla merkitystä käsittelyn tehokkuuteen, optimointi kesken Pamela Österlund 12

13 Inaktivaatiomenetelmän testaus: Koejärjestely Infektoidut solut tai virusnäyte Inaktivaatiokäsittely, (kemikaalien pesu) Käsiteltyjen näytteiden laimennussarja ja inkubaatio kasvatussoluilla (jatkokasvatus) Mikroskopointi CPE, TCID50, PFU Solujen totrna keräys Suppinäytteiden keräys vrna qpcr Virus titraus HA TCID50 PFU vrna qpcr Pamela Österlund 13

14 RNA-lyysipuskurin testaus H5N1-infektoiduille soluille Guanidiini-isothiosyanaati (RLT puskuri, Qiagen) denaturoi proteiineja Beta-MerkaptoEtOH pilkkoo S-S -soltoja 0,0# 5,0# 10,0# 15,0# ennen# pesua,# päivä#1# Solut#H5N1#infektoitu,#RLT#käsi7ely# pesun# jälkeen,# päivä#1# päivä#2# päivä#3# päivä#4# päivä#8# päivä#11# modc#infek;olla,#rlt,#näyteaä#100µl# modcinfek;olla,#rlt,#näyteaä#30µl# modc#infek;olla,#rlt,#näyteaä#5µl# Ct# 20,0# 25,0# 30,0# 35,0# 40,0# modc#infek;olla,#näyteaä#100µl# modc#ilman#infek;ota#=#ctrl,#näyteaä# 100µl# Siirto uusille soluille Pamela Österlund 14

15 RNA-lyysipuskurin testaus H5N1-infektoiduille soluille H5#vRNA Ct#values Dilution 1:10 1:33 1:200 Condition#of#cells HA Untreated#cell#control from#inoculum 34,85 after#inoculation 35,43 2nd#day 3rd#day 33,74 A#lot#of#diead#cells 2nd#day#P2 34,06 6th#day#P2 34,67 8th#day#P2 35,93 Untreated#H5N1#control from#inoculum 13,09 16,07 19,54 after#inoculation 16,42 17,32 19,04 2nd#day 12,22 14,18 17,36 CPE#in#all#dilutions rd#day 11,19 10,12 11,76 CPE#in#all#dilutions nd#day#P2 16,83 16,04 17,29 CPE#through#1:33#dilution th#day#P2 12,85 12,93 14,59 CPE#in#all#dilutions th#day#P2 16,80 16,92 18, RLTJtreated#H5N1#samples from#inoculum 13,58 14,91 20,15 #J after#inoculation 21,47 23,80 28,12 #J 2nd#day 22,97 23,64 28,44 #J 3rd#day 24,56 26,13 26,95 Cell#toxicity#through#1:200#dilution #J # 2nd#day#P2 29,04 29,73 30,92 #J 6th#day#P2 30,66 30,17 32,20 some#cell#toxicity #J 8th#day#P2 31,32 30,77 33, Pamela Österlund 15

16 Metanoli-fiksauksen testaus H5N1- infektoiduille soluille Vähentää proteiinien liukoisuutta, denaturoi/presipitoi proteiineja Liuottaa lipidejä Solut#H5N1,infektoitu,#metanoli,käsi7ely# 0,0# 5,0# 10,0# ennen# pesua,# päivä#1# pesun# jälkeen,# päivä#1# päivä#2# päivä#3# päivä#4# päivä#8# päivä#11# modc#infek;olla,#metanoli,#näyte>ä# 100µl# modc#infek;olla,#metanoli,#näyte>ä#30µl# Ct# 15,0# 20,0# 25,0# modc#infek;olla,#metanoli,#näyte>ä#5µl# modc#infek;olla,#näyte>ä#100µl# 30,0# 35,0# 40,0# modc#ilman#infek;ota#=#ctrl,#näyte>ä# 100µl# 45,0# Siirto uusille soluille Pamela Österlund 16

17 Paraformaldehydi-fiksauksen testaus H5N1- infektoiduille soluille Aldehydit kroslinkkaavia fixejä, muodostaa kovalenttisia sidoksia proteiinien välille Suojaa tertiäärirakenteita Solut#H5N1,infektoitu,#4%#PFA#käsi:ely# 0,0# ennen# pesua,# päivä#1# pesun# jälkeen,# päivä#1# päivä#2# päivä#3# päivä#4# päivä#8# päivä#11# modc#infek;olla,#4%#pfa,#näytebä#100µl# 5,0# 10,0# modc#infek;olla,#4%#pfa,#näytebä#30µl# 15,0# modc#infek;olla,#4%#pfa,#näytebä#5µl# Ct# 20,0# 25,0# 30,0# 35,0# 40,0# modc#infek;olla,#näytebä#100µl# modc#ilman#infek;ota#=#ctrl,#näytebä# 100µl# Siirto uusille soluille Pamela Österlund 17

18 Inaktivaatiomenetelmän testaus: Koejärjestely Infektoidut solut tai virusnäyte Inaktivaatiokäsittely, (kemikaalien pesu) Käsiteltyjen näytteiden laimennussarja ja inkubaatio kasvatussoluilla Jatkoviljelmät Mikroskopointi CPE, TCID50, PFU Solujen totrna keräys Suppinäytteiden keräys vrna qpcr Virus titraus HA TCID50 PFU vrna qpcr Pamela Österlund 18

19 PFA-testauksen uusinta Solut#H5N1,infektoitu,#4%#PFA#käsi:ely# Ct# 0" 5" 10" 15" 20" 25" 30" 35" 40" 45" 50" päivä"1"" päivä"2" päivä"3" päivä"4" päivä"7" päivä"8" päivä"9" päivä"10" modc"infek7olla,"4%"pfa,"näyteaä"100µl" modc"infek7olla,"4%"pfa,"näyteaä"5µl" modc"infek7olla,"näyteaä"5µl" Siirto uusille soluille Pamela Österlund 19

20 Yhteenveto Heikko näyte onko negatiivinen varmasti inaktiivinen Voimakas näyte infektiivisyyden pudotus ei riitä BSL3 tasolla Kemikaalien toksisuus hankaloittaa inaktivaation varmennusta Laimennettu näyte = heikko näyte Jatkoviljely tarpeeksi pitkään (rikastus) Read-out menetelmän herkkyys Mittaako infektiivistä partikkelia Voidaanko osoittaa mikrobien lisääntyminen Pamela Österlund 20

21 Kiitos! Veera Westenius Janne Tynell Sanna Mäkelä Hanna Valtonen Esa Rönkkö Riitta Santanen Susanna Sissonen Ilkka Julkunen Pamela Österlund 21

Samankaltaiset tiedostot

Vaaralliset uudet lintuinfluenssaja koronavirusinfektiot ihmisillä

Vaaralliset uudet lintuinfluenssaja koronavirusinfektiot ihmisillä Ilkka Julkunen Virologian yksikkö, THL, Helsinki ja Virusoppi, Turun yliopisto 07.02.2014 Lintuinfluenssa/MERS-infektiot/Julkunen 1 Respiratoriset