(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B. (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats (51) Kv.lk. - Int.kl.

Transkriptio

1 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT III F B II (10) FI B SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats (51) Kv.lk. - Int.kl. C12N 15/45 ( ) C12N15/62 ( ) A61K 39/155 ( ) (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (86) Kv. hakemus - Int. ansökan PCT/CA93/00001 (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet GB P (73) Haltija - Innehavare 1 Sanofi Pasteur Lindted/Senen Pasteur LImItee, 1755 Steeles Avenue West, Willowdale, Ontario M2R 3T4, KANADA, (CA) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Klein,Michel H., 16 Monro Boulevard, Willowdale, Ontario L4Z 1M5, KANADA, (CA) 2 Du,Run-Pan, 299 Chelwood Drive, Thornhill, Ontario L4J 7Y8, KANADA, (CA) 3 Ewasyshyn,Mary E., 120 Torresdale, Apartment 1506, Willowdale, Ontario M2R 3N7, KANADA, (CA) (74) Asiamies - Ombud: Forssån & Salomaa Oy Eerikinkatu 2, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä kimeerisen proteiinin valmistamiseksi ja tätä koodaava hybridigeeni Förfarande för framställning av ett kimeriskt protein och en hybridgen som kodar detta (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer FI B, FI B, Collins P et al. 0 glycosylation of glycoprotein g of human respiratory syncytial virus is specified within the divergen ectodomain. J Virol. 1990, vol. 64, p , VIJAYA S et al. Transport to the cell surface of a peptide sequence attached to the truncated C terminus of an n-terminally anchored integral membrane protein, Mol Cell Biol. 1988, vol. 8, pp , Brideau RJ et al. Protection of cotton rats against human respiratory syncytial virus by vaccination with a novel chimeric FG glycoprotein. J Gen Virol, 1989, vol 70, pp Wathen MW et.al. Characterization of a novel human respiratory syncytial virus chimeric FG glycoprotein expressed using baculovirus vector. J Gen Virol. 1989, vol 70, nro 10, pp (57) Tiivistelmä - Sammandrag Monihybridigeenit, jotka koodaavat vastaavaa kimeeristä proteiinia, käsittää geenisekvenssin, joka koodaa proteiinin antigeenialuetta ensimmäisestä patogeenistä, joka on kytketty geenisekvenssiin, joka koodaa proteiinin antigeenialuetta toisesta patogeenistä. Patogeenit ovat erityisesti parainfluenssavirus PIV ja hengityselimissä oleva RSvirus RSV. Yksittäinen rekombinaritti-immunogeeni kykenee suojaamaan vauvoja ja vastaavia herkkiä yksilöitä sairauksia vastaan, joita sekä PIV että RSV aiheuttaa. Multimeriska hybridgener som kodar motsvarande kimeriska protein innefattar en gensekvens som kodar för ett antigeniskt omräde av ett protein från en första patogen bunden till en gensekvens som kodar för ett antigeniskt område av ett protein från en andra patogen. Patogenerna är spcciellt parainfluenssavirus (PIV) och RS-virus (RSV). En enda rckombinant immunogen har formåga att skydda barn och liknande känsliga individer mot sjukdomar som förorsakas av både PIV och RSV.

2 Menetelmä kimeerisen proteiinin valmistamiseksi ja tätä koodaava hybridigeeni Förfarande för frarnställning av ett kimeriskt protein och en hybridgen som kodar detta 5 KEKSINNÖN ALA Esillä oleva keksintö liittyy multimeerisiin hybridigeeneihin, jotka sisältävät sek-. venssejä geenistä, joka koodaa eri patogeenien immunogeenisia proteiineja tai proteiinifragmentteja, näitä multimeerisiä hybridigeenejä sisältäviin soluihin, menetel- 10 mään elävän vektorin valmistamiseksi sisällyttämällä multimeerinen hybridigeeni virus- tai bakteerivektoriin, menetelmään kimeerisen proteiinin valmistamiseksi sekä menetelmään rokotteen valmistamiseksi. KEKSINNÖN TAUSTA 15 Tämän keksinnön näkökulman etuna on, että voidaan tuottaa yksittäisiä immunogeenejä, jotka sisältävät suojaavia antigeenejä erilaisista tautia aiheuttavista mikroorganismeista. Tällaiset kimeerit yksinkertaistavat huomattavasti yhdistelmärokotteiden kehitystä, varsinkin kun tuotetaan nimenomaan moniarvoisia rokotteita yksit- 20 täisannostusta varten. Tällä hetkellä moniarvoiset rokotteet tehdään erikseen tuottamalla patogeenejä (tautia aiheuttavia mikro-organismeja) ja/tai niiden erityisiä antigeenejä ja yhdistelemällä niitä erilaisiin formulointeihin. Tämä on kallis, intensiivinen, kustannuksia aiheuttava ja monimutkainen valmistusmenetelmä. Sitä vastoin sellaisen yksittäisen immunogeenin saatavuus, joka kykenee suojaamaan erilaisia 25 tauteja vastaan, voisi ratkaista monia niitä ongelmia, jotka liittyvät moniarvoisten rokotteiden tuottamiseen. Useita kimeerisiä immunogeenejä, sen tyyppisiä, joita esitetään tässä, voidaan yhdistää vähentämään sellaisten yksittäisten antigeenien lukumäärää, joita vaaditaan moniarvoisessa rokotteessa. 30 Ihmisen parainfluenssavirustyypit 1, 2, 3 ja RS-virustyypit Aja B ovat ne pääasialliset viruspatogeenit, jotka aiheuttavat vakavia hengityselintartuntoja lapsissa ja nuo-

3 rissa. Arvioidaan, että pelkästään Yhdysvalloissa noin 1,6 miljoonaa alle vuoden ikäistä lasta saa kliinisesti merkittävän RSV-infektion joka vuosi ja lisäksi 1,4 miljoonaa lasta saa PIV-3-tartunnan. Noin 4000 alle vuoden ikäistä lasta Yhdysvalloissa kuolee joka vuonna jälkiseurauksiin, jotka ovat seurauksena RSV- tai PIV-3-5 tartunnasta aiheutuvasta vakavasta hengityselinsairaudesta. WHO:n ja NIALD:n rokotteiden neuvoa-antavat komiteat asettivat tärkeysjärjestyksessä RSV:n rokotteen kehittämisen HIV:n jälkeen, kun taas tehokkaan PIV-3-rokotteen valmistus asetettiin kymmenen tärkeimmän rokotteen joukkoon, rokotteen kehittämistä ajatellen. 11B 10 Turvallisia ja tehokkaita rokotteita, jotka suojaavat lapsia näitä virustartuntoja vastaan, ei ole saatavilla, mutta niitä tarvitaan kiireellisesti. Kliiniset kokeet ovat osoittaneet, että formaldehydillä inaktivoidut ja elävät heikennetyt virusrokotteet eivät asianmukaisesti suojaa rokotteen saaneita näitä tartuntoja vastaan. Tosiasiassa lapset, jotka saivat formaliinilla inaktivoidun RSV-rokotuksen, sairastuivat vakavammin 15 alimpien hengityselinten sairauksiin sen jälkeisen luonnollisen RSV-tartunnan aikana kuin vertailuryhmä. [Am. J. Epidemiology 89, 1969, p ; J. Inf. Dis. 145, 1982, p ]. Lisäksi RSV-glykoproteiinit, jotka puhdistettiin immunoaffiniteettikromatografialla käyttämällä eluointia happamassa pn-arvossa, saivat aikaan immunovasteen puuvillarotissa. [Rokote, 10(7), 1992, p ]. Tehokkailla PIV ja RSV-rokotteilla, jotka eivät aiheuta pahenevaa keuhkotautia rokotteen saaneissa, kun on ruiskutettu villintyyppisellä viruksella, olisi merkittäviä terapeuttisia vaikutuksia. Arvioidaan, että yksittäisen sellaisen rekombinantti-immunogeenin kehittäminen, joka kykenee samaan aikaan suojaamaan lapsia tauteja vastaan, joita aiheuttavat parainfluenssa- ja RS-virustartunta, voisi merkittävästi vähentää kuolleisuutta 25 ja sairastumistiheyttä, joita nämä virusinfektiot aiheuttavat. Collins P. L. (Journal of Virology, vol. 46, ss , 1990) kuvaa kimeerisen cdna:n, joka koodaa RSV:n G-proteiinin ektodomeenin fuusioituneena PIV-3:n HN-proteiinin transmembraaniseen ja sytoplasmiseen domeeniin, sekä cdna:n, 30 joka koodaa RSV:n G-proteiinin transmernbraanisen ja sytoplasmisen domeenin

4 fuusioituneena PIV-3:n HN-proteiinin ektodomeeniin, ja vastaavat apinan munuaissoluissa ilmennetyt kimeeriset proteiinit. On raportoitu, että suojan saaminen PIV-3:a ja RSV:tä vastaan riippuu neutralisoivi- 5 en vasta-aineiden sisällyttämisestä pääasiallisia viruksen pintaglykoprotciineja vastaan. PIV:n tapauksessa nämä suojaavat immunogeenit ovat HN-proteiini, jonka molekyylipaino on 72 kda ja jolla on sekä hemaggiutinaatio- että neuraminidaasivaikutuksia, ja yhdistämisproteiini (F), jonka molekyylipaino on 65 kda, joka on vastuussa sekä viruksen yhdistämisestä isäntäsolun kaivoon että viruksen leviämisestä 10 solusta soluun. RSV:n tapauksessa kaksi pääasiallista immunogeenistä proteiinia ovat kda:n G-glykoproteiini ja 70 kda:n yhdistämisproteiini (F). G- ja F- proteiinien uskotaan olevan funktionaalisesti analogisia PIV:n HN- ja F-proteiinien kanssa. PIV:n ja RSV:n F-glykoproteiinit syntetisoidaan inaktiivisina prekursoreina (FO), jotka proteolyyttisesti halkaistaan N-pään F2- ja C-pään F1-fragmenteiksi, 15 jotka pysyvät sidottuna disulfidisidosten avulla. PIV:n ja RSV:n rekombinanttipintaglykoproteiineja on yksittäisesti ilmennetty hyönteissoluissa käyttämällä baculovirusjärjestelmää [Ray et al., (1989), Virus Research, 12: ; Coelingh et al., (1987), Virology, 160: ; Wathen et al., (1989), 20 J. of Inf. Dis. 159: ] kuten myös nisäkkään soluissa, jotka on infektoitu rekombinanttipoxviruksilla [Spriggs, et al., (1987), J. Virol. 61: ; Stott et al., (1987), J. Virol. 61: ]. Rekombinanttiantigeenien, joita tuotetaan näissä järjestelmissä, havaittiin suojaavan immunisoituja puuvillarottia eläviä viruksia vastaan. Nyttemmin hybridi-rsv-f-g [Wathan et al., (1989), J. Gen Virol. 70: ; Wathen, julkaistu kansainvälinen patenttihakemus WO 89/05823] ja PIV-3 F-HN [Wathen, julkaistu kansainvälinen patenttihakemus WO 89/10405] - rekombinanttiantigeenejä on käsitelty ja tuotettu nisäkkään ja hyönteisten soluissa. RSV:n F-G-hybridiantigeeni osoittautui suojaavaksi puuvillarotissa [Wathan et al., (1989), J. Gen. Virol. 70: ] heikosta anti-g-vasta-ainevasteesta huolimatta 30 [Connors et al., (1992), Vaccine 10: ]. PIV-3:n F-HN-proteiinin suojaavaa kykyä ei raportoitu julkaistussa patenttihakemuksessa. Näitä antigeenejä käsiteltiin

5 päämääränä suojata ainoastaan homologista virusta vastaan, joka on joko RSV tai PIV-3. Olisi kuitenkin edullista ja taloudellista, jos voitaisiin saada aikaiseksi ja tuottaa yksi ainoa rekombinantti-immunogeeni, joka sisältää ainakin yhden suojaantigeenin kummastakin viruksesta ja jolla samanaikaisesti suojeltaisiin lapsia ja 5 nuoria sekä PIV- että RSV-tartuntoja vastaan. Kimeerisiä proteiineja, jotka saadaan tässä tällaiseen tarkoitukseen, voidaan myös annostella raskaana oleville naisille tai hedelmällisessä iässä oleville naisille äidin vasta-aineiden stimuloimiseksi sekä PIV:iä että RSV:tä vastaan. Lisäksi rokotetta voidaan annostella muille herkille yksilöille, kuten iäkkäille. 10 KEKSINNÖN YHTEENVETO * * * Esillä olevalla keksinnöllä saadaan aikaan multimeerinen hybridigeeni, joka koodaa kimeerisen proteiinin, joka kykenee aikaansaamaan suojan useita parain- 15 fluenssaviruksen (PIV) ja respiratory syncytial viruksen (RSV) aiheuttamia hengityselinsairauksia vastaan, jolloin mainittu kimeerinen protciini käsittää parainfluenssavirus 3:n (PIV-3) F- tai HN-proteiinin, josta puuttuvat sen hydrofobisen ankkurin ja sytoplasmisen hännän domeenit, yhdistettynä respiratory syncytial viruksen (RSV) G- tai F-proteiiniin, josta puuttuvat sen hydrofobisen ankkurin ja 20 sytoplasmisen hännän domeenit. Keksinnön erään toisen suoritusmuodon mukaan saadaan soluja, jotka sisältävät multimeerinen hybridigeenin mainitun geenin koodaaman mainitun kimeerisen proteiinin ilmcntämiseksi. Sellaiset solut voivat olla bakteerisoluja, nisäkkään soluja, 25 hyönteissoluja, hiivasoluja tai sienisoluja. Lisäksi esillä olevalla keksinnöllä saadaan menetelmä antigeenin antamiseen soveltuvan elävän vektorin valmistamiseksi, jolloin multimeerinen hybridigeeni sisällytetään virus- tai bakteerivektoriin. Sellainen elävä vektori voi muodostaa aktiivisen 30 komponentin rokotteessa sellaisia sairauksia vastaan, joita monenlaiset patogeeniset

6 tartunnat aiheuttavat. Sellainen rokote voidaan formuloida annosteltavaksi ruiskumuodossa, nenän sisäisesti tai suun kautta. Esillä olevan keksinnön erään lisäsuoritusmuodon mukaisesti saadaan menetelmä 5 sellaisen kimeerisen proteiinin valmistamiseksi, joka kykenee aikaansaamaan suojan useita hengityselinsairauksia vastaan, joita hengityselinsairauksia aiheuttavat parainfluenssavirus (PIV) ja respiratory syncytial virus (RSV), jossa menetelmässä eristetään geenisekvenssi, joka koodaa PIV-3:n F- tai HN-proteiinin, josta puuttuvat sen hydrofobisen ankkurin ja sytoplasmisen hännän domeenit; eristetään 10 geenisekvenssi, joka koodaa RSV:n G- tai F-proteiinin, josta puuttuvat sen hydrofobisen ankkurin ja sytoplasmisen hännän domeenit; yhdistetään mainitut geenisekvenssit multimeerisen hybridigeenin muodostamiseksi ja ilmennetään mainittu multimeerinen hybridigeeni soluja käsittävässä ilmentämisjärjestelmässä. Sellainen soluja käsittävä ilmentämisjärjestel mä voidaan saada bakteerisolusta, 15 nisäkkään solusta, hyönteissolusta, hiivasolusta tai sienisolusta. Geenin ilmentämisestä peräisin oleva kimecrinen proteiinituote voidaan erottaa soluja käsittävän ilmentämisjärjestelmän viljelmästä ja puhdistaa. Edelleen esillä olevan keksinnön mukaisesti saadaan aikaan menetelmä parain- 20 fluenssaviruksen ja respiratory syncytial viruksen patogeenisten infektioiden aiheuttamia sairauksia vastaan suojaavan rokotteen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheet, joissa sisällytetään multimeerinen hybridi.geeni virus - tai bakteerivektoriin antigeenin antamiseen soveltuvan elävän vektorin muodostamiseksi; tai ilmennetään multimeerinen hybridigeeni soluja käsittävässä il mentärnis- 25 järjestelmässä kimeerisen proteiinin valmistamiseksi; jonka jälkeen saatu elävä vektori tai kimeerinen proteiini formuloidaan annosteltavaksi ruiskumuodossa, nenän sisäisesti tai suun kautta. Tällä menetelmällä saatuja rokotteita voidaan käyttää immunisoimaan isäntä sairaut- 30 ta vastaan, jonka aiheuttaa erilaiset patogeeniset tartunnat, varsinkin ne, joita aiheut- tavat parainfluenssavirus ja RS-virus, annostelemalla tehokas määrä rokotetta isän-

7 nälle. Kuten edellä on huomattu, kun kyseessä on ihmisen PIV ja RSV, isäntä voi olla vauva tai pieni lapsi, raskaana oleva nainen, kuten myös hedelmällisessä iässä oleva nainen tai jokin muu herkkä henkilö, kuten vanhus. 5 Tässä saatua kimeeristä proteiinia voidaan myös käyttää dia.gnostisena reagenssina sellaisen tartunnan osoittamiseksi, jonka aiheuttaa erilaiset patogeenit isännässä, käyttämällä sopivaa analysointimenetelmää. Tässä hakemuksessa termillä "multimeerinen hybridigeeni" tarkoitamme geenejä, 10 jotka koodaavat erilaisista patogeeneistä peräisin olevien proteiinien antigeenialueita ja termillä "kitneeriset proteiinit" tarkoitamme immunogeenejä, jotka sisältävät erilaisista patogeeneistä lähtöisin olevien proteiinien antigeenialueita. 15 PIIRUSTUSTEN LYHYT KUVAUS Kuvio 1 esittää PCR:11ä. monistetun PIV-3:n F-geenin ja F-proteiinin nukleotidi- (SEQ ID No: 1) (tunnistussekvenssi nro 1) ja aminohapposekvenssejä (SEQ ID No: 2); 20 Kuvio 2 esittää PIV-3:n F-geenin restriktiokarttaa; Kuvio 3 esittää PIV-3:n HN-geenin ja HN-proteiinin nukleotidi- (SEQ ID No: 3) ja aminohapposekvenssejä (SEQ ID No: 4); 25 Kuvio 4 esittää PIV-3:n HN-geenin restriktiokarttaa; Kuvio 5 esittää RSV:n F-geenin ja RSV:n F-proteiinin nukleotidi- (SEQ ID No: 5) ja aminohapposekvenssejä (SEQ ID No: 6); 30 Kuvio 6 esittää RSV:n F-geenin restriktiokarttaa;

8 Kuvio 7 esittää RSV:n G-geenin ja RSV:n G-proteiinin nukleotidi- (SEQ 1D No: 7) ja aminohapposckvenssejä (SEQ ID No: 8); 5 Kuvio 8 esittää RSV:n G-geenin restriktiokarttaa; Kuvio 9 esittää vaiheita, jotka liittyvät kimeerisen FPIV-3 - FRSV -geenin sisältävän ekspressiovektorin muodostamiseen; Kuvio 10 esittää vaiheita, jotka liittyvät ekspressiovektorin rakentamiseen, joka eks- 10 pressiovektori sisältää Fpw.3-geenin, josta puuttuu 5t-transloitumaton sekvenssi ja transmembraanisen ankkurin ja sytoplasrnisen hännän koodialueet; Kuvio 11 esittää vaiheita, jotka liittyvät ekspressiovektorin rakentamiseen, joka ekspressiovektori sisältää kimeerisen Fprv_3 FRSV -geenin, joka sisältää katkaistun PIV- 15 3:n F-geenin, josta puuttuu 5'-transloitumaton alue, yhdistettynä katkaistuun RSV:n F1-geeniin; Kuvio 12 esittää vaiheita, jotka liittyvät modifioidun pac 610 baculovirusekspressiovektorin rakentamiseen, joka vektori sisältää kimeerisen.fp1v-3 FRSV -geenin, 20 joka muodostuu PIV-3:n F-geenistä, josta puuttuu sekä 5T-transloitumaton sekvenssi että transmembraaninen ja sytoplasmisen hännän koodaava alue, yhdistettynä katkaistuun RSV:n F1-geeniin; Kuvio 13 esittää Sf9-soluista peräisin olevien solulysaattien imrnunoblotteja rekom- 25 hinanttibaculovirusten kanssa; Kuvio 14 esittää vaiheita, jotka liittyvät baculovirussiirtovektorin rakentamiseen (pd2); 30 Kuvio 15 esittää vaiheita, jotka liittyvät kimeerisen FRSV - HNprv_3 -geenin rakentamiseen;

9 Kuvio 16 esittää SDS-PAGE-geeliä ja puhdistetun FRSV FINpni,3 kimeerisen proteiinin immunoblottia; 5 Kuvio 17 esittää PIV-3:n F-geenin mutaatiota; ja Kuvio 18 esittää vaiheita, jotka liittyvät kimeerisen Fpw-3 - GRSV -geenin rakentamiseen. 10 KEKSINNÖN YLEINEN KUVAUS Esillä olevassa keksinnössä saadaan kimeerinen molekyyli, joka suojaa kahta erilais- ta lapsuuden tavallista tautia vastaan. Erityisesti esillä oleva keksintö liittyy erilaisten paraintluenssavirus (PIV) / RS (RSV) -rekombinantti-immunogeenien formulointiin, 15 jotta saataisiin turvallinen ja tehokas rokote, joka kykenee suojaamaan vauvoja ja nuoria lapsia, kuten myös muita herkkiä yksilöitä, sellaisia sairauksia vastaan, joita sekä PIV- että RSV-tartunta aiheuttavat. Sellaisia rokotteita voidaan annostella millä vaan halutulla tavalla kuten helposti ruiskutettavalla rokotteella, nenän kautta tai suun kautta. 20 Esillä olevassa keksinnössä keksijät ovat erityisesti saaneet aikaiseksi useita.. PIV/RSV:n kimeerisiä malligeenejä, jotka sisältävät relevantteja sekvenssejä vali- tuista PIV-3:a ja RSV:n pintaglykoproteiineja koodaavista geeneistä peräkkäin kyt- kettyinä. Kaikki geenit tässä kuvatuissa kimeerisissä rakenteissa saatiin uusista PIV- 25 3:n ja RSV:n kliinisistä isolaatcista. Kimecriset geenirakenteet voivat sisältää gee- nisekvenssejä joko PIV-3:n F- tai HN -geeneistä, joita on kytketty peräkkäin joko RSV:n F- tai G-geenien kanssa kaikissa mandollisissa suhteellisissa asennoissa ja 0 kaikkina mandollisina yhdistelminä. 30 Näiden geenien luonnollisia nukleotidisekvenssejä voidaan modifioida mutaatiolla samalla kun antigeenisyys säilyy ja sellaisiin modifiointeihin voi sisältyä putatiivis-

10 ten transkriptiota edeltävien lopetussekvenssien poistaminen näiden 'geenien ilmentämisen optimoimiseksi eukaryoottisoluissa. Geenit suunniteltiin koodaamaan hybridi-piv-rsv-pintaglykoproteiineja, jotka on peräkkäin kytkettynä yhdessä ainoassa rakenteessa sellaisten geenituotteiden tuottamiseksi, jotka saavat aikaan suojaavia 5 vasta-aineita sekä paraintluenssa- että RS-viruksia vastaan. Sellaiset multimeeriset hybridigeenit muodostuvat geenisekvenssistä, joka koodaa ihmisen PIV-3 F- tai HNproteenia tai sen immunogeenistä epitooppia sisältävää fragmenttia, joka on kytketty geenisekvenssiin, joka koodaa ihmisen RS V G- tai F-proteenia tai sen immunogeenistä epitooppia sisältävää fragmenttia. Erityisiä geenirakenteita, joita voi- 10 daan käyttää ovat Fpw-3 - FRSV, FRSV FINPIV-3 ja FP1V-3 GRSV -hybridigeenit. Lisäksi esillä oleva keksintö ulottuu myös muiden multimeeristen geenien, kuten sellaisten trimeeristen geenien rakentamiseen, jotka sisältävät PIV- ja RSV-geenejä tai geenisegmenttejä, jotka kaikki on kytketty kaikkiin mandollisiin suhteellisiin 15 asentoihin. Esimerkiksi: Fpiv FINHV - F tai GRSV Fply - FRSV - GRSV HNp 1 - FRSV - GRSV 20 Tässä saadut multimeeriset geenit voivat myös käsittää ainakin yhden geenin, joka koodaa ainakin yhtä immunogeenistä ja/tai immunostimuloivaa molekyyliä. Tässä saadut multimeeriset hybridigeenit voidaan myös alikloonata sopiviin vektoreihin ilmennettäviksi soluja käsittävissä ilmentämisjärjestelmissä. Tällaisiin soluja 25 käsittäviin ilmentämisjärjestelmiin voi kuulua bakteeri-, nisäkäs-, hyönteis- ja sienisoluja, kuten hiivasoluja. Tässä aikaan saadut kimeeriset proteiinit voidaan myös esitellä inu-nuunijärjestelmälle käyttämällä elävää vektoria, kuten eläviä virusvektoreita, kuten rekombinoituja 30 poxviruksia, adenoviruksia, retroviruksia, Semliki Forest viruksia, ja eläviä bakteerivcktoreita, kuten Salmonella- ja mykobakteereita (esim. BCG).

11 Kimeeriset proteiinit, kuten PIV/RSV-kimeerit, joita on läsnä joko transfektoitujen, transformoitujen tai tartutettujen solujen lysaateissa tai supernatanteissa, voidaan puhdistaa millä vain sopivalla tavalla. 5 Kimeeristen proteiinien immunogeenisyyden ja suojaamiskyvyn arvioimiseksi sopivia koe-eläimiä immunisoidaan joko puhdistettujen kimeeristen proteiinien, kuten PIV/RSV-kimeerien, eri annoksilla ja/tai elävillä rekombinanttivektoreilla, kuten edellä on kuvattu. Sellaisia kimeerisiä proteiineja voidaan esitellä immuunijärjestel- 10 mälle joko käyttämällä fysiologisesti hyväksyttäviä kuljetusaineita, kuten alumiinifosfaattia, tai käyttämällä antamisjärjestelmiä, kuten ISCOMS- ja liposomijärjestelmiä. Kimeerit voidaan myös formuloida niin, että ne kykenevät saamaan aikaan limakalvovasteen esimerkiksi yhdistämällä tai liittämällä immuunivastetta ohjaaviin kuljetusaineisiin, kuten koleratoksiini B alayksikköön, tai sisällyttämällä mikrohiuk- 15 kasiin. Rokotteet voivat vielä lisäksi käsittää välineitä multimeerisen proteiinin jakelemiseksi erityisesti immuunijärjestelmän soluihin, kuten toksiinimolekyylejä tai vasta-aineita. Kimeeristen proteiinien immunologisen suojauskyvyn parantamiseksi edelleen niitä voidaan täydentää muilla immunogeenisillä ja/tai immunostimuloivilla molekyyleillä. Kimeeriset P1V/RSV-proteiinit, joita erityisesti kuvataan tässä, voi- 20 daan formuloida apuaineen kanssa, kuten alumiinifosfaatin kanssa, helposti ruiskutettav ien rokotteiden tuottamiseksi suojaamaan sairauksia vastaan, joita aiheuttavat sekä PIV-3 että RSV. Kimeeriset proteiinit voidaan myös annostella nenän kautta tai suun kautta. Kimeerisiä proteiineja voidaan käyttää testipakkauksissa PIV-3- ja RSV-tartunnan diagnoosiin. 25 SEKVENSSN TUNNISTAMINEN 30 Useisiin nukleotidi- ja aminohapposekvensseihin viitataan tämän hakemuksen selityksessä. Seuraava taulukko esittää sekvenssit ja sekvenssin sijainnin:

12 SEQ 1D No. Tunnistus Sijainti 1 PCR:llä monistetun PIV-3:n F- Fig. 1, Esimerkki 1 geenin nukleotidisekvenssi 5 2 PCR:llä monistetun PIV-3:n F- Fig. 1, Esimerkki 1 proteiinin aminohapposekvenssi 10 3 PIV-3:n HN-geenin nukleotidi- Fig. 3, Esimerkki 1 sekvenssi 4 PIV-3:n HN-proteiinin amino- Fig. 3, Esimerkki 1 happosekvenssi 5 RSV-geenin nukleotidi- Fig. 5, Esimerkki 1 15 sekvenssi RSV:n F-proteiinin aminohapposekvenssi Fig. 5, Esimerkki RSV:n G-geenin nukleotidisekvenssi Fig. 7, Esimerkki RSV:n G-proteiinin aminohapposekvenssi Fig. 7, Esimerkki 1 BsrI - BamHI -oligonukleotidikasetti Fig. 9, Esimerkki 2 10 BspHi - BamHI -oligo- Fig. 9, Esimerkki 2 30 nukleotidikasetti 11 EcoRI - Ppu Mi -oligo- Fig. 9, Esimerkki 2 nukleotidikasetti

13 BrsI - BamHI -oligo- Fig. 10, Esimerkki 3 nukleotidikasetti 13 EcoRI Bsr BI -oligo- Fig. 10, Esimerkki 3 5 nukleotidikasetti 14 EcoRV EcoRI -oligo- Fig. 11, Esimerkki 5 nukleotidikasetti EcoRV - BamHI -oligo- Fig. 14, Esimerkki 8 nukleotidikasetti BspHI - BspHI -oligo- Fig. 15, Esimerkki 9 nukleotidikasetti 17 F-geenin Esimerkki 15 nukleotidisekvenssi 18 Mutageeninen oligo- Fig. 17, Esimerkki nukleotidi # Oligonukleotidi #2721 -osan Esimerkki 15 nukleotidisekvenssi Oligonukleotidikoetin Esimerkki 15 TALLETUSTIETOA Useat plasmidi-dna-molekyylit, jotka on kuvattu ja joihin on viitattu, on tallennettu 30 tallctuslaitokseen American Type Culture Collection (ATCC), jonka sijainti on Rockville, Maryland, USA, Budapest-sopimuksen mukaisesti ja ennen tämän hakemuksen jättämistä. Tallennetut puhdistetut plasmidit tulevat olemaan yleisesti saatavilla, kun tämä US-patenttihakemus on hyväksytty tai kun vastaava Euroopan patenttihakemus on julkinen, riippuen siitä, kumpi tapahtuu ensin. Keksintö, joka tässä

14 on kuvattu ja josta on esitetty vaatimukset, ei rajoitu tallennettujen rakenteiden plasmidi-dna:han, koska tallennettu suoritusmuoto on ainoastaan tarkoitettu kuvaamaan keksintöä. Seuraavat puhdistetut plasmidit tallennettiin ATCC:hen alla merkityllä talletusnumerolla 17. joulukuuta 1992: 5 Plasm idi Esimerkki nro Talletusnro pac DR pd2fr-hn pd2f-g Mitkä vain ekvivalentit plasmidit, joita voidaan käyttää ekvivalenttien antigeenien tuottamiseen, kuten tässä hakemuksessa on kuvattu, ovat keksinnön piirissä. ESIMERKIT 15 Edellä oleva selitys kuvaa esillä olevaa keksintöä yleisesti. Keksintö voidaan yrrimärtää täydellisemmin viittaamalla seuraaviin erityisiin esimerkkeihin. Nämä esimerkit on kuvattu ainoastaan kuvaamaan keksintöä eikä ole tarkoitettu rajoittamaan keksinnön piiriä. Muutokset muodossa ja ekvivalenttien substituutiot ovat mandollisia olosuhteiden mukaisesti. Vaikka tässä on käytetty erityisiä termejä, nämä termit 20 on tarkoitettu kuvaamaan keksintöä eikä rajoittamaan sitä. Menetelmiä PIV-3- ja RSV-geenien kloonaamiseen ja sekvensointiin, kuten myös menetelmiä geenien alikloonaamiseen sopiviin vektoreihin ja geenirakenteiden ilmentämiseen nisäkäs- ja hyöntcissoluissa, ei ole erityisemmin kuvattu tässä selityk- 25 sessä, mutta ovat alan ammattihenkilöiden osaamisen piirissä..1, Esimerkki 1: Tässä esimerkissä esitetään menetelmä, jota käytetään PIV-3:n F-, HN- ja RSV:n F- 30 ja G-geenien kloonaamiseen ja sekvensointiin (A-tyypin isolaatista). Näitä geenejä

15 käytettiin Fpiv_3 FRSV, FRSV HNPIV-3 ja FPIV-3 GRSV kimeeristen geenien rakentamiseen, joista on yksityiskohdat esimerkeissä 2-4, 9 ja 15. Kaksi. PIV-3:n F-geenikloonia saatiin aluksi monistamalla cdna PCR:llä, joka 5 cdna johdettiin viruksen RNA:sta, joka uutettiin PIV-3:n uudesta kliinisestä isolaatista. Kaksi muuta PIV-3:n F-geenikloonia, kuten myös PIV-3:n HN-, RSV:n F- ja RSV:n G-geenit, kloonattiin cdna-kirjastosta, joka on valmistettu joko P1V-3:n tai RSV:n kliinisellä isolaatilla (A-tyypin isolaatti) infektoiduista MRC-5-soluista eristetystä mrna:sta. PIV-3:n F- (sekä PCR:llä monistettu että PCR:llä monistamaton), 10 PIV-3:n HN-, RSV:n F- ja RSV:n G-geenikloonit sekvensoitiin dideoksinukleotidiketjunterminointimenetelmillä. Geenien molempien säikeiden sekvensointi suoritettiin yhdistämällä manuaalinen ja automatisoitu sekvensointi. PCR:llä monistetun PIV-3:n F-geenin ja F-proteiinin nukleotidi- (SEQ ID No. 1) ja 15 aminohapposekvenssit (SEQ ID No. 2) on esitetty kuviossa 1 ja geenin restriktiokartta on esitetty kuviossa 2. Kanden PCR:llä monistetun PIV-3:n F- geenikloonien 1844 nukleotidin sekvenssianalyysi vahvisti, että kloonit olivat identtiset. PCR:llä monistetun PIV-3:n F-geenikloonin koodaavan sekvenssin vertailu PIV-3:n F-geenin julkaistuun sekvenssiin osoitti 2,6 %:n eroavuutta näiden kanden 20 geenin koodaavien sekvenssien välillä, mikä johti neljääntoista arninohapposubstituutioon. PCR:llä monistamattoman PIV-3:n F-geenikloonin nukleotidisekvenssi erosi PCR:llä monistetun geenikloonin sekvenssistä seuraavalla tavalla: PCR:llä monista- 25 mattomalla kloonilla oli 10 ylimääräistä nukleotidia (AGGACAAAAG) geenin 5'- transloitumattomassa alueessa ja eroja neljässä paikassa, 8 (T PCR:llä monistetussa geenissä ja C PCR:llä monistamattomassa geenissä), 512 (C PCR:llä monistetussa geenissä, T PCR:llä monistamattomassa geenissä), ja 1376 (A PCR:llä monistetussa geenissä, G PCR:llä monistamattomassa geenissä). Nämä muutokset johtivat kol- 30 meen muutokseen PCR:llä monistamattoman PIV-3:n F-geenin koodaaman F- proteiinin aminohapposekvenssissä. Seriini (asema 110), glysiini (asema 112) ja

16 asparagiinihappo (asema 398) PCR:llä monistetun PIV-3:n F-geenin koodaamassa F-proteiinin primäärisessä aminohapposekvenssissä muuttuivat fenyylialaniiniksi (asema 110), glutamiinihapoksi (asema 112) ja glysiiniksi (asema 398) F-protciinin primääriscssä aminohapposekvenssissä, jota koodaa PCR:llä monistettu klooni. 5 Kuvio 3 osoittaa PIV-3:n HN-geenin ja -proteiinin nukleotidi- (SEQ ID No. 3) ja aminohapposekvenssit (SEQ ID No. 4) ja geenin restriktiokartta on esitetty kuviossa 4. Näistä kandesta HN-kloonista saadun 1833 nukleotidisekvenssin analyysi vahvisti, että sekvenssit olivat identtiset. Huomattiin, että PIV-3:n HN-geenin koodaavassa 10 sekvenssissä oli 4,4 %:n ero, kun sekvenssiä verrattiin julkaistuun PIV-3:n koodaavaan sekvenssiin. Tämä ero johti 17 aminohapposubstituutioon proteiinin aminohapposekvenssissä, jota proteiinia koodaa PIV-3:n HN-geeni.. * RSV:n F-geenin ja RSV:n F-proteiinin nukleotidi- (SEQ ID No. 5) ja aminohappo- 15 sekvenssit (SEQ 1D No. 6) on esitetty kuviossa 5 ja geenin restriktiokartta on esitetty kuviossa 6. Kandesta RSV-kloonista saadun 1887 nukleotidisekvenssin analyysi vahvisti, että näiden kanden kloonin välillä oli täydellinen sekvenssien välinen homologia. Tämä nukleotidisekvenssin vertailu siihen, joka on ilmoitettu RSVgeenille, osoitti noin 1,8 %:n eroa koodaavassa sekvenssissä, mikä johti yhteentoista 20 aminohapposubstituutioon. RSV:n G-geenin ja RSV:n G-proteiinin nukleotidi (SEQ -ED No. 7) ja aminohappo- sekvenssit (SEQ ID No. 8) on esitetty kuviossa 7, kun taas geenin restriktiokartta on esitetty kuviossa 8. G-geenikloonin 920 nukleotidisekvenssin vertailu julkaistuun G- 25 sekvenssiin (A-tyypin isolaatti) osoitti 4,2 %:n eron nukleotidisekvenssissä ja 6,7 %:n eron geenituotteen aminohapposekvenssissä. Tämä ero johti kahteen- kymmeneen aminohapposubstituutioon. * IP. Täysipitkän PIV-3:n F- (PCR:llä monistamaton), PIV-3:n RSV:n F- ja RSV:n. 30 G-geenit kloonattiin Ågt11:een ja alikloonattiin Bluescript M13-SK vektorin mo- ninkertaiseen kloonauspaikkaan joko tylppäpäisellä liitoksella tai käyttämällä sopivia.

17 linkkereitä. PCR:llä monistettu P1V-3:n F-geeni kloonattiin suoraan Bluescriptvektoriin. Kloonausvektorit, jotka sisälsivät PIV-3:n PCR:llä monistetun F-, PIV-3:n PCR:llä monistamattornan F-, PIV-3:n HN-, RSV:n F- ja RSV:n G-geenin, nimettiin tunnuksin ppi3f, ppi3fc, ppivhn, prsvf ja prsvg. Esimerkki 2: Tämä esimerkki kuvaa Bluescriptiin perustuvan ekspressiovektorin rakennetta (PMCR20), joka sisältää kimeerisen Fpw_3 - FRSV -geenin. Tämä kimeerinen geenira- 10 kenne sisältää PIV-3:n F-geenin 5 1-transloitumattoman alueen, mutta siitä puuttuu sekä PIV-3:n että RSV:n F-geenien hydrofobisen ankkurin ja sytoplasmisen hännän koodausalueet. Vaiheista, jotka liittyvät tämän plasmidin rakenteeseen, on yhteenveto kuviossa 9. * 15 Kimeerisen geenin PIV-3-osan valmistamiseksi (kuvio 9, vaihe 1), johdettiin täysipitkä PIV-3-geeni, josta puuttuu transmembraaninen alue ja sytoplasmisen hännän koodausalue, ppi3f-plasmidista leikkaamalla polylinkkeri BamHI:11ä, muodostamalla linearisoidusta plasmidista tylppäpäinen Klenow-polymeraasilla ja leikkaamalla geeni BsrEllä. Bsrl-BamHI-oligonukleotidikasetti (SEQ ID No:9), joka sisältää 20 PpuMi-paikan ja kolme peräkkäistä transloitavaa pysäytyskodonia, sidottiin katkaistuun 1,6 Kb [BamHI]-BsrI-leikattuun PIV-3:n F-geenifragmenttiin ja kloonattiin Blueseript M13-SK ekspressiovektorin EcoRV-BamHI-paikkoihin, jotka sisältävät ihmisen metallotioneenipromoottorin ja SV40-genomin poly-a- ja IVS-sekvenssit (merkitty tunnuksella pmcr20), pme1-plasmidin tuottamiseksi. 25 Kimeerisen rakenteen RSV:n F-geenikomponentin käsittelemiseksi (kuvio 9, vaihe 2) RSV:n F-geeni, josta puuttuu transmembraaninen alue ja sytoplasmisen hännän koodausalueet, saatiin plasmidista prsvf leikkaamalla polylinkkeri EcoRI:lla ja geeni BspHI:llä. Synteettinen BspHI-BamHI-oligonuldeotidikasetti (SEQ ID No: 30 10), joka sisältää kolme peräkkäistä transloitavaa pysäytyskodonia, sidottiin 1,6 Kb katkaistuun RSV:n F-geeniin ja kloonattiin Bluescriptiin perustuvan ekspressiovek-

18 torin pmcr20 EcoRI-BamHI-paikkoihin pes13a plasmidin tuottamiseksi. pes13a-plasmidi leikattiin sitten EcoRI:lla ja PpuMI:lla johtosekvenssin ja F2- koodaussekvenssin poistamiseksi katkaistusta RSV:n F-geenistä. Johtosekvenssi rakennettiin uudestaan käyttämällä EcoRI-PpuMi-oligokasettia (SEQ 1D No: 11) ja 5 sidottiin RSV:n F1-geenisegmenttiin pes23a-plasmidin tuottamiseksi. Kimeerisen Fpw3-FRsv-geenin valmistamiseksi (kuvio 9, vaihe 3), joka geeni sisältää PIV-3:n F-geenin 5'-transloitumattoman alueen sidottuna katkaistuun RSV:n Flgeenifragmenttiin, plasmidi pme1 (joka sisälsi 1,6 Kb katkaistun PIV-3:n F-geenin) 10 leikattiin ensin PpuMI:lla ja BamHI:11a. PpuMI-BamHI-rajoitettu pme1-vektori defosforyloitiin suolen alkalifosfataasilla. 1,1 Kb RSV:n F1-geenifragmentti otettiin pes23a-plasmidista leikkaamalla plasmidi PpuMI:lla ja BamHI:lla. 1,1 Kb PpuMI- BamHI-leikattu RSV:n Fl -geenifragmentti kloonattiin defosforyloidun pme 1- vektorin PpuMI-BamHI paikkoihin pes29a-plasmidin tuottamiseksi. Tämä kimee- 15 rinen geenirakenne sisältää PIV-3:n F-geenin 5'-transloitumattoman alueen, mutta siitä puuttuu nukleotidisekvenssit, jotka koodaavat sekä PIV-3:n että RSV:n F- proteiinien hydrofobisia ankkuridomeeneja ja sytoplasmisia häntiä Esimerkki 3: Tämä esimerkki kuvaa Bluescriptiin perustuvan ekspressiovektorin rakentamista, joka vektori sisältää PIV-3:n F-geenin, josta puuttuu sekä 5'-transloitumattornan että transmembraanisen ankkurin ja sytoplasmisen hännän koodausalueet. Vaiheet, jotka kuuluvat tämän plasmidin rakentamiseen, on kuvattu kuviossa 10. ppl3f-plasmidi, joka sisältää täysipitkän P1V-3:n F-geenin, leikattiin BamHI:11a, muodostettiin tylppäpäiseksi Klenow-polymeraasilla ja sitten leikattiin BsrI:llä transmembraanisen ja sytoplasmisen hännän koodausalueen poistamiseksi. Bluescriptiin perustuva ekspressiovektori pmcr20 leikattiin SmaI:lla ja BamHI:11a. Syn- 30 teettinen BsrI-BamHI-oligonukleotidikasetti (SEQ ID No: 12), joka sisältää transloitavan pysäytyskodonin, sidottiin 1,6 Kb tylppäpäiseksi tehdyn Bsrl-leikatun PIV-3:n

19 F-geenifragrnentin kanssa SmaI-BamHI:llä rajoitettuun pmcr20-vektoriin pmpfbplasmidin tuottamiseksi. Tämän rakenteen PIV-3:n F-geenistä puuttui DNAfragmentti, joka koodaa transmembraanista ja sytoplasmista ankkuridomeenia, mutta sisälsi 5'-transloitumattoman alueen. Sellaisen plasmidin saamiseksi, joka sisältää 5 PIV-3:n F-geenin, josta puuttuu sekä 5'-transloitumaton alue että DNA-fragmentti, joka koodaa hydrofobista ankkurialuetta, plasmidi pmpfb leikattiin EcoRI:lla ja BstBI:llä. EcoRI-BstBI-oligokasetti (SEQ 1D No: 13), joka sisältää sekvenssit signaalipeptidin rakentamiseksi uudelleen ja koodaavat sekvenssit, jotka poistettiin leikkaamalla EcoRI-BstBI:11ä, sidottiin EcoRI-BstBI-rajoitettuun pmpfb-vektoriin 10 pmpfa-plasmidin tuottamiseksi. Esimerkki 4: Tämä esimerkki kuvaa kimeerisen Fmv-3 - FRSV -geenin rakentamisen, joka muodos- 15 tuu katkaistusta PIV-3:n F-geenistä, josta puuttuu 5'-transloitumaton alue, joka on sidottu katkaistu un RSV:n F1-geeniin. Vaiheista, jotka liittyvät tämän p las midin rakentamiseen, on tehty yhteenveto kuvioon 11. * s Tämän kimeerisen geenirakenteen valmistamiseksi pes29a.-plasmidi (esimerkki 2) 20 leikattiin BstBI:llä ja BamHI:lla ja 2,5 Kb BstBI-BamHI-leikattu kimeerisen PIV-3 F - RSV Fl geenifragmentin vapauttamiseksi. Tämä BstBI-BarnHI fragmentti eristettiin matalan sulamispisteen agaroosigeelistä ja kloonattiin defosforyloidun pmpfa-vektorin BstBI-BamHI-paikkoihin pes60a-plasmidin tuottamiseksi. Tämä rakenne sisälsi PIV-3:n F-geenin, josta puuttui sekä 5'-transloitumaton alue että hyd- 25 rofobi.sen ankkurin ja sytoplasmisen hännän koodaussekvenssit, jotka on sidottu katkaistun RSV:n F-geenin F1-koodausalueeseen. Tämä kimeerinen geeni alikloonattiin baculovirussiirtovektotiin (katso esimerkki 5).

20 Esimerkki 5: Tämä esimerkki kuvaa modifioidun pac 610 -baculovirussiirtovektorin rakentamisen, joka vektori sisältää luonnollisen polyhedriinipromoottorin ja kimeerisen Fpiv_3 5 FRSV -geenin, joka muodostuu PIV-3:n F-geenistä, josta puuttuu sekä 5'- transloitumaton sekvenssi että nukleotidisekvenssi, joka koodaa hydrofobista ankkurialuetta ja sytoplasmista häntää, joka on sidottu katkaistuun RSV:n F1-geeniin. Tämän plasmidin rakenne on kuvattu kuviossa pac 610 -baculovirusekspressiovektori modifioitiin sisältämään luonnollinen polyhedrinen promoottori seuraavalla tavalla. pac 610 -vektori leikattiin EcoRV:llä ja BamHI:lla. 9,4 Kb baculovirussiirtovektori, josta puuttui EcoRV-BamHI-DNAsekvenssi, eristettiin matalan sulamispisteen agaroosigeelillä ja käsiteltiin suolen alkalifosfataasilla. 3-tieligatoinnilla EcoRV-EcoRI-oligonukleotidikasetti (SEQ ID 15 No: 14), joka sisälsi nukleotidit, joita vaadittiin säilyttämään luonnollinen polyhedriinipromoottori, sidottiin 1,6 Kb EcoRI-BamIII:lla katkaistuun RSV:n F- geenifragmenttiin, joka eristettiin pes13a-rakenteesta (esimerkki 2, vaihe 2) ja EcoRV-Bam_HI-rajoitettuun pac 610 fosforoituun vektoriin pes47a-plasmidin tuottamiseksi. pac 610:een perustuvan ekspressiovektorin valmistamiseksi, joka 20 sisältää kimeerisen Fp1v3 - FRSV -geenin, pes47a-plasmidi leikattiin ensin EcoR1:11a ja BamHI:lla 1,6 Kb katkaistun RSV:n F-geenin poistamiseksi. 2,8 Kb Fp1v-3 FRSV kimeerinen geeni saatiin leikkaamalla pes60a-plasmidi (esimerkki 4) EcoRI:lla ja Balla-11:11a. 2,8 Kb EcoRI-BamHI kimeerinen geeni sidottiin EcoRI-BamHIrajoitettuun pes47a-vektoriin pac DR7-plasmidin tuottamiseksi (ATCC 75387). Esimerkki 6 Tämä esimerkki esittää kimeerisen Fp1v_3 - FRsv -geenin sisältävien plaldcipuhdistettujen rekombinanttibaculoviruksien valmistusta. 30

21 Spodoptera frugiperda (Sf9) soluja tartutettiin 1,0 pg:lla luonnollista AcMNPV- DNA:ta ja 2,5 pg:lla Fpiv_3 - FRSV -plasmidi-dna:ta (pac DR7 -plasmidi - esimerkki 5). Putatiiviset rekombinanttibaculovirukset (kerran puhdistettu sarjalaimennuksella), jotka sisälsivät - FRSV kimeerisen geenin, tunnistettiin dot-blot- 5 hybridisoinnilla. Hyönteissolujen lysaatteja, jotka oli tartutettu putatiivisilla rekombinanttibaculoviruksilla, koestettiin 32P-leimatulla Fpw_3 - FRSV kimeerisellä geenillä. Rekombinanttibaculoviruksia plakkipuhdistettiin kaksi kertaa ennen kuin niitä käytettiin ekspressiotutkimuksiin. Kaikki menetelmät suoritettiin M.D. Summersin ja G.E. Smithin teoksessa "A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect 10 Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experiment Station, Bulletin 1555, 1987, suunnittelemien käytäntöjen mukaisesti. Esimerkki 7: 15 Tämä esimerkki kuvaa kimeerisen Fp1v.3 - FRSV -proteiinin läsnäolon tartutettujen Sf9-solujen solulysaattien supernatanteissa. Hyöntei ssoluja tartutettiin plakkipuhdistetuilla rekombinanttibaculoviruksilla, jotka oli puhdistettu kuten on kuvattu esimerkissä 6, infektiokertoimen ollessa 8. Väke- 20 vöidyt supernatantit soluista, jotka oli tartutettu rekombinanttiviruksilla, olivat positiivisia PIV-3 F spesifisessä ELISA:ssa. Lisäksi kun 35S-metioniinileimattujen tartutettujen solujen lysaateille tehtiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi ja geenit analysoitiin autoradiografial I a, saatiin vahva vyöhyke keskimääräisellä molekyylipainolla noin 90 kda rekombinanttiviruksilla tartutettujen solujen lysaateissa, mutta 25 se puuttui niistä lysaateista, jotka olivat luonnollisista tartutetuista soluista. Kimeerisen Fpfv-3 - FRSV -proteiinin läsnäolo sellaisten solujen lysaatei.ssa, jotka oli tartutettu rekombinanttibaculoviruksilla, vahvistettiin vielä Western blot -a.nalyysillä käyttämällä monospesifisiä anti-piv-3- ja anti-rsv-antiseerumeita ja/tai monokloonisia vasta-aineita (Mab). Lysaatit soluista, jotka oli tartutettu rekombinanttibaculoviruk- 30 silla, reagoivat sekä anti-piv-3- että anti-rsv-f-antiseerumeihin immunohloteissa. Kuten on esitetty kuvion 3 immunoblotissa, lysaatit soluista, jotka oli tartutettu joko

22 RSV:n F:llä tai FRiv_3 - FRSV -rekombinanttibaculoviruksilla, reagoivat positiivisesti anti-f-rsv-mab:n kanssa. Odotusten mukaisesti lysaatit niistä soluista, jotka oli tartutettu luonnollisella viruksella, eivät reagoineet tämän Mab:n kanssa. Lisäksi vain ne lysaatit, jotka olivat soluista, jotka oli tartutettu kimeerisillä Fpw.3 - FRSV - 5 rekombinanttiviruksilla, reagoivat anti-piv-3-f1-antiseerumin kanssa. Esimerkki 8: Tämä esimerkki kuvaa baculovirussiirtovektorin pvl1392 modifiointia (saatu Invit- 10 rogenistä), jossa polyhedriinin ATG-aloituskodoni muutettiin ATT:ksi ja sekvenssi CCG oli läsnä polyhedriinigeenin alavirran puolella, asemissa +4,5,6. Rakennegeenin sisällyttämisen useiden emäsparien verran ATT-kodonista alavirtaan tiedetään parantavan translaatiota. Vaiheet, jotka sisältyvät tämän modifioidun baculovirussiirtovektorin rakentamiseen, on esitetty kuviossa 14. Baculovirusekspressiovektori 15 pvl1392 leikattiin EcoRV:llä ja BamHI:11a. 9,5 kb rajoitettu pvl1392-vektori sidottiin EcoRV-BamHI-oligonukleotidikasettiin (SEQ 1D No: 15) pd2-vektorin tuottamiseksi. * Esimerkki 9: 20 Tämä esimerkki esittää pd2-baculovirusekspressiovektorin rakentamisen, joka vektori sisältää kimeerisen FRSV - HNp1v.3 -geenin, joka muodostuu katkaistuista RSV:n F- ja PIV-3:n HN-geeneistä peräkkäin sidottuna. Vaiheista, jotka liittyvät tämän plasmidin rakentamiseen, on tehty yhteenveto kuvioon FRSV HNprv_3 -geenin tekemiseksi RSV:n G-geeni, josta puuttuu nukleotidisekvenssi, joka koodaa transmembraanialuetta ja sytoplasmista häntää, irrotettiin prsvf-plasmidista (esimerkki 1) leikkaamalla polylinkkeri EcoRI:lla ja geeni BspHI:llä. PIV-3:n HN-geeni, josta puuttui DNA-fragmentti, joka koodaa hydrofo- 30 bista ankkurialuetta, vapautettiin ppivhn-plasmidista (esimerkki 1) leikkaamalla geeni BspHl:llä ja polylinkkeri BamHI:11a. 1,6 Kb EcoRI-BspHI-leikattu RSV:n G-

23 geenifragmentti ja 1,7 Kb BspHI-BamHI-leikattu HN-geenifi-agtrientti eristettiin matalan sulamispisteen agaroosigeeleistä. Kloonausta varten nämä kaksi BspHI-paikkaa mutatoitiin Bluescriptiin perustuvassa nisäkässolun ekspressiovektorissa pmcr20. Mutaatiot sisällytettiin pmcr20:n BspHI-paikkoihin leikkaamalla 5 ekspressiovektori BspHI:llä, käsittelemällä sekä BspHI:llä rajoitettua vektoria että 1,1 Kb fragmenttia, joka vapautettiin Klenow-polymeraasilla, ja sitomalla BspHI:llä päätetty 1,1 Kb fragmentti Bluescriptiin perustuvaan ekspressiovektoriin pm 1- plasmidin tuottamiseksi. Koska tylppäpäiseksi tehdyn 1,1 Kb fragmentin sisällyttäminen nisäkässolun ekspressiovektoriin väärässä suunnassa muuttaisi Amp r-geenin 10 Bluescriptiin perustuvassa ekspressiovektorissa, ainoastaan sellaisten HB101-solujen pesäkkeet, jotka on muodostettu pm'-plasmidin DNA:11a, jossa on tylppäpäiseksi tehty 1,1 Kb fragmentti sopivassa asennossa, jäisivät eloon ampisilliinin läsnäollessa. Plasmidi-DNA puhdistettiin ampisilliinille vastust.uskykyisten HB101-solujen pesäkkeistä, jotka oli muunnettu plasmidilla PM', tasapainosentrifugoinnilla cesium- 15 kloridi-etidiumbromidigradienteissa. 1,6 Kb EcoRI-BspHI-leikattu RSV:n F- ja 1,7 Kb BspHI-BamHI-leikattu PIV-3:n HN-geenifragmentti kloonattiin suoraan pm'- vektorin EcoRI-BamHI-paikkoihin 3-tieligatoinnilla pm 1-RF-HN-plasmidin tuottamiseksi. 20 Jotta voitaisiin palauttaa RSV:n F- ja PIV-3:n HN-geenien erityisiä koodaussekvenssejä, jotka on poistettu leikkaamalla BspHI:llä, BspHI-BspHI-oligonukleotidikasetti (SEQ 1D No: 16), joka sisältää asianomaisia RSV:n F- ja PIV-3:n HN-. geenisekvenssejä, sidottiin BspHI-paikan kautta BspHI:llä rajoitettuun plasmidiin pm-rf-hn-plasmidin tuottamiseksi. Kloonit, jotka sisältävät BspHI- 25 BspHI-oligonukleotidikasetin sopivassa asennossa, tunnistettiin oligonukleotidilinkkerin ja siihen liittyvien alueiden analyysillä. Kimeerisen FRSV - HNp1v_3 -geenin kloonaamiseksi baculovirusekspressiovektoriin pd2 (esimerkki 8) FRSv - HNPIV-3 katkaistu geeni johdettiin ensin pm-rf-hn- 30 plasmidista leikkaamalla plasmidi EcoRI:11a. 3,3 Kb FRsy - HNp1v_3 -geeni kloonattiin sitten baculovirussiirtovektoriplasmidin pd2 EcoRI-paikkaan pd2-rf-hn-

24 plasmidin tuottamiseksi (ATCC 75388). 3,3 Kb EcoRI FRSV HNPIV-3 kimeerisen geenin sopiva asento plasmidiin pd2-rf-hn vahvistettiin sekvenssianalyysillä. Esimerkki 10: 5 Tämä esimerkki esittää kimeerisen FRSV - HNp1v_3 -geenin sisältävien plakkipuhdistettujen rekombinanttibaculoviruksien valmistuksen. Spodoptera frugiperda (Sf9) - soluja tartutettiin 1 g : 11. a villintyyppistä AcNPV-DNA:ta ja 2 pg:lla FRSV - HNP1V-3 - plasmidin DNA:ta (plasmidi pd2-rf-hn-esimerkki 9). Putatiiviset rekombinantti- 10 baculovirukset (puhdistettu kerran sarjalaimennuksella), jotka sisälsivät FRSV kimeerisen geenin, tunnistettiin dot-blot-hybridisoinnilla. Hyönteissolujen lysaatteja, jotka oli tartutettu putatiivisilla rekombinanttibaculoviruksilla, koestettiin 32P-lcimatuilla RSV:n F- tai PTV-3:n HN-geenioligonuklcotidikoettimilla. Rekombinanttibaculovirukset plakkipuhdistettiin kolme kertaa ennen käyttöä ilmentämis- 15 tutkimuksissa. Kaikki menetelmät suoritettiin Summersin ja Smithin menetelmien mukaisesti (esimerkki 6). Esimerkki 11: 20 Tämä esimerkki kuvaa kimeerisen FRSV HNPIV-3 -proteiinin läsnäolon tartutettujen Sf9- ja High 5 -solujen supernatanteissa. Hyönteissoluja (Sf9 ja High 5), joita pidettiin seerumivapaassa väliaineessa EX401, tartutettiin plakkipuhdistetuilla esimerkin 10 mukaisilla rekombinanttibaculoviruksil- 25 la infektiokertoimen ollessa 5 10 pfu/solu. Supernatantit soluista, jotka oli tartutettu rekombinanttibaculoviruksilla, olivat testeissä positiivisia ilmennetyn proteiinin suhteen sekä RSV-F- että PIV-3-HN-spesifisessä ELISA:ssa. Lisäksi supernatantit tartutetuista soluista reagoivat positiivisesti sekä anti-f-rsv monokloonisen vasta-aineen kanssa että anti-hn-peptidiantiseerumin kanssa immunobloteissa. Noin 105 kda:n 30 heikko vyöhyke oli läsnä immunobloteissa. Nämä tulokset vahvistavat kimeerisen

25 FRSV - HNpiv.3 -proteiinin erittymisen Sf9- ja High 5 -solujen supernatanttiin, jotka on tartutettu rekombinanttibaculoviruksilla. Esimerkki 12: 5 Tämä esimerkki kuvaa kimeerisen FRsv - 1{Npiv.3 -proteiinin puhdistuksen tartutettujen High 5 -solujen supernatanteista. High 5 -soluja, joita pidettiin seerumivapaassa väliaineessa, tartutettiin plakkipuhdis- 10 tetuilla esimerkin 10 mukaisilla rekombinanttibaculoviruksilla infektiokertoimen ollessa 5 pfu/solu. Supernatantti viruksella tartutetuista soluista kerättiin kaksi päivää tartunnan jälkeen. Liukoinen FRSV - finpiv.3 kimeerinen protciini puhdistettiin tartutettujen solujen supernatanteista immunoaffiniteettikromatografialla käyttämällä anti-hn-piv-3 monokloonista vasta-ainetta. Anti-HN monoklooninen vasta-aine 15 kytkettiin CNBr-aktivoituun Sepharose 4B:hen tavanomaisilla tekniikoilla. Immunoaffiniteettikolonni pestiin 10 pedin pesupuskuritilavuudella (10 mm Tris-HCI ph 7,5, 150 mm NaC1, 0,02 % v/v Triton-X 100) ennen käyttöä. Näytteen lisäämisen jälkeen kolonni pestiin pesupuskurilla 10 pedin tilavuudella ja sen jälkeen 3 pedin tilavuudella hyvin suolaisella puskuri.11a (10 mm Tris-HC1 ph 7,5, 500 mm NaC1, 20 0,02 % v/v Triton-X 100). Kimeerinen FRSV - HNprv_3 -proteiini eluoitiin immunoaffiniteettikolonnista 100 MM glysiinillä, ph 2,5, kun läsnä oli 0,02 % Triton X- 100:aa. Eluoitu proteiini neutralisoitiin välittömästi 1M Tris-HC1:11ä, ph 10,7. Immunoaffiniteettipuhdistetun FRsv - 1-1Npw_3 -proteiinin polyakryyliamidigeeli- 25 elektroforeesianalyysi (Fig. 16, paneeli A) paljasti yhden pääasiallisen proteiinivyöhykkeen, jolla oli keskimääräinen molekyylipaino 105 kda. Puhdistettu proteiini reagoi sekä anti-rsv-f monokloonisen vasta-aineen että anti-hnpeptidiantiseerumin kanssa immunobloteissa (Fig. 16, paneeli B, kiistat 1 ja 2). 30

26 Esimerkki 13: Tämä esimerkki kuvaa FRSV - piv-3 -proteiinin immunogeenisyyden mersuissa. 5 Neljästä marsusta koostuvien ryhmien marsuihin ruiskutettiin lihaksensisäisesti joko 1,0 tai 10,0 lag kimeeristä FRSV - HNprv.3 -proteiinia, joka oli puhdistettu kuten on kuvattu esimerkissä 12, alumiinifosfaatin avulla. Vertail.ueläinten ryhmiä immunisoitiin joko plasebolla tai elävällä PIV-3:lla tai RSV:lla (annosteltiin nenän kautta). Marsui.sta otettiin verta 2 4 viikkoa ensimmäisen ruiskutuksen jälkeen ja niille an- 10 nettiin 4 viikon kohdalla samanlainen annos antigeeniformulointia. Seeruminäytteitä otettiin myös 2 4 viikkoa toisen annoksen jälkeen. Jotta voitiin arvioida kimeerisen proteiinin kyky saada aikaiseksi PIV-3- ja RSV-spesifisiä vasta-ainevasteita, seeruminäytteistä analysoitiin, oliko läsnä PIV-3-spesifisiä hemagglutinaatiota inhiboivia ja neutralisoivia vasta-aineita, kuten myös RSV:tä neutralisoivia vasta-aineita. Kuten 15 taulukon 1 yhteenvedossa esitetään (taulukko näkyy selityksen lopussa), eläinten seerumeissa, jotka oli immunisoitu kandella 10.1g:n annoksella kimeeristä proteiinia, oli PIV-3-spesifisen hemagglutinaation inhiboinnin (HAI) ja neutralisoivien PIV-3/RSV-vasta-aineiden tiittereitä 6 ja 8 viikon kohdalla, jotka täsmäsivät arvoihin, jotka oli saatu nenän kautta inokuloimalla joko elävää PIV-3:a tai RSV:tä. Li- 20 läksi eläimet immunisoitiin ainoastaan kandella 1 iag:n annoksella kimeeristä proteiinia, joka sai aikaiseksi vahvoja PIV-3- ja RSV-spesifisiä neutralisoivia vastaaineita. Nämä tulokset vahvistivat kimeerisen proteiinin sekä RSV- että PW-3- komponenttien immunogeenisyyden ja vahvistivat, että yksittäinen rekomhinanttiimmunogeeni voi saada aikaan neutralisoivia vasta -aineita sekä RSV:tä että P1V -3:a 25 vastaan. Esimerkki 14: Tämä esimerkki kuvaa FRSV HNprv_3 -proteiinin im.munogeenisyyttä ja suojausky- 30 kyä puuvillarotissa.

27 Kandeksasta puuvillarotasta koostuvien ryhmien rattiin ruiskutettiin suonen sisäisesti joko 1,0 tai 10,0 pg kimeeristä FRSV -proteiinia (valmistettu kuten on kuvattu esimerkissä 12) alumiinifosfaatin avulla. Vertailueläinten ryhmä immunisoitii.n joko plasebolla (PBS alumiinifosfaattia) tai elävällä PIV-3:11a tai RSV:llä (annos- 5 teltiin nenän kautta). Puuvillarotista otettiin verta 4 viikkoa ensimmäisen niiskun jälkeen ja niille annettiin 4 viikon kohdalla samanlainen annos antigeeniformulointia. Seeruminäytteitä otettiin myös 1 viikko toisen annoksen jälkeen. Kuten on esitetty seuraavassa taulukossa 2, tiedot 4 viikon verikokeista osoittivat, että sekä 1 että 10 pg:n annos kimeeristä proteiinia kykeni saamaan aikaan vahvan primäärisen vasteen. 10 Käänteisluvut keskimääräisistä log2 PIV-3-spesifisistä HAI- ja PIV-3:a/RSV:tä neutralisoivista tiittereistä olivat samanlaisia kuin tiitterit, jotka oli saatu elävästä PIV- 3:sta ja RSV:stä. Siten kimeerisen proteiinin yksittäinen inokulointi riitti saamaan aikaan neutralisoivia vasta-aineita sekä PIV-3:a että RSV:tä vastaan. Vahvoja neutralisoivia PIV-3- ja RSV-tiittereitä havaittiin myös toisen annoksen jälkeen (verenot- 15 to 5 viikon kohdalla). Nämä tulokset Ovat lisätadistetta siitä, että kimeerisen proteiinin sekä RSV- että PIV-3-komponentit ovat hyvin irnmunogeenisiä. Jotta voitiin arvioida kimeerisen immunogeenin kyky suojata eläimiä samanaikaisesti sekä RSV:tä että PIV-3:a vastaan, neljälle puuvillarotalle jokaisesta ryhmästä an- 20 nettiin nenän kautta 100 TCID50-yksikköä joko PIV-3:a tai RSV:tä. Eläimet lopetettiin 4 päivää viruksen antamisen jälkeen. Virustiitterit määriteltiin keuhkohomogenisaateista. Kuten on esitetty seuraavassa taulukossa 3, eläimet, jotka immunisoitiin joko 1 tai 10 pg:lla kimeeristä FRSV HNFIv_3 -proteiinia, olivat täydellisesti suojattuja joko PIV-3:a tai RSV:tä vastaan. Nämä tulokset todistavat, että kimeerinen 25 protei.i.ni ei ole ainoastaan hyvin immunogeeninen, vaan kykenee myös samanaikaisesti suojaamaan puuvillarottia sekä PIV-3:n että RSV:n aiheuttamia tauteja vastaan. Esimerkki 15: 30 Tämä esimerkki kuvaa Bluescript M13-SK -vektorin rakentamisen, joka vektori. sisältää kimeerisen Fpw-3 - GRSV -geenin. Tämä kimeerinen geenirakenne sisältää