Täydentävät menetelmät Sivu 1(9) Kiekkomenetelmää täydentävät menetelmät Sisällys Sisällys...1 1. E-testi; MIC-määritys...1 2. Beetalaktamaasimääritys...2 2.1. Apilatesti (amerikkalaisittain: Modified Hodge test MHT...3 2.2. Nitrocefin-testi...4 2.3. ESBL-määritys...5 2.3.1. Kaksoiskiekkotesti...5 2.3.2. Kaksois-E-testi...6 3. Stafylokokkien oksasilliiniresistenssin määritys - MRS, MRSA...6 3.1. Seulonta kiekkomenetelmällä (Liite 1, Liite 3a)...7 3.2. MIC-määritys...7 3.3. PBP2a:n määritys agglutinaatiotestillä...8 3.4. MecA-geenin määritys...8 4. Stafylokokkien vankomysiiniresistenssin määritys...8 5..Enterokokin vankomysiiniresistenssin määritys...9 6. Stafylo- ja streptokokkien indusoituva klindamysiiniresistenssi (MLS B )...9 Alla kuvatut menetelmät ovat CLSI:n mukaisia, paitsi E-testi, jota CLSI:n herkkyysmääritystandardi ei tunne. 1. E-testi; MIC-määritys Lääkkeen pienin estävä pitoisuus (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) kertoo, mikä lääkepitoisuus vähintään tarvitaan estämään bakteerin kasvu. Kun tietyn lääkkeen MIC infektion aiheuttajan suhteen tunnetaan, voidaan, ottamalla huomioon lääkkeen farmakokineettiset ominaisuudet, vakavissa infektioissa säätää lääkkeen annostus tarkemmin sopivaksi kuin pelkän SIR-tulkinnan perusteella. MIC-määrityksellä päästään myös tarkempaan resistenssin tason määritykseen kuin kiekkomenetelmällä. E-testin rinnalle on v. 2008 tullut Oxoidin vastaava tuote. Tuotteen toimivuudesta on toistaiseksi hyvin vähän tietoa. 1.1. Periaate E-testi muodostuu kovasta muoviliuskasta, jonka toiselle puolelle on kiinnitetty lääkegradientti ja toisella puolella on MIC-asteikko, jonka yksikkönä on mg/l. Liuska asetetaan tasaisen bakteeriympin päälle jolloin lääke alkaa liueta ja diffundoitua agariin. Testiliuskan välittömään läheisyyteen stabiloituu pitoisuusgradientti, joka vastaa asteikon lukemia. Inkubaation jälkeen voidan MIC-arvo määrittää tarkastelemalla mihin asti bakteeri asteikolla kasvaa.
Täydentävät menetelmät Sivu 2(9) 1.2. Määritys (perustuu valmistajan ohjeeseen) Elatusaineet, ympit ja testiolosuhteet ovat muutamin poikkeuksin samat kuin kiekkotestissä. E-testin valmistajalla on yksityiskohtaiset ohjeet ja hyvä kuvasarja, joiden avulla testin tulkinta onnistuu vaikeissakin tapauksissa. 1.2.1. Ota testiliuskat pakastimesta huoneen lämpöön ja anna temperoitua (vrt. bakteerilääkekiekot). 1.2.2. Siirrosta tutkittava bakteerikanta asianmukaiselle herkkyysmääritysmaljalle tasaiseksi ympiksi aivan, kuten kiekkoherkkyysmääritystä tehtäessä. 1.2.3. Aseta testiliuska pintakuivalle maljalle ympin päälle siten, että liuska on kauttaaltaan hyvässä kontaktissa maljan pinnan kanssa. Poista mahdolliset ilmakuplat painelemalla liuskaa kevyesti esim. pinseteillä. 1.2.4. Aseta malja kansi alaspäin asianmukaiseen atmosfääriin ja lämpötilaan ja inkuboi yli yön ja tarvittaessa ad. 24 h - ks. kohta 1.3.. 1.2.5. Tarkastele kasvustoa, tarvittaessa suurennuslasilla tai pesäkemikroskoopilla sen selvittämiseksi, missä estovyöhykkeen reuna leikkaa liuskaa - ks. kohta 1.3.. 1.2.6. Tulos: lääkkeen MIC tutkittavalle bakteerikannalle on se lukema, jonka kohdalla estovyöhyke leikkaa testiliuskaa. Jos leikkauspiste on lukemien välissä, kirjataan MICarvoksi lukemista suurempi. 1.2.7. Tulkinta: SIR-tulkinta, ks. liite 3b. 1.3. Erityistä huomioitavaa Useimmissa tapauksissa estovyöhyke on terävärajainen ja sen reunan leikkauspiste liuskalla yksiselitteinen ja selkeä. Eräissä tapauksissa resistenssi ilmenee (kuten kiekkotestissäkin) heterogeenisena, eli hentona kasvuna tai erillispesäkkeinä, jotka tulee huomioida. Inkubaatioajan jatkamainen täyteen vuorokauteen (24 h) on joskus tarpeen heterogeenisen resistenssin toteamiseksi; ks valmistajan ohjeet 1.4. Viitteet Etest technical manual, AB Biodisk, Solna, Sweden. 2. Beetalaktamaasimääritys Beetalaktamaaseiksi kutsutaan bakteerien tuottamia entsyymejä, jotka inaktivoivat beetalaktaamiryhmän bakteerilääkkeitä katkaisemalla tietyn sidoksen lääkemolekyylin ydinosassa. Beetalaktamaasit vaihtelevat substraattispesifiteetiltään joidenkin ollessa erikoistuneita penisilliinien ja toisten taas kefalosporiinien inaktivointiin. Kaikki gramnegatiiviset ja useimmat grampositiiviset bakteerit tuottavat luonnostaan beetalaktamaaseja. Kromosomaalina niiden tuotanto on tiukasti kontrolloitu eikä niillä ole
Täydentävät menetelmät Sivu 3(9) käytännön merkitystä resistenssitekijöinä. Jos kontrolli purkautuu mutaation vaikutuksesta tai jos entsyymiä koodaava geeni irtoaa kromosomista siirtyen plasmidiin, tuottaa bakteeri beetalaktamaasia jatkuvasti ja korkea entsyymipitoisuus johtaa bakteerin resistenssiin niitä beetalaktaameja kohtaan, joita kyseinen enstyymi pystyy inaktivoimaan. Apila- ja Nitrocefin-testit ovat tarpeen ja soveltuvat beetalaktamaasimääritykseen silloin, kun bakteeri erittää entsyymiä ympäristöönsä ja resistenssi ei välttämättä ilmene penisilliini- /ampisilliiniestorenkaan merkittävänä pienenemisenä. Näin on laita stafylokokkien, hemofilusten, neisserioiden ja M.catarrhalis-kantojen suhteen. Kaikkien näiden bakteeriryhmien tuottamat, lähes poikkeuksetta plasmidivälitteiset, beetalaktamaasit ovat luonteeltaan penisillinaaseja. Apila-testi soveltuu myös ainakin enterobakteerien karbapenemaasimääritykseen. Sen toimivuudesta muiden gramnegatiivisten bakteerien karbapenemaasimärityksessä ei ole toistaiseksi näyttöä. Ns. laajakirjoisten beetalaktamaasien (ESBL - Extended Spectrum BetaLactamases) määritykseen apila- ja Nitrocefin-testit eivät sovellu. 2.1. Apilatesti (amerikkalaisittain: Modified Hodge test MHT 2.1.1. Periaate Testi tapahtuu maljalla, jolle on siirrostettu tasaiseksi ympiksi tutkittavalle beetalaktaamille herkkä bakteerikanta (indikaattorikanta), maljan keskelle on asetettu penisilliiniä sisältävä kiekko ja maljan reunalta kohtisuoraan kiekkoon asti siirrostettu runsaana viivasiirroksena tutkittava bakteerikanta. Tutkittavan kannan tuottama beetalaktamaasi hajottaa kiekosta maljaan diffundoituneen beetalaktaamin, mikä ilmenee kyseiselle beetalaktaamille herkän indikaattorikannan kasvuna viivan läheisyydessä. 2.1.2. Määritys (kuva, taulukko) 2.1.2.1.Tee tutkittavalle beeatlaktaamille herkän indikaattorikannan tuoreelta puhdasviljelmältä McFarland 0.5 vahvuinen suspensio keittosuolaan ja siirrosta suspensiota vanutikulla tasaiseksi ympiksi (vrt. kiekkoherkkyysmääritys) maljan keskialueelle niin, että 1.5-2 cm maljan reunasta jää vapaaksi. 2.1.2.2.Aseta maljan keskelle asianmukainen (taulukko) beetalaktaamikiekko painamalle se kevyesti maljan pintaan. 2.1.2.3.Siirrosta tutkittavat bakteerikannat suoraan pesäkkeestä vahvana ymppinä viivaksi alkaen maljan reunalta kiekkoon saakka (kuva). Jokaiseen sarjaan liitetään positiivinen ja negatiivinen kontrolli. 2.1.2.4.Inkuboi maljaa 35 o C:ssa yli yön, tarvittaessa hiilidioksidiatmosfäärissä. 2.1.2.5.Tulos: Bakteeri tuottaa beetalaktamaasia, jos indikaattorikannan estorenkaan reuna taipuu kiekkoa kohti tutkittavan kannan siirrosta myötäillen (kuva). Pienikin taipuminen on merkki beetalaktamaasin tuotosta.
Täydentävät menetelmät Sivu 4(9) 2.1.2.6.Tulkinta: Testin tuloksen ollessa positiivinen, tulee kanta tulkita resistentiksi tietyille beetalaktaameille (taulukko) riippumatta näiden lääkkeiden kiekko- tai MIC-tuloksista.. Kuva Taulukko Tutkittavat bakteerilajit Stafylokokit Haemophilus, Moraxella Penisilliinit Karbapenemaasi Enterobakteerit 1 Penisillinaasi Micrococcus luteus (esim.) E. coli ATCC 25922 Konrollikannat; posit. (+) ja neg. (-) S. aureus ATCC 29213 (+) ATCC 25923 (-) K. pneumoniae ATCC BAA-1705 (+) ATCC BAA-1706 (-) Beetalaktamaasi Bakteerilääkekiekko Penisilliini 10 mcg Ampisilliini 10 mcg Erta-/meropeneemi 10 mcg Indikaattorikanta Tulkinta: R Karbapeneemit 2 2.1.3. Viitteet Kjällander J, Myrbäck KE. A simple test for penicillinase production. Acta Pathol Microbiol Scand 1964;61:494 2.2. Nitrocefin-testi 2.2.1. Periaate Nitrocefin on kliinisesti tehoton, kromogeeninen kefalosporiini, joka inaktivoituu (ja muuttuu samalla keltaisesta punaiseksi) minkä tahansa beetalaktamaasin vaikutuksesta. Nitrocefiniä on tarjolla sekä puhtaana aineena että valmiiksi imupaperikiekkoihin tai liuskoihin imeytettynä. Kaupallisia kiekkoja/liuskoja käytettäessä on noudatettava valmistajan ohjeita. 2.2.2. Määritys 1 Testin toimivuudesta nonfermentatiivisten bakteerien karbapenemaasien osoittamiseen ei ole näyttöä. 2 Jos kannan MIC ertapeneemille on 2 mg/l tai imi-/meropeneemille 4 mg/l, saattaa kyseinen lääke olla tehokas karbapenemaasin tuotosta huolimatta.
Täydentävät menetelmät Sivu 5(9) 2.2.2.1.Imeytä tippa Nitrocefin-liuosta imupaperiin tai kostuta ainetta sisältävä kiekko/liuska vedellä. 2.2.2.2.Siirrosta tutkittavaa bakteeria 1-3 pesäkettä (koosta riippuen) imupaperille. 2.2.2.3.Inkuboi huoneenlämmössä ad. 2 minuuttia. 2.2.2.4.Tulos: Beetalaktamaasin vaikutuksesta keltainen Nitrocefin muuttuu punaiseksi ja tulos on positiivinen. 2.2.2.5.Tulkinta: Positiivinen tulos alussa luetelluilla bakteereilla merkitsee samaa kuin positiivinen apilatestitulos; ks. 2.1.2.6. 2.2.3. Huomautuksia 2.2.3.1.Nitrocefin on huono beetalaktamaasi-induktori ja negatiivinen tulos on luotettava ainoastaan bakteerin tuottaessa entsyymiä jatkuvasti. Stafylokokeilla beetalaktamaasin tuotto voi olla indusoituvaa ja siksi ymppi testiin tulisi ottaa kiekkoherkkyysmaljalta jonkin beetalaktaamikiekon läheisyydestä. 2.2.4. Viitteet Swenson JM, Hindler JA, Peterson LR. Special tests for detecting antibacterial resistance. In: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, et al., eds. Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC: American Society for Microbiology; 1999:1563 77. 2.3. ESBL-määritys ESBL:t ovat TEM-, SHV- OXA- tai CTX-M-sukuisia, plasmidivälitteisiä beetalaktamaaseja. Ne ovat kehittyneet substraattispesifiteetiltään laajakirjoisiksi pistemutaatioiden kautta ja pystyvät pensilliinien lisäksi inaktivoimaan kefalosporiineja ja monobaktaameja (atstreonaami). Kuten TEM- ja SHV-kantaentsyymit, ovat ESBLt estettävissä spesifisillä beetalaktamaasi-inhibiittoreilla, kuten klavulaanihapolla tai tatsobaktaamilla, mihin ominaisuuteen perustuvat alla kuvatut osoitusmenetelmät. E. colitai klebsiellakanta, joka on alentunut herkkyydeltään kolmannen polven kefalosporiinia tai atstreonaamia kohtaan (Liite 3a), on mahdollinen ESBL-tuottaja, minkä varmistaminen voi tapahtua jommalla kummalla alla kuvatulla testillä. 2.3.1. Kaksoiskiekkotesti 2.3.1.1.Suoritus Normaalin kiekkoherkkyysmäärityksen tapaan testataan kannan herkkyys kefotaksiimille ja keftatsidiimille sekä näiden klavulaanihappokombinaatioille ja verrataan estorenkaiden kokoa. Jos klavulaanihappokombinoitu lääkekiekko antaa vähintään 5 mm suuremman eston kuin kiekko, jossa on lääkettä ilman klavulaanihappoa, tuottaa kanta ESBLa. 2.3.1.2.Huomautukset
Täydentävät menetelmät Sivu 6(9) Bakteerin samaan aikaan tuottama inhibiittoriresistentti beetalaktamaasi (esim. ampctyyppi) tai permeabiliteettimutaatio voi maskeerata ESBLn. 2.3.1.3.Viitteet Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Sixteenth International Supplement. CLSI Document M100-S19, Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA. 2009. Steward CD, Rasheed JK, Hubert SK, Biddle JW, Raney PM, Anderson GJ, Williams PP, Brittain KL, Oliver A, McGowan Jr JE, Tenover FC. Characterization of clinical isolates of Klebsiella pneumoniae from 19 laboratories using the NCCLS extended spectrum betalactamase detection methods. J Clin Microbiol 2001;39:2864-72. 2.3.2. Kaksois-E-testi 2.3.2.1.Suoritus Normaalin E-testi-herkkyysmäärityksen tapaan tehdään bakteerille MIC-määritys kefotaksiimille ja keftatsidiimille sekä näiden klavulaanihappokombinaatioille käyttäen tarkoitukseen valmistettuja kaksois-e-testiliuskoja (CT/CTL ja TZ/TZL). Jos klavulaanihappokombinoidulla liuskalla saadaan vähintään 8 kertaa pienempi MIC-arvo kuin liuskalla, jossa on lääkettä ilman klavulaanihappoa, tuottaa kanta klassista ESBLa. 2.3.2.2.Huomautukset Jos bakteeri kasvaa yli kombinaatioliuskan (CTL, TZL) skaalan, ei suhdelukua voida laskea eikä arvioida, tuottaako kanta ESBLa vai ei. Tällöin kannan herkkyys beetalaktaameille ja niiden beetalaktamaasi-inhibiittori-kombinaatioille vastataan kyseisten lääkkeiden herkkyysmääritystulosten mukaan. 2.3.2.3.Viitteet Cormican MG, Marshall SA, Jones RN. Detection of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing strains by the Etest ESBL Screen. J Clin Microbiol 1996;34:1880-4. 3. Stafylokokkien oksasilliiniresistenssin määritys - MRS, MRSA Beetalaktamaasivälitteisen penisilliiniresistenssin lisäksi stafylokokeilla esiintyy resistenssiä myös ns. stafylokokkipenisilliinejä kohtaan, jotka aikanaan kehitettiin kestämään suvun tuottamia beetalaktamaaseja. Tätä resistenssiä kutsutaan ensimmäisen stafylokokkipenisilliin mukaan metisilliiniresistenssiksi ja resistenttiä stafylokokkia lyhenteellä MRS - metisilliinille resistentti stafylokokki. S. aureuksen ollessa kyseessä on lyhenne MRSA. Metisilliiniä ei enää aikoihin ole käytetty hoidossa eikä edes herkkyysmäärityksessä, jossa sen on korvannut toinen stafylokokkipenisilliini: oksasilliini. MRS on stafylokkipenisilliinien lisäksi resistentti kaikille muillekin beetalaktaameille (Liite 7).
Täydentävät menetelmät Sivu 7(9) Oksasilliini(metisilliini-)-resistenssi stafylokokilla johtuu bakteerin hankkimasta mecageenistä, jonka alkuperää ei tunneta. Geenin tuote on bakteerille uusi soluseinän rakennukseen osallistuva entsyymi (ns. PBP2a), jonka toimintaa oksasilliini ja muut beetalaktaamiryhmän lääkkeeet eivät pysty estämään. Toisin sanoen: bakteeri pystyy PBP2a-entsyymillä korvaamaan niiden soluseinää rakentavien entsyymien toiminnan, joita eri beetalaktaamit inhiboivat. PBP2a:n tuoton säätely on hyvin monimutkainen ja siksi PBP2a:n määrä bakteerin solukalvolla vaihtelee suuresti vaikuttaen resistenssin ilmenemiseen. 3.1. Seulonta kiekkomenetelmällä (Liite 1, Liite 3a) 3.1.1. CLSIn mukaan oksasilliini- (1 µg) ja kefoksitiini- (30 µg) kiekot ovat yhtä herkkiä MRSA:n seulontamenetelminä. Kefoksitiinikiekkoa pidetään kuitenkin spesifisempänä, erityisesti koagulaasinegatiivisten kantojen suhteen. 3.1.2. Oksasilliinikiekkoa käytettäessä resistenssi saattaa ilmetä heterogeenisena. Jotta hento kasvu tai pienet pesäkkeet eivät jäisi huomaamatta, suosittelee CLSI Mueller Hinton - maljalle tehdyn määrityksen inkubaatiota täydet 24 tuntia 33-35 o C:ssa. Pitkä inkubaatio on rutiinidiagnostiikassa epäkäytännöllistä ja samaan tulokseen päästään normaalilla yli yön (18 h) inkubaatiolla jos elatusaineeseen on lisätty suolaa vähintään 2 %. Tätä korkeampi suolapitoisuus ei ole tarpeen ja haitallinenkin estäen osaa stafylokokkikannoista kasvamasta. 3.1.3. Kefoksitiinikiekko antaa CLSIn mukaan selkeämmän estorenkaan kuin oksasilliini. Myös kefoksitiiniherkkyys täytyy varmistaa inkuboimalla maljaa täydet 24 h ja tarkastelemalla sitä taittuvassa valossa heterogeenisen kasvun havaitsemiseksi. Kefoksitiinitulkintaa ei pidä vastata, vaan kefoksitiinille herkät kannat tulkitaan oksasilliinille herkiksi. 3.1.4. Käytettiinpä 24 h inkubaatiota tai suolamaljaa, oksasilliini- tai kefoksitiinikiekkoa, beetalaktamaasia runsaasti tuottavat kannat saattavat antaa tulkinnaksi I tai R ja siksi kannan resistenssi täytyy aina varmistaa vähintään E-testillä ja PBP2a-antigeeniosoitustetillä. 3.1.5. Kaikki MRSA-kannat tulee varmistaa meca-geenimäärityksellä. 3.2. MIC-määritys (Liite 3b) Oksasilliini-MIC määritetään E-testillä valmistajan ohjeen mukaan seuraavasti: 3.2.1. Tee tutkittavan kannan puhdasviljelmästä McFarland 0.5 -vahvuinen ymppi keittosuolaan ottaen kasvustoa mahdollisimman läheltä oksasilliinikiekkoa 3.2.2. Siirrosta tasaiseksi ympiksi Mueller Hinton maljalle jossa lisättynä 2 % NaCl 3.2.3. Aseta oksasilliini-e-testiliuska ympin päälle pintakuivalle maljalle välttäen ilmakuplien jäämistä liuskan alle. 3.2.4. Inkuboi 35 o C:ssa ad. 24 h. 3.2.5. Tarkastele estovyöhykettä, tarvittaessa suurennuslasilla tai pesäkemikroskoopilla hennon kasvun ja pienten pesäkkeiden havaitsemiseksi.
Täydentävät menetelmät Sivu 8(9) 3.2.6. Tulos: kannan oksasilliini-mic on se lukema, jonka yläpuolla ei enää näy minkäänlaista kasvua, pienet ja harvassakin sijaisevat erillispesäkkeet huomioiden. HUOM: Lopullinen MIC-tulos tulee lukea vasta 24 h:n inkubaation jälkeen! 3.2.7. Tulkinta (Liite 3b): Suomalaisen kokemuksen mukaan S. aureus-kannat, joiden MIC 64 mg/l ovat käytännössä aina varmistuneet MRSA-kannoiksi, eikä niiltä näinollen välttämättä tarvitse varmistaa meca-geenin olemassaoloa. MIC-tuloksen ollessa 4-8 mg/l eli "matala" R, saattaa kyseessä olla ns. beetalaktamaasin suurtuottaja (BORSA; Borderline Oxacillin- Resistant S. Aureus) eikä lainkaan MRSA. MIC-arvon jäädessä alle I/R-tulkintarajan, ei todennäköisesti kyseessä ole MRS. Näissä tapauksissa tulos tulee varmentaa mecamäärityksellä (3.3.) HUOM: Jos kannan oksasilliini-mic 4 mg/l, voidaan se vastata oksasilliinille resistentiksi vaikka meca-testin tulos olisi negatiivinen! Koska tällöin kyseessä ei kuitenkaan ole MRSA, on vastaukseen syytä liittä kommentti, esim.: Kyseessä on oksasilliiniherkkyydeltään alentunut kanta mutta ei MRSA, eikä siis sairaalahygienisesti täerkeä. 3.3. PBP2a:n määritys agglutinaatiotestillä Määritelmän mukaan kaikki MRS:t omaavat PBP2a:n. Jos testitulos on positiivinen, viittaa se vahvasti MRS:han. PBP2a:n määrä bakteerissa voi kuitenkin vaihdella, eikä negatiiviseksi jäänyt testitulos poissulje MRSA-epäilyä. meca-testillä voidaan varmistaa onko kyseessä MRS. Noudata huolellisesti käyttämäsi testikitin ohjeita. 3.3.1. Tee tutkittavasta bakteerista suspensio poimien kasvustoa oksasilliinikiekon ympäriltä. 3.3.2. Tee testi käyttäen positiivisena kontrollina heteroresistenttiä MRSA-kantaa (esim. ATCC 43300). 3.3.3. Tulos: Selkeä agglutinaatio kertoo PBP2a:n läsnäolosta ja tulos on positiivinen. 3.3.4. Tulkinta: Jos tulos on ollut selkeä positiivinen ja kannan oksasilliini-mic tulkinnaltaan R, on kanta MRS. Jos agglutinaatiotulos on epäselvä tai tulos on ristiriitainen E-testituloksen kanssa, on kannasta syytä tehdä meca-määritys. 3.4. MecA-geenin määritys MecA-geenin läsnäolo stafylokokilla määritetään PCR-menetelmällä. Menetelmä on spesifinen ja sen tulos kertoo varmuudella, onko kanta MRS vai ei. 4. Stafylokokkien vankomysiiniresistenssin määritys Kiekkotesti on todettu sopimattoman epäherkäksi vankomysiiniherkkyydeltään alentuneiden stafylokokkikantojen herkkyysmääritykseen. Vankomysiinille täysin resistentit S. aureus -
Täydentävät menetelmät Sivu 9(9) kannat, ns. VRSA-kannat, joilla resistenssin mekanismi on sama kuin VRE:lla (vanageeni), kasvavat kiinni 30 mcg vankomysiinikiekkoon, joten ne kiekkomenetelmällä kyllä löytyvät. Stafylokokkien vankomysiiniresistenssi voidaan luotettavimmin määrittää E-testillä käyttäen BHI-agaria ja riittävän pitkää inkubaatiota (24 h); ks. testin valmistajan ohje. 5. Enterokokin vankomysiiniresistenssin määritys Enterokokin vankomysiinireistenssi seulotaan kiekkomenetelmän avulla. Epäilyttävälle (vankomysiini I/R tai vankomysiiniestorenkaan reuna häipyvä) kannalle tehdään MICmääritys E-testillä huolellisesti valmistajan ohjeiden mukaan. Myös kannan tunnistus on syytä tehdä tarkkaan, sillä eräillä harvinaisilla enterokokkilajeilla vankomysiiniresistenssiä esiintyy luonnostaan. Vankomysiiniherkkyydeltään alentuneet kannat on syytä lähettää referenssilaboratorioon geneettistä testausta varten. 6. Stafylo- ja streptokokkien indusoituva klindamysiiniresistenssi (MLS B ). 6.1. Stafylo- streptokokeilla esiintyy indusoituvaa klindamysiiniresistenssiä (indusoituva MLS B - resistenssi),joka ilmenee kiekkotestissä erytromysiiniresistenssinä klindamysiiniestorenkaan jäädessä suureksi. Asettamalla klindamysiini- ja erytromysiinikiekot kiekottajassa vierekkäisiin paikkoihin, ilmenee resistenssi maljalla klindamysiiniestorenkaan litistymisenä erytromysiinikiekon puolella. Ilmiö johtuu siitä, että erytromysiini toimii resistenssin induktorina. Tällainen kanta tulee klindamysiiniestorenkaan halkaisijasta riippumatta tulkita resistentiksi klindamysiinille. 6.2. Jotta resistenssitieto siirtyisi Finres-tietokantaan, on klindamysiinitulos (=estorenkaan halkaisija) merkittävä R:ksi riippumatta siitä, mikä estorenkaan halkaisija todellisuudessa on.