Glykoproteiinihormonien analytiikka Henrik Alfthan HUSLAB Kliinisen kemian laitos
Glykoproteiinihormonit Rakenne Molekyylimuodot Määritystekniikat Menetelmien kehitys Määritysongelmat
Yazaki K et. al. Am J Obstet Gynecol 138:189, 1980
Wide L et. al. JCEM 76:885, 1993
IFCC työryhmä hcg-määritysten standardoimiseksi Peter Berger, Innsbruck Jean-Michel Bidart, Paris Steven Birken, New York Rudolf Lequin, Eindhoven Rob Norman, Adelaide Cathie Sturgeon, Edinburgh (secretary) Ulf-Håkan Stenman, Helsingfors (chairman)
hcg-työryhmän tehtävät Uudet standardit Selkeä nimikkeistö Epitooppikartta Referenssimenetelmät?
Istukkagonadotropiini Standardit ja lyhenteet hcg, CG, human chorionic gonadotropin hcgβ: vapaa β-ketju hcgα: vapaa α-ketju hcgβcf: vapaan β-ketjun core fragmentti hcgn: nicked hcg, katkos aa 42-48 β- ketjussa hcgβn: nicked hcgβ
3D epitope map of hcg hcgβ hcgα hcgβctp P.Berger 2000
Menetelmien kehitys Vasta-aineet Immunisointi (pudistetulla) antigeenillä Vasta-aineiden puhdistus Vasta-aineiden karakterisointi
Birken S et. Al. Methods 21, 3 (2000)
Sandwich immunoassay
solidi F16-6G5 F16-6G5 F16-6G5 hcg hcgß hcgßcf F144-2G2 469 1326 134416 F144-6G8 833 2214 193641 F52-3C11 524 690 176914 F142-7F3 238 1436 267 F144-12E4 479 31719 51 F140-2F6 4257 27391 165 F143-1C10 27449 1137 57 F140-11C5 171935 2032 0 F132-13C11 156902 141 209 F132-9F10 12136 5152 256 F130-8D4 175827 12994 147 F140-5E2 71498 179408 260889 F19-9C11 21129 693920 48958 F94-8F8 1264 34480 15374 F132-3C10 1124 408 1714 F95-5C4 0 0 416 F95-1E8 1155 0 50 F95-1B2 22 0 1036 F20-4E7 3408 33702 8315 F20-6E11 3206 25717 36 F144-4F10 58 0 0
solidi F16-6G5 F16-6G5 F16-6G5 hcg hcgß hcgßcf F144-2G2 469 1326 134416 F144-6G8 833 2214 193641 F52-3C11 524 690 176914 F142-7F3 238 1436 267 F144-12E4 479 31719 51 F140-2F6 4257 27391 165 F143-1C10 27449 1137 57 F140-11C5 171935 2032 0 F132-13C11 156902 141 209 F132-9F10 12136 5152 256 F130-8D4 175827 12994 147 F140-5E2 71498 179408 260889 F19-9C11 21129 693920 48958 F94-8F8 1264 34480 15374 F132-3C10 1124 408 1714 F95-5C4 0 0 416 F95-1E8 1155 0 50 F95-1B2 22 0 1036 F20-4E7 3408 33702 8315 F20-6E11 3206 25717 36 F144-4F10 58 0 0
solidi F16-6G5 F16-6G5 F16-6G5 hcg hcgß hcgßcf F144-2G2 469 1326 134416 F144-6G8 833 2214 193641 F52-3C11 524 690 176914 F142-7F3 238 1436 267 F144-12E4 479 31719 51 F140-2F6 4257 27391 165 F143-1C10 27449 1137 57 F140-11C5 171935 2032 0 F132-13C11 156902 141 209 F132-9F10 12136 5152 256 F130-8D4 175827 12994 147 F140-5E2 71498 179408 260889 F19-9C11 21129 693920 48958 F94-8F8 1264 34480 15374 F132-3C10 1124 408 1714 F95-5C4 0 0 416 F95-1E8 1155 0 50 F95-1B2 22 0 1036 F20-4E7 3408 33702 8315 F20-6E11 3206 25717 36 F144-4F10 58 0 0
solidi F16-6G5 F16-6G5 F16-6G5 hcg hcgß hcgßcf F144-2G2 469 1326 134416 F144-6G8 833 2214 193641 F52-3C11 524 690 176914 F142-7F3 238 1436 267 F144-12E4 479 31719 51 F140-2F6 4257 27391 165 F143-1C10 27449 1137 57 F140-11C5 171935 2032 0 F132-13C11 156902 141 209 F132-9F10 12136 5152 256 F130-8D4 175827 12994 147 F140-5E2 71498 179408 260889 F19-9C11 21129 693920 48958 F94-8F8 1264 34480 15374 F132-3C10 1124 408 1714 F95-5C4 0 0 416 F95-1E8 1155 0 50 F95-1B2 22 0 1036 F20-4E7 3408 33702 8315 F20-6E11 3206 25717 36 F144-4F10 58 0 0
solidi F19-9C11 F19-9C11 F19-9C11 hcg hcgß hcgßcf F144-2G2 F144-6G8 F52-3C11 57 38 62 F142-7F3 21 797 21 F144-12E4 145 301 26 F140-2F6 14 105 220 F143-1C10 33 398 72 F140-11C5 0 43 0 F132-13C11 0 268 0 F132-9F10 932 4780 36 F130-8D4 0 0 0 F140-5E2 12 343 114 F19-9C11 F94-8F8 128 23 142 F132-3C10 300 9822 567 F95-5C4 5038 130376 3194 F95-1E8 3479 161301 4221 F95-1B2 6162 211771 8612 F20-4E7 4708 192136 360 F20-6E11 F144-4F10 263 5378 1632
solidi F19-9C11 F19-9C11 F19-9C11 hcg hcgß hcgßcf F144-2G2 F144-6G8 F52-3C11 57 38 62 F142-7F3 21 797 21 F144-12E4 145 301 26 F140-2F6 14 105 220 F143-1C10 33 398 72 F140-11C5 0 43 0 F132-13C11 0 268 0 F132-9F10 932 4780 36 F130-8D4 0 0 0 F140-5E2 12 343 114 F19-9C11 F94-8F8 128 23 142 F132-3C10 300 9822 567 F95-5C4 5038 130376 3194 F95-1E8 3479 161301 4221 F95-1B2 6162 211771 8612 F20-4E7 4708 192136 360 F20-6E11 F144-4F10 263 5378 1632
Antibody reactivity with hcgβn Tracer-Eu Solid 6G5 F94-14E5 F93-5G2 F20-6E11 9C11 0-sample 270 1200 500 645 hcgßn (2000 pmol/l) 320000 250000 190000 3624 hcgß intact (2000 pmol/l) 280000 230000 170000 205591 hcg (2000 pmol/l) 4400 4400 1600 1961
Antibody reactivity with hcgβn Tracer-Eu Solid 6G5 F94-14E5 F93-5G2 F20-6E11 9C11 0-sample 270 1200 500 645 hcgßn (2000 pmol/l) 320000 250000 190000 3624 hcgß intact (2000 pmol/l) 280000 230000 170000 205591 hcg (2000 pmol/l) 4400 4400 1600 1961
Istukkagonadotropiini Kliininen käyttö Raskausdiagnostiikka Raskaustestit Raskauskomplikaatiot Downin syndrooma Syöpädiagnostiikka Istukkasyöpä ja rypäleraskaus Gastrointestinaalisyöpä Gynekologinen syöpä
Serum hcg and hcgβ in nonpregnant women and men FEMALES MALES 25 25 hcg (pmol/l) 20 15 10 5 20 15 10 5 0 0 10 10 hcgβ (pmol/l) 8 6 4 8 6 4 2 2 0 <30 30-39 40-49 50-59 60-69 >70 0 <30 30-39 40-49 50-59 60-69 >70 Age (years) Age (years)
Serum hcg during early fetal loss and abortion Two individuals 1000000 100000 10000 hcg ( IU/ L) 1000 100 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Days af t er LMP
Serum hcg and hcgβ during treatment of choriocarcinoma Levonova Hysterectomy Lung metastases 1000000 1000000 100000 100000 hcg (pmol/l) [ ] 10000 1000 100 10 10000 1000 100 10 hcgβ (pmol/l) [ ] 1 1 250 300 Days 400 500 1
1.0.9 Survival probability.8.7.6.5.4.3 hcgβ <2.0 pmol/l 21 died, 82 censored.2.1 0.0 0 p<0.001 12 24 Time (months) Figure 1. Survival curves for ovarian cancer patients presenting with a preoperative hcgß concentration < or 2 pmol/l. 36 hcgβ 2.0 pmol/l 34 died, 9 censored 48 60 72
Frequency of elevated serum levels of hcgβ in pancreatic diseases CA19-9 CEA hcgβ (%) (%) (%) Benign diseases 28 8 9 Pancreatic cancer 90 50 72
Aiheita pohdiskeluun Menetelmien herkkyys Menetelmien spesifisyys Mittausalue Ristireaktiot Eri molekyylimuodot Analyytin labiilisuus
Sensitivity of various pregnancy tests hcg (IU/L) 0 10 20 30 40 50 60 AuraTek OriPreg Concise Plus Clearview II Biocard hcg U Biocard hcg S/U Rapipreg
Recognition of hcgβ Sample description: Base pool spiked with hcgb IRP 75/551. Expected response in an assay recognizing hcg and hcgβ on an equimolar basis is 388 IU/L. Total Methods Method Development 124 In-house Dab RIA, L/P (1) 248 Tosoh-A1A (Total) 251 Bayer Immuno-I 311 Bayer ADVIA Centaur (New) 319 In-house Dab RIA, L/P (2) 320 Bayer ACS: 180 (New) 324 Bayer ACS: 180 (Old) 326 Bayer ADVIA Centaur (Old) 347 Socolab PCx 366 Abbott Architect 380 Roche ElecSys (Total) 387 Roche Cobas Core 461 Beckman Access 521 Abbott AxSYM 528 Abbott IMx (Total) 566 DPC Immulite 584 J&J Vitros Eci 630 DPC Immulite 2000 670 Roche Enzymun 874 UKNEQAS, November 14th, 2000
Recognition of hcgβ Sample description: Base pool spiked with hcgβ IRP 75/551. Expected response in an assay recognizing hcg and hcgb on an equimolar basis is 388 IU/L. Intact Methods Behring DADE Dimension -2 BioMérieux Vidas -1 Wallac Delfia 2 Roche ElecSys (Intact) 6 Biochem MAIAclone 30 Tosoh-AIA (Intact) 118 UKNEQAS, November 14th, 2000
Stability of hcg in pregnancy serum 100000 +4C Concentration (pmol/l) 10000 1000 hcg hcga hcgß 100,1 1 10 100 1000 Time (h)
100000 +20C Concentration (pmol/l) 10000 1000 hcg hcga 100,1 1 10 Time (h) 100 hcgß 1000
100000 +37C Concentration (pmol/l) 10000 1000 hcg hcga 100,1 1 10 Time (h) 100 hcgß 1000
Epäspesifiset häiriötekijät Suola ja ph EDTA ja sitraatti Proteiinieffekti Komplementti Ei IgG2 vasta-aineita* Humaanivasta-aineita eläimiä vastaan Heterofiiliset vasta-aineet Reumatoidifaktori Human anti-mouse antibodies (HAMA) * Bormer OP. J Immunol Methods 1989;121:85
Potilastapaus Direct hcg (IU/L) 2213 LHspec (IU/L) 56 LH (IU/L) >6500 FSH (IU/L) 77 PRL (mu/l) 1244 hcgβ (pmol/l) >16000 hcgα (pmol/l) >36000 hgh (mu/l) >453 PSA (µg/l) 56
1000 hcg LHspec LH* FSH PRL hcgß* hcga* hgh* Recovery (%) 100 10 1 10 100 1000 Dilution factor
After Ref. Direct dil 1:2 values NMS hcg (IU/L) 2213 19,7 <5 LHspec (IU/L) 56 12,2 1-75 LH (IU/L) >6500 14,9 1-75 FSH (IU/L) 77 9,1 1-20 PRL (mu/l) 1244 171,4 100-500 hcgβ (pmol/l) >16000 654 <2 hcgα (pmol/l) >36000 1542 <40 hgh (mu/l) >453 9,1 <12 PSA (µg/l) 56 2,2 <0,1
Solid: 5008 Sample (1:100) Rabbit anti-human-igm (µ-chain) Tracer: Swine anti-rabbit-igg-eu 9 8 7 6 5 Patients 4 3 2 1 Mean+SD A.P. R.U. 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 Fluorescence (cps)
Seerumi vai virtsa? Biologinen yhdiste metaboloituu kehossa Seerumin ja virstan pitoisuudet eivät välttämättä korreloidu Korrelaatiot menetelmäkohtaisia Spesifisyys
Korrelaatio seerumin ja virtsan hcg-pitoisuuksien välillä raskauden aikana U-hCG (IU/L, uncorrected) 10000 U-hCG (IU/L, corrected) 10000 y = 55 + 0,72x R = 0,94 1000 1000 100 100 10 10 1 1 10 100 1000 S-hCG (IU/L) 10000 1 1 10 100 S-hCG 1000 10000
Luteinisoiva hormoni (LH) Glykoproteinihormoni Heterodimeeri, α- ja β-alayksikkö Seerumissa pääasiallinen muoto intakti αβ-dimeeri Virtsassa esiintyy vaihtelevassa suhteessa LH, LHβ, LHβcf
40 LH DELFIA LHspec DELFIA LH immunoreactivity (IU/L) 30 20 10 0-30 -20-10 0 10 Day of cycle
100 +4C LH (IU/L) 10 1 0 20 40 60 80 Days of storage 100 120
100-20C LH (IU/L) 10 1 0 20 40 60 80 Days of storage 100 120
Ongelmien välttäminen Preanalyyttiset tekijät Menetelmien valinta Ongelmien tiedostaminen Työkalupakki