Konsortiohnke Puuntuhkn vikutus humuskerroksen mikrobistoon kngsmll Hnnu Fritze Jonn Perkiömäki Metsätehon rportti 82 17.12.1999
Puuntuhkn vikutus humuskerroksen mikrobistoon kngsmll Hnnu Fritze Jonn Perkiömäki Metsätehon rportti 82 17.12.1999 Konsortiohnke: Fortum Power nd Het Oy, Metsähllitus, Metsäliitto Osuuskunt, Metsäteollisuus ry, Pölkky Oy, Stor Enso Oyj, UPM Kymmene Oyj, Vpo Timber Oy Kirjoittjien yhteystiedot: Metsäntutkimuslitos Vntn tutkimuskeskus PL 18, 01301 Vnt Puhelin: (09) 857 051 Asisnt: tuhk, kdmium, mikrobit Metsäteho Oy Helsinki 1999
SISÄLLYS ALKUSANAT... 3 TIIVISTELMÄ... 4 1 TAUSTAA... 5 1.1 Puuntuhk j sen hyödyntäminen...5 1.2 Tuhkn lnnoitekäytön tutkimustrve...5 2 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA TOTEUTUS... 6 2.1 Tvoitteet j koejärjestelyt...6 2.2 Menetelmät...7 3 TULOKSET... 8 3.1 Humuskerroksen ph...8 3.2 Humuskerroksen mikrobiologinen ktiivisuus...11 3.3 Bkteerien Cd-tolernssi...13 3.4 Mikrobibiomss...13 3.5 Mikrobiyhteisö...14 4 TULOSTEN TULKINTA... 15 KIRJALLISUUS... 16 Metsätehon rportti 82 17.12.1999 2
ALKUSANAT Metsäteollisuusyritykset pyysivät 1995 Metsäteho selvittämään sitä, mitä tutkimuksi j kehittämistoimi pitäisi tehdä, jott luotisiin edellytykset suurien voimlitosten tuottmn etupäässä puuperäisen tuhkn ljmittiselle metsäkäytölle. Selvitystyön johdost käynnistettiin vuoden 1996 lopull Metsätehon koordinoimn Biotuhkn hyödyntäminen metsänprnnusineen -hnke. Hnkkeess tutkitn erityisesti tuhkn metsäkäytön ympäristövikutuksi, kuten rvinteiden huuhtoutumist j vikutust vesiin, tuhkn vikutust mrjojen j sienien rsksmetllipitoisuuksiin sekä mperän mikro-orgnismeihin. Teknistloudellisten tutkimusten j kokeilujen tehtävänä puolestn on tuott tieto mm. tuhkn esikäsittelystä j hyödyntämisen tekniikoist j tloudest. Tuhkhnke on 3-vuotinen j päättyy vuoden 1999 lopuss. Hnkkeen rhoittjt ovt Fortum Power nd Het Oy, Metsäliitto Osuuskunt, Metsähllitus, Metsäteollisuus ry, Pölkky Oy, Stor Enso Oyj, UPM Kymmene Oyj, Vpo Timber Oy j TEKES. Hnkkeess tutkimuksi suorittvt orgnistiot ovt Helsingin yliopisto, Kuopion yliopisto, Oulun yliopisto, Metsäntutkimuslitos, Metsäteho Oy sekä Riist- j kltlouden tutkimuslitos. Tässä rportiss esitetään Metsäntutkimuslitoksen Vntn tutkimusyksikössä FT Hnnu Fritzen johdoll tehdyt tutkimukset, jotk koskivt tuhklnnoituksen mikobistovikutuksi kngsmll. Helsinki 10.10.1999 Antti Korpilhti Tuhkhnkkeen koordinttori Metsätehon rportti 82 17.12.1999 3
TIIVISTELMÄ Tuhkn sisältämien rsksmetllien mhdollisi hittoj ei riittävästi tunnet. Vrsinkin Cd on erittäin myrkyllinen ine. Tuhkss se on enimmäkseen oksidin (CdO) j säilyy mstoss pitkään liukenemttomss muodoss tuhkn ph:t nostvn vikutuksen j oksidimuodon hidsliukoisuuden tki. Metsämn sienet j bkteerit hjottvt orgnist inest j vputtvt siten krikkeeseen sekä humukseen sitoutuneet rvinteet ksvien käyttöön. Metsämn mikrobit ovt tottuneet toimimn hppmss ympäristössä, sillä Suomess metsämn humuksen luontinen ph on n. 4. Tuhk on emäksistä j nost humuksen ph:t 1 2 yksikköä levitysmäärästä riippuen. Tutkimuksen tvoitteen oli rvioid pöly- j itsekovetetun puuntuhkn eri nnostustsojen välitöntä vikutust metsämn humuskerroksen mikrobitoimintn sekä kdmiumin hitllisuutt humuskerroksen mikrobitoiminnlle. Kokeet tehtiin Muhoksell khdell rvinteisuudeltn erilisell ksvupikll, jotk olivt kuivn knkn (ECT, vriksenmrj-knervtyyppi) j tuoreen knkn (VMT, puolukk-mustikktyyppi) metsiköt. Tuhklnnoitus iheutti eri metsätyypeillä smnsuuntiset muutokset. Humuskerroksen ph nousi j pölytuhk vikutti enemmän kuin itsekovetettu tuhk j muutokset korreloivt tuhkn levitysmäärän knss. Mikrobiktiivisuus ksvoi j mikrobiyhteisön rkenne muuttui. Pölytuhk iheutti itsekovetettu tuhk tehokkmmin mitttuj muutoksi. Tuhkn sisältämä kdmium ei kuitenkn iheuttnut vuodess hitllisi muutoksi metsämn mikrobistoon. Kdmiumin määrän vikutust tutkittiin lisäksi erillisellä Cd-lisäyksellä. Se osoitti, että kdmiumin määrä tuhkss ei korreloinut bkteeriyhteisön muutosten eikä mikrobiyhteisön hengitysktiviteetin knss. Metsätehon rportti 82 17.12.1999 4
1 TAUSTAA 1.1 Puuntuhk j sen hyödyntäminen Suomen teollisuudest on rvioitu tulevn vuosittin 250 000 300 000 tonni tuhk. Metsäteollisuudess syntyy puhdst puu- j kuorituhk noin 100 000 tonni vuodess. Tuhkn lkuinekoostumus vihtelee runssti mm. käytetyn polttoineen j -tekniikn mukn, mutt yleensä tuhk sisältää runssti ksvinrvinteit. Tuhk on mm. metsätloudelle mhdollinen lnnoite- ti mnprnnusine. Puuntuhkll voitisiin Suomess lnnoitt noin 25 000 hehtri metsää jok vuosi. Metsien tuhklnnoitukseen on tunnettu vihtelev mielenkiinto Suomess jo 1930-luvult lähtien. Puuntuhkn suotuis j pitkäikinen vikutus puuston kehitykseen ojitetuill turvemill, entisillä suopelloill j turpeennostokenttien pohjill perustuu sen monipuoliseen j tspinoiseen rvinnesisältöön sekä kykyyn neutrloid mperää. Mn hjotustoimint tehostuu j turpeen luontiset rvinnevrt, lähinnä typpi, stetn näin puiden käyttöön. Puuntuhk sisältää typpeä j rikkiä lukuun ottmtt puuston trvitsemi rvinteit likimin smss suhteess kuin ne ovt sitoutuneen puustoon. Kngsmill typpi on yleensä puuston ksvu rjoittv minimirvinne, joten tuhkn vikutus jää niillä vähäiseksi. Hppmn lskeumn hittojen torjunnss j luontisen hppmoitumisen estämisessä tuhkn käyttö on kngsmillkin perusteltu. 1.2 Tuhkn lnnoitekäytön tutkimustrve Tuhkntuottjien tholl kiinnostus tuhkn on ksvnut viime ikoin. Pölytuhkn käsittely j levitys on hnkl, minkä vuoksi metsien tuhklnnoitus on ollut vähäistä. Tuhkn rkeistminen ti itsekovettuminen on välttämätön edellytys tuhkn ljmittisemmlle käytölle. Rkeistuksess ti itsekovettumisess tuhk muuttuu hitmmin liukenevksi, minkä seuruksen tuhklnnoituksen ph-shokki pintksvillisuudess j mperässä lievenee. Tuhkn sisältämien rsksmetllien mhdollisi hittoj ei riittävästi tunnet. Vrsinkin tuhkn sisältämä kdmium (Cd) on ollut keskustelun iheen, sillä uuden lnnoitelin nojll nnettvien säädösten vlmistelun yhteydessä on ehdotettu mnprnnusineen kdmiumpitoisuuden ylärjksi 1,5 mg kg -1 kuiv-inett (k..). Puuineksen luontisesti sisältämä Cd konsentroituu poltettess tuhkn, jonk Cd-pitoisuus vihtelee 4 20 mg kg -1 k.. Cd on erittäin myrkyllinen rsksmetlli, jonk kierto j vikutus metsäluonnoss tulisi trkkn tunte. Tuhkss kdmium on enimmäkseen oksidin (CdO) j säilyy mstoss pitkään liukenemttomss muodoss tuhkn ph:t nostvn vikutuksen j oksidimuodon hidsliukoisuuden tki. Lähtiessään liikkeelle biologisen j geokemillisen rputumisen seuruksen Metsätehon rportti 82 17.12.1999 5
kdmium stt sitoutu humukseen, kulkeutu ksveihin, kerääntyä mrjoihin j sieniin ti poistu metsäekosysteemistä huuhtoutumll. Pitsi korken myrkyllisyytensä, myös vikesti ennustettvn käyttäytymisensä tki Cd ero huomttvsti muist rsksmetlleist. Tuhkn Cd jkntuu ekosysteemin eri osiin, j siten sen pitoisuus pienenee häviten luonnolliseen vihteluun. Tutkimuksess levitettävän tuhkn Cd-pitoisuutt on siten keinotekoisesti lisättävä, jott Cd:n kierto, kiertonopeus sekä toksisuus metsäekosysteemissä voidn rvioid. 2 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET JA TOTEUTUS 2.1 Tvoitteet j koejärjestelyt Tutkimuksen tvoitteen on rvioid 1) pöly- j itsekovetetun puuntuhkn eri nnostustsojen välitöntä vikutust metsämn humuskerroksen mikrobitoimintn sekä 2) puuntuhkss esiintyvän kdmiumin hitllisuutt humuskerroksen mikrobitoiminnlle. Metsämn sienet j bkteerit hjottvt orgnist inest j vputtvt siten krikkeeseen sekä humukseen sitoutuneet rvinteet ksvien käyttöön. Metsämn mikrobit ovt tottuneet toimimn hppmss ympäristössä, sillä Suomess metsämn humuksen luontinen ph on n. 4. Tuhk on emäksistä j nost humuksen ph:t 1 2 yksikköä levitysmäärästä riippuen. Humuksen ph:n muutos vikutt mikrobien ktiivisuuteen j ljistoon. Kokeiss käytettiin Oy Metsä-Botni Ab:n Äänekosken tehtn tuhk, jok on peräisin pääosin koivun j männyn kuorest. Tehtävä 1. Tutkimuksess verrtn pölytuhkn j itsekovetetun tuhkn iheuttmi muutoksi humuskerroksen mikrobistoon khdell rvinteisuudeltn erilisell ksvupikll. Kohtein ovt Metsäntutkimuslitoksen Muhoksen tutkimussemn läheisyyteen 1997 perustetut kuivn knkn (ECT = vriksenmrjknervtyyppi, Lummelmpi) j tuoreen knkn (VMT = puolukkmustikktyyppi, Sdinselkä) kokeet. Metsikkökokeet koostuvt viidestä käsittelystä kolmen toiston: Kontrolli (K) Pölytuhk 3 000 j 9 000 kg h -1 (PT3 j PT9) Itsekovetettu tuhk 3 000 j 9 000 kg h -1 (IT3 j IT9) Koeloj on yhteensä 30. Metsätehon rportti 82 17.12.1999 6
Tehtävä 2. Cd-tutkimust vrten on perustettu metsikkökoe kuivhkolle knklle (EVT; Cd-koe) Muhoksen tutkimussemn läheisyyteen syksyllä 1997. Koe koostuu kolmest käsittelystä kolmen toiston: Kontrolli (K) Puuntuhk 3 000 kg h -1 (PT3) Puuntuhk (3 000 kg h -1 ) + CdO (n. 400 mg kg -1 tuhk) (PT3+Cd) Koeloj on yhteensä 9. Tuhkn on lisätty kdmiumi niin, että sen Cd-pitoisuus on n. 10 20 -kertinen tuhkn normlipitoisuuksiin verrttun. Kokeiss käytetyn tuhkn lkuinepitoisuudet olivt (15 näytteen keski- rvot): Cd Cu Mn Zn Al C Fe Mg P K mg kg -1 mg g -1 15 72 10 2,6 12 354 9,3 17 9,1 27 Itsekovettuneen tuhkn vesipitoisuus oli 30 % pinost. 2.2 Menetelmät Kikkien koelojen (39 kpl) koko on n. 30 x 30 m. Näytteet otettiin humuskirll kertnäytteenotton 1-1,5 vuott lnnoituskäsittelyjen jälkeen elokuuss 1998. Jokiselt koellt kerättiin kolmelt linjlt yhteensä 21 humusnäytettä (7/linj), jotk yhdistettiin yhdeksi kokoomnäytteeksi. Siten tutkimuksess oli yhteensä 39 näytettä. Jokinen näyte seulottiin (4 mm) j krikekerros, juuret sekä vihreät ksvinost poistettiin näytteistä. Smll näytteet homogenisoituivt. Humusnäytteistä mitttiin ph vesisuspensiost (1/2), kuivmss j orgnisen ineen pitoisuus hehkutushäviönä. Biologisist muuttujist näytteistä määritettiin mikrobien ktiivisuus j biomss, sieni/bkteeri-suhde sekä bkteerien yhteisömuutokset suhteess käsittelyihin. Mikrobien ktiivisuutt määritettiin ksukromtogrfisesti mittmll humusnäytteen CO 2 -tuotto tietyssä ikyksikössä (Pietikäinen j Fritze 1995). Juurihengityksen osuus oli poistettu näytteestä seulomll humus 4 mm seuln läpi. Mikrobibiomss, sieni/bkteeri-suhde j bkteeriyhteisön muutokset määritettiin uuttmll humusnäytteistä mikrobeille spesifiset soluklvon rsvhpot (Phospho- lipid Ftty Acid; PLFA), jotk identifioitiin lopullisesti ksukromtogrfisesti (Pennnen ym. 1998). Uutettujen rsvhppojen summ (PLFA totli ) korreloi mikrobibiomssn knss. Sienille spesifinen rsvhppo (PLFA sieni ) korreloi näytteessä olevn sienibiomssn j bkteerispesifisten rsvhppojen summ (PLFA bkteeri ) korreloi bkteeribiomssn (Frostegård j Bååth 1996). Jos käsittelyt ovt muuttneet mikrobiyhteisön rkennett, niin Metsätehon rportti 82 17.12.1999 7
se näkyy rsvhppospektreissä eli uutettujen rsvhppojen suhteest toisiins. Sen selvittämiseksi nlysoitiin rsvhppoineisto monimuuttujmenetelmällä; knonisell erottelunlyysillä. Anlyysin grfisess trksteluss toisin muistuttvt näytelt tulostuvt lähekkäisinä pisteinä ineiston päävihtelusuunti kuvville kseleille. Lisäksi näytteiden bkteerimäärä lskettiin mikroskooppisesti, jot vrten humusnäytettä limennettiin vedellä j bkteerit värjättiin kridiiniornssill (AO). Ainostn ympäristön muutokseen sopeutunut mikrobiyhteisö pystyy ylläpitämään metsäekosysteemissä trvittv rvinnekierto. Siten mikrobien, tässä tpuksess bkteerien, kyky sopeutu tuhkn mhdollisesti korkeisiin Cdpitoisuuksiin on erittäin tärkeä. Bkteerit kehittävät rsksmetllej vstn sietokykyä mikäli joutuvt niiden knss kosketukseen (Pennnen ym. 1996). Kdmiumin myrkyllisyyttä vertiltiin rdioktiivisesti leimtun 3 H-tymidiinin kertymismenetelmällä (Pennnen ym. 1996, 1998, 1998b). Tymidiini on solun perintöineen DNA:n rkenneos j bkteerit ottvt tymidiinin mieluummin ksvuympäristöstään kuin syntetisoivt sitä itse. 3 H-tymidiinin sitoutuminen solun DNA:hn riippuu solun DNA-synteesin nopeudest, mikä on puolestn verrnnollinen mikrobien ksvunopeuteen. Ksvuliemeen lisätyn Cd:n myrkkyvikutus j mhdollinen bkteereiden kohonnut sietokyky nähdään muutoksin ksvunopeudess. Tulokset lskettiin orgnist inett kohti. Aineisto käsiteltiin tilstollisesti siten, että ineisto trksteltiin kksisuuntisell vrinssinlyysillä jken vrinssitulokset metsätyyppeihin, käsittelyihin j niiden yhdysvikutuksiin. Keskirvoj trksteltiin Tukey n testillä. Cd-kokeen ineisto testttiin erikseen käsittelyjen selvittämiseksi yksisuuntisell vrinssinlyysillä j Tukey n keskirvotestillä. Tilstotestien merkitsevyystsoksi otettiin 5 % riskirj. 3 TULOKSET 3.1 Humuskerroksen ph Tuhklnnoitus nosti humuskerroksen ph-rvo kikill koelueill. Metsätyyppivertiluss käsittelyt iheuttivt smnsuuntiset muutokset mutt metsätyypit eivät eronneet keskenään. Pölytuhk (PT) nosti humuskerroksen ph:t itsekovetettu tuhk (IT) tehokkmmin. Pölytuhkkäsittelyistä PT9 nosti humuskerroksen ph:n 1,5 yksiköllä, kun vstv IT9 käsittely iheutti vin 0,5 yksikön muutoksen (tulukot 1 j 2). Tilstollisesti PT9-käsittely erosi kikist muist käsittelyistä. IT3 j IT9 eivät tilstollisesti eronneet kontrollist eivätkä PT3-käsittelystä. PT3 erosi merkitsevästi kontrollist. Humuskerroksen ph-tulokset korreloituvt selvästi käytetyn tuhkn määrään j liukoisuuteen. Pölytuhk stiin levitettyä kngsmlle tsisemmin kuin hidsliukoisempi itsekovetettu tuhk. Levitys j liukoisuus molemmt heijstuvt humuskerroksen ph-rvoihin. Metsätehon rportti 82 17.12.1999 8
Cd-kokeess käytettiin inostn pölytuhk. Käsittelyt PT3 j PT3+Cd nostivt humuskerroksen 0,2-yksiköllä kontrolliin verrttun, mutt muutos ei ollut tilstollisesti merkitsevä (tulukko 3). Tulokset ovt kolmen rinnkkisen mnäytteen keskirvoj. Hehkutushäviö on ilmoitettu prosenttein kuiv-ineest. Perushengitysnopeus (µg CO 2 -C h -1 ) on ilmoitettu grmm orgnist inett kohden j tymidiini-inkorportionopeus tunniss solu kohden (mol solu -1 h -1 ). IC 50 kuv kdmiumin sietokykyä. Tässä Cd-konsentrtioss (M) ksvu on lskenut puoleen sellisen näytteen ksvust, johon ei ole lisätty kdmiumi. AO trkoitt kridiiniornssivärjäysmenetelmällä määritettyjä bkteerisolumääriä grmm orgnist inest kohden. PLFA totli, PLFA bkteeri j PLFA sieni indikoivt totli-, bkteeri- j sieni-biomss (nmol ḡ 1 o..). Sieni/bkteeri ilmisee PLFA sieni j PLFA bkteeri välisen suhteen. Keskivirheet ovt suluiss. Käsittelyjen iheuttmien muutoksien tilstolliset merkitsevyydet on ilmoitettu kuvss 1. TAULUKKO 1 Tuhkkäsittelyjen vikutukset kuivn knkn (ECT) humuskerroksen kemillisiin j mikrobiologisiin tunnuksiin K PT3 PT9 IT3 IT9 Hehkutushäviö 21,0 (4,10) 24,0 (6,75) 24,6 (7,74) 22,6 (4,16) 22,8 (3,58) ph(h 2 O) 4,03 (0,07) 4,98 (0,26) 5,78 (0,41) 4,12 (0,03) 4,52 (0,07) Perushengitys 7,41 (0,46) 10,81 (0,81) 13,96 (4,13) 9,07 (0,43) 8,84 (1,35) log IC 50-2,82 (-3,26) -3,17 (-3,20) -4,56 (-4,71) -2,91 (-3,35) -3,30 (-4,73) TdR inkorportio 3,99 (0,32) 7,51 (1,65) 12,42 (4,1) 4,33 (0,79) 4,61 (0,72) -22 10 AO 10 11 1,36 (0,08) 1,32 (0,10) 1,41 (0,14) 1,27 (0,05) 1,21 (0,12) PLFA totli 2392, 5 (280) 2321, 5 (217) 2471, 2 (330) 2350, 2 (188) 2180,8 (163) PLFA bkteeri 630,5 (77,7) 570,9 (46,4) 659,5 (78,7) 576,9 (51,1) 537,0 (52,0) PLFA sieni 294,1 (28,8) 346,4 (53,7) 344,8 (42,1) 327,3 (30,0) 320,2 (19,7) sieni/bkteeri 0,470 (0,02) 0,601 (0,05) 0,522 (0,04) 0,567 (0,004) 0,601 (0,04) Käsittelyt on koodttu: K (lnnoittmton), PT3 (pölytuhk 3 000 kg h -1 ), PT9 (pölytuhk 9 000 kg h -1 ), IT3 (itsekovetettu tuhk 3 000 kg h -1 ) j IT9 (itsekovetettu tuhk 9 000 kg h - 1 ). Metsätehon rportti 82 17.12.1999 9
TAULUKKO 2 Tuhkkäsittelyjen vikutukset tuoreen knkn (VMT) humuskerroksen kemillisiin j mikrobiologisiin tunnuksiin K PT3 PT9 IT3 IT9 Hehkutushäviö 38,4 (7,33) 41,9 (11,3) 55,5 (10,9) 48,6 (9,47) 23,0 (7,16) ph(h 2 O) 4,22 (0,03) 4,65 (0,18) 5,93 (0,09) 4,44 (0,08) 4,77 (0,33) Hengitys 11,33 (1,34) 11,13 (1,40) 16,51 (0,79) 12,35 (2,16) 12,24 (2,57) log IC 50-2,50 (-2,84) -2,53 (-2,57) -4,38 (-5,24) -3,18 (-4,02) -2,77 (-2,89) TdR inkorportio 4,94 (0,4) 7,84 (0,7) 26,32 (7,53) 5,83 (0,57) 8,42 (2,47) -22 10 AO 10 11 1,57 (0,21) 1,42 (0,01) 1,49 (0,23) 1,47 (0,25) 1,47 (0,12) PLFA totli 2911,7 (244) 3322,1 (255) 3034,5 (375) 3066,6 (320) 3893,9 (172) PLFA bkteeri 791,8 (69,9) 980,1 (118) 783,2 (88,1) 846,2 (115) 1066,5 (13,2) PLFA sieni 336,9 (33,6) 352,4 (77,1) 401,7 (63,6) 363,1 (21,6) 492,9 (88,5) sieni/bkteeri 0,425 (0,01) 0,386 (0,12) 0,508 (0,03) 0,438 (0,03) 0,464 (0,09) TAULUKKO 3 Tuhkkäsittelyjen vikutukset kuivhkon knkn (EVT) humuskerroksen Cd-kokeen kemillisiin j mikrobiologisiin tunnuksiin K PT3 PT3+Cd Hehkutushäviö 32,0 (2,14) 29,3 (1,44) 37,2 (8,72) ph(h 2 O) 4,05 (0,03) 4,22 (0,07) 4,27 (0,13) Hengitys 7,54 (0,90) 7,69 (1,58) 6,54 (1,08) log IC 50-2,26 (-2,92) -2,49 (-2,90) -2,41 (-3,05) TdR inkorportio 5,05 (1,03) 3,83 (0,40) 3,82 (0,89) 10-22 AO 10 11 1,52 (0,09) 1,30 (0,11) 1,41 (0,20) PLFA totli 3283,4 (274) 2738,3 (238) 2817,7 (518) PLFA bkteeri 970,6 (91,4) 743,5 (54,6) 755,4 (157) PLFA sieni 387,6 (51,0) 331,7 (46,1) 357,8 (44,5) sieni/bkteeri 0,397 (0,02) 0,442 (0,03) 0,501 (0,09) Käsittelyt on koodttu: K (lnnoittmton), PT3 (pölytuhk 3 000 kg h -1 ) j PT3+Cd (pölytuhk 3 000 kg h -1, joss 400 mg Cd kg -1 tuhk). Tulokset ovt kolmen rinnk- Metsätehon rportti 82 17.12.1999 10
kisen mnäytteen keskirvoj. Metsätehon rportti 82 17.12.1999 11
3.2 Humuskerroksen mikrobiologinen ktiivisuus Humuskerroksen mikrobiologinen ktiivisuus mitttiin khdell tvll, humusnäytteiden minerlistionopeuten j bkteerisolujen ksvunopeu- ten. Humusnäytteiden minerlistionopeutt mitttiin CO 2 -tuotton tunniss. Tässä mittustvss metsätyypit erosivt tilstollisesti toisistn. Tuoreell knkll oli kuttltn korkempi minerlistionopeus kuin kuivll knkll (tulukot 1 j 2). Käsittelyt vikuttivt molemmiss metsätyypeissä smnsuuntisesti. PT9- käsittely melkein kksinkertisti CO 2 -tuoton, j erosi siten merkitsevästi kontrollist. PT9 ei eronnut tilstollisesti muist käsittelyistä (PT3, IT3 j IT9), j muut käsittelyt nostivt CO 2 -tuotto kontrolliin verrttun niin vähän, etteivät eronneet siitä tilstollisesti (kuv 1). Cd-kokeess kuivhkoll knkll käsittelyt eivät eronneet tilstollisesti toisistn. PT3 hienokseltn nosti CO 2 -tuotto (tulukko 3) kontrolliin verrttun, mutt vähemmän kuin Lummelmmen kuivn knkn kokeell, j PT3+Cd pienensi minerlistionopeutt 13 % (tulukko 3). Metsätehon rportti 82 17.12.1999 12
µg CO2-C g-1.. h -1 IC50 Cd(mM) Sieni/bkteeri-suhde PLFAsieni nmol g -1 o.. 20 16 12 8 4 0 4 3 2 1 0 500 400 300 200 100 0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 ) 25 b b) 20 K PT3 PT9 IT3 IT9 TdR inkorportio mol solu -1-22 h -1 10 0 K PT3 PT9 IT3 IT9 K PT3 PT9 IT3 IT9 c) 4000 d) 3000 15 10 5 2000 1000 e) 1000 f) 800 600 K PT3 PT9 IT3 IT9 g) b b b K PT3 PT9 IT3 IT9 b PLFAtotli nmol g -1 o.. PLFAbkteeri nmol g -1 o.. 0 400 200 0 K PT3 PT9 IT3 IT9 b K PT3 PT9 IT3 IT9 Kuv 1. Tuhkkäsittelyjen vikutuksi humuskerroksen mikrobiologisiin tunnuksiin. Tulokset kuivn j tuoreen knkn keskirvoin, kosk käsittelyt eivät tilstollisesti eronneet metsätyypeittäin. Käsittelyt on koodttu K (lnnoittmton), PT3 (pölytuhk 3 000 kg h -1 ), PT9 (pölytuhk 9 000 kg h -1 ), IT3 (itsekovetettu tuhk 3 000 kg h -1 ) j IT9 (itsekovetettu tuhk 9 000 kg h -1 ). Metsätehon rportti 82 17.12.1999 13
Perushengitysnopeus () tunniss on ilmoitettu orgnist inett kohden j tymidiinin kertymisnopeus (b) tunniss solu kohden. IC 50 (c) kuv kdmiumin sietokykyä. Tässä Cd-konsentrtioss (M) ksvu on lskenut puoleen sellisen näytteen ksvust, johon ei ole lisätty kdmiumi. PLFA totli (d), PLFA sieni (e) j PLFA bkteeri (f) indikoivt totli-, bkteeri- j sieni-biomss (nmol ḡ 1 o..). Sieni/bkteeri (g) ilmisee PLFA sieni j PLFA bkteeri välisen suhteen. Smll kirjimell koodtut käsittelyt eivät ero tilstollisesti toisistn. Toisen ktiivisuusmittuksen käytettiin bkteerisolujen ksvunopeutt. Tätä vrten lskettiin humusnäytteiden bkteerimäärä mikroskooppisesti sekä määritettiin tymidiinin kertymisnopeus bkteereihin. Lopullinen testisuure on solun sisään otetun tymidiinin määrä yhtä bkteerisolu kohti. Mitä korkempi luku sitä suurempi on bkteerin ksvunopeus. Tuoreell knkll bkteerien ksvunopeus oli kuttltn korkempi kuin kuivll knkll (tulukot 1 j 2). Käsittelyt vikuttivt molemmill metsätyypeillä smnsuuntisesti. Tuhkkäsittelyt nostivt bkteerien ksvunopeutt. Pölytuhkkäsittely oli itsekovetettu tuhk tehokkmpi j PT9 erosi tilstollisesti kikist muist käsittelyistä erittäin korken ksvunopeuden oslt (kuv 1b). Cd-kokeess käsittelyt eivät eronneet tilstollisesti toisistn. PT3 j PT3+Cd lskivt bkteerien ksvunopeutt kontrolliin verrttun (tulukko 3). 3.3 Bkteerien Cd-tolernssi Edellä kuvttu ksvunopeusmittri on käytetty myös kuvmn humusnäytteiden bkteereiden Cd-kestävyyttä. Kokeess ksvtettiin humusnäytteistä erotettuj bkteereit khden tunnin jn kohonneiss Cd-pitoisuuksiss leimtun tymidiinin knss. Käytetyt Cd-konsentrtiot olivt 0,01 j 0,000001 M välillä. Tuloksist lskettiin IC 50 rvo, jok trkoitt sitä Cd-pitoisuutt, joll ksvunopeus lskee puoleen ilmn Cd-lisäystä mittuist lkuperäisestä rvostn. Metsätyyppien välillä IC 50 rvo ei eronnut, mutt PT9-käsittely herkisti bkteeriyhteisön Cd:lle (kuv 1c). Kun kontrollin IC 50 rvo oli 2,34 mm Cd, niin PT9-käsittelyjen IC 50 rvo oli 0,035mM. Kontrollin bkteeriyhteisö siis kesti yli 60-kertisi Cdpitoisuuksi PT9-käsittelyjen bkteeriyhteisöön verrttun. Tulukkoon 1 j 2 IC 50 rvot on ilmoitettu lkuperäisten rvojen logritmein. Myös Cd-kokeess tuhkkäsittelyt herkistivät bkteeriyhteisön kdmiumille. Erot kontrolliin olivt kksinkertiset (tulukko 3), mutt ne eivät olleet tilstollisesti merkitseviä. 3.4 Mikrobibiomss Humuksest uutetuist mikrobirsvhpoist lskettiin tunnuksi indikoimn mikrobibiomssn (PLFA totli ), sienibiomssn (PLFA sieni ) j bkteeribiomssn (PLFA bkteeri ) määrää. Tuoreell knkll oli tilstollisesti korkempi kokonismikrobibiomss, bkteeribiomss j sienibiomss kuin kuivll knkll (tulukot 1 j 2). Käsittelyt eivät vikuttneet mihinkään edellä minittuun muuttujn (kuvt 1d f). PLFA sieni j PLFA bkteeri rvoist lskettiin vielä sie- Metsätehon rportti 82 17.12.1999 14
ni/bkteeri-suhde, jok oli merkitsevästi korkempi VT:llä mutt käsittelyillä ei ollut vikutust (kuv 1g). Cd-kokeen rsvhpoist lskettiin smt tunnukset. PT3 j PT3+Cd eivät eronneet kontrollist (tulukko 3). 3.5 Mikrobiyhteisö Käsittelyt muuttivt mikrobiyhteisön rkennett, mikä näkyi rsvhppospektreistä eli uutettujen rsvhppojen suhteest toisiins. Knonisen erottelunlyysin ensimmäinen komponentti CAN1 ryhmitteli smnkltiset mikrobiyhteisöt. Tähän nlyysiin käytettiin kikkien 39 koeln rsvhppoineisto. Kontrollit j PT9- käsittelyt ryhmittyivät täysin omiksi ryhmikseen (kuv 2) j siten niiden mikrobiyhteisö oli erilinen. Kikki muut käsittelyt PT3, IT3, IT9 j PT3+Cd muodostivt yhden ison ryhmän, joist lähimpänä kontrollej olivt IT3-käsittelyt. PT3- j IT9-käsittelyt ryhmittyivät keskenään sekisin, joten niiden mikrobiyhteisö oli smnkltinen. CAN 2 6 4 2 0-2 K PT3 PT9 IT3 IT9 PT3+Cd -4-6 -6-4 -2 0 2 4 6 CAN 1 Kuv 2. Knoninen erottelunlyysi humuksest uutetuist rsvhpoist. Käsittelyt on koodttu K (lnnoittmton), PT3 (pölytuhk 3 000 kg h -1 ), PT9 (pölytuhk 9 000 kg h -1 ), IT3 (itsekovetettu tuhk 3 000 kg h -1 ) j IT9 (itsekovetettu tuhk 9 000 kg h -1 ). Anlyysin grfisess trksteluss toisin muistuttvt näytelt tulostuvt lähekkäisinä pisteinä ineiston päävihtelusuunti kuvville kseleille. Metsätehon rportti 82 17.12.1999 15
4 TULOSTEN TULKINTA Kuivn knkn (ECT, Lummelmpi) j tuoreen knkn (VMT, Sdinselkä) metsiköistä kerättiin humusnäytteet n. 1,5 vuott lnnoituskäsittelyjen jälkeen. Odotusten mukisesti tuhklnnoitus nosti humuksen ph-rvo j nousu oli riippuvinen tuhkljist j tuhkn määrästä. Pölytuhk (PT-käsittelyt) nosti phrvo itsekovettettu tuhk (IT-käsittelyt) enemmän. Vikk syytä siihen ei tämän ineiston puitteiss ole tutkittu, voidn olett, että ph on suorn verrnnollinen tuhkn liukoisuuteen j tuhkn vikutuslueeseen. Pölytuhk liukenee itsekovetettu tuhk nopemmin humuskerroksen mveteen. Pölytuhk peittää myös suuremmn humuspint-ln kuin itsekovetettu tuhk, sillä vielä näytteenottohetkenä itsekovetettu tuhk näkyi koelll suurin yksittäisinä kokkrein. Metsikköjen kesken ei ollut käsittelyjen välisiä eroj ph-tulosten suhteen. Cdkoe perustettiin kuivhkon knkn EVT-metsikköön lähelle Lummelmmen koett noin puoli vuott myöhemmin. Myös tässä kokeess humuskerroksen ph nousi tuhkkäsittelyjen nsiost, muttei niin pljon kuin Lummelmmen kokeess. Ero selittyy tuhkn lyhyemmällä vikutusjll. Mikrobien ktiivisuus (bkteereiden j sienten CO 2 -tuotto) korreloi humuskerroksen ph:n muutoksen knss positiivisesti, j oli siten yhteydessä tuhkljeihin. Tämä tulos on hvittu ikisemmin pölytuhklnnoituskokeiss (esim. Bååth ym. 1995) j muiss humuskerroksen ph:t nostviss lnnoituskäsittelyissä, kuten klkituksess (Smolnder ym. 1994) j urelnnoituksiss joitkin vuosi käsittelyjen jälkeen (Foster ym. 1980). Tutkimustulosten puuttuess selitykseksi on rveltu, että humuskerroksen ph:n nousun yhteydessä mveteen liukenee suurempi määriä ldultn helposti minerlisoituvi hiiliyhdisteitä, jotk nostisivt nimenomn bkteeriyhteisön ktiivisuutt. Tässä tutkimuksess kiinnitettiin huomiot bkteerien ktiivisuuteen sekä yhteisömuutoksiin j tulokset tukevt edellä esitettyä hypoteesiä. Tutkittess bkteeriyhteisön spesifistä ktiivisuutt tymidiinin kertymistekniikll todettiin, että bkteerit lisäsivät ksvunopeuttn j ktiivisuuttn humuksen ph:n nousun myötä. Tämän lisäksi bkteeriyhteisön koostumus poikkesi kontrollist sitä voimkkmmin mitä korkempi humuskerroksen ph oli. Tulokset olivt smnsuuntisi rvinteisuudeltn erilisiss koemetsiköissä. Syy bkteeriyhteisön muutokseen on humuksen ph:n nousu, sillä vstvi muutoksi on mitttu myös metsämn klkituksen jälkeen. Tuhkn sisältämän kdmiumin on rveltu olevn hitllinen metsäekosysteemin toiminnlle. Kokeess käytettiin tuhk, jonk Cd-pitoisuus oli 15 mg kg -1, joten kdmiumi levitettiin metsään 45 g j 135 g h -1 lnnoitustsost riippuen. Kun humuskerroksen pksuudeksi oletetn 1,5 cm (tyypillinen kuivill knkill) j kuivn, seulotun humuksen tiheydeksi n. 0,1 g cm -3 (keskirvo tutkimuksissmme) niin humust olisi n. 15 000 kg h -1. Tässä kokeess lisättiin suurimmn tuhk-nnoksen mukn 135 g h -1 Cd:, joten kdmiumpitoisuudeksi kuivss humuksess tulee 9 mg kg -1. Humuskerroksen luontinen Cd-pitoisuus on keskimääränä 0,47 mg kg -1 (Tmminen j Strr 1990). Riittävän suurin pitoisuuksin veteen liukenev CdCl 2 on hitllinen mn mikrobistolle, jot on käsitelty tuhkll 5 Metsätehon rportti 82 17.12.1999 16
vuott ikisemmin (Fritze ym. 1995). Cd-pitoisuuden piti oll tuhklnnoituskokeen (2,5 t h -1 ) humuksess 2 500 mg kg -1, jott hengitysktiivisuus lski puoleen lkuperäisestä. Smss kokeess todettiin myös, että kdmiumi trvitn vähintään 400 mg kg -1 humust, jott tuhklnnoituksen indusoim hengitysktiivisuuden nousu lskisi kontrollin tsolle. Kosk kenttäkokeessmme tuhklnnoitus nosti mikrobien hengitysktiivisuutt, oletimme, että tuhkn mukn lisätty Cd ei vikuttnut vuodess mikrobistoon hitllisesti. Oletus trkstettiin khdell tvll. Suojmeknismin metsämn bkteeriyhteisö kehittää vstustuskykyä kohonneit rsksmetllipitoisuuksi vstn (Pennnen ym. 1996). Mittsimme koelojen bkteeriyhteisön Cd:n sietokykyä. Mikäli tuhklnnoitetuiss bkteeriyhteisöissä kehittyy Cd-resistenssiä, niin tuhkn mukn tullut Cd on ylittänyt bkteeriyhteisön Cd:n sietokynnyksen. Nostimme keinotekoisesti yhden tuhkerän Cd-pitoisuutt 400 mg:n tuhkkilo kohti kdmiumoksidill (CdO). Tuhkss esiintyvä Cd on enimmäkseen oksidimuodoss korken plolämpötiln vuoksi (Anttil 1998). Kosk tämän kokeen tuhk-nnos oli 3 000 kg h -1, niin Cd: lisättiin 1 200 g h -1 j lskennllinen Cdpitoisuus humuksess oli n. 80 mg kg -1. Cd-resistenssiä ei kehittynyt vuodess yhdellekään koeln bkteeriyhteisölle. Itse siss lnnoitettujen koelojen bkteeriyhteisöt sietivät vähemmän kdmiumi kontrollikoelojen bkteeriyhteisöihin verrttun. Lisäksi niissä kokeiss (PT3+Cd), joiss tuhkn Cd-pitoisuutt nostettiin keinotekoisesti, bkteeriyhteisön rkenne ei eronnut muist vstvist tuhkkäsittelyistä (PT3). Yhteenveton totemme, että tuhklnnoitus iheutti khdell eri metsätyypillä smnsuuntiset muutokset. Mikrobiktiivisuus ksvoi j mikrobiyhteisön rkenne muuttui. Pölytuhk iheutti itsekovetettu tuhk tehokkmmin mitttuj muutoksi. Tuhkn sisältämä kdmium ei iheuttnut vuodess hitllisi muutoksi metsämn mikrobistoon. Kdmiumin määrä tuhkss ei korreloinut bkteeriyhteisön muutosten eikä mikrobiyhteisön hengitysktiviteetin knss. KIRJALLISUUS Anttil, P. 1998. Tuhkhnkkeen välirportit vuodelt 1997. Metsätehon rportti 56:14 24. Bååth, E., Frostegård, Å., Pennnen, T. & Fritze, H. 1995. Microbil community structure nd ph response in reltion to soil orgnic mtter qulity in wood-sh fertilized, cler-cut or burned coniferous forest soil. Soil Biology nd Biochemistry 27:229 240. Foster, N.W., Beuchmp, E.G. & Corke, C.T. 1980. Microbil ctivity in Pinus bnksin lmb. Forest floor mended with nitrogen nd crbon. Cndin Journl of Soil Science 60:199 209. Metsätehon rportti 82 17.12.1999 17
Fritze, H., Kpnen, A. & Vnhl, P. 1995. Cdmium contmintion of wood sh nd fire treted coniferous humus: effect on soil respirtion. Bulletin of Environmentl Contmintion nd Toxicology 54:775 782. Frostegård, Å. & Bååth, E. 1996. The use of phospholipid ftty cid nlysis to estimte bcteril nd fungl biomss in soil. Biology nd Fertility of Soils 22, 59-65. Pennnen, T., Frostegård, Å., Fritze, H. & Bååth, E. 1996. Phospholipid ftty cid composition nd hevy metl tolernce of soil microbil communities long two hevy metl polluted grdients in coniferous forests. Applied Environmentl Microbiology 62:420 428. Pennnen, T., Fritze, H., Vnhl, P., Kiikkilä, O., Neuvonen, S. & Bååth, E. 1998. Structure of microbil community in soil fter prolonged ddition of low levels of simulted cid rin. Applied Environmentl Microbiology 64:2173 2180. Pennnen, T., Perkiömäki, J., Kiikkilä, O., Vnhl, P., Neuvonen, S. & Fritze, H. 1998b. Prolonged, simulted cid rin nd hevy metl depos-ition: seprted nd combined effects on forest soil microbil community structure. FEMS Microbil Ecology 27:291 300. Pietikäinen, J. & Fritze, H. 1995. Cler-cutting nd prescribed burning in coniferous forest: comprison of effects on soil fungl nd totl microbil biomss, respirtion ctivity nd nitrifiction. Soil Biology nd Biochem- istry 27:101-109. Smolnder, A., Kurk, A., Kitunen,V. & Mälkönen, E. 1994. Microbil biomss C nd N nd respirtory ctivity in soil of repetedly limed nd N- nd P- fertilized Norwy spruce stnds. Soil Biology nd Biochemistry 26:957 962. Tmminen, P. & Strr, M. 1990. A survey of forest soil properties relted to soil cidifiction in southern Finlnd. In: Kuppi, P., Anttil P. & Kenttämies, K. (eds.). Acidifiction in Finlnd. Springer-Verlg Berlin Heidelberg. p. 235 251. Metsätehon rportti 82 17.12.1999 18