Puun lahoamisprosessin seuraaminen NMR- ja MRI-menetelmillä

Puun lahoamisprosessin seuraaminen NMR- ja MRI-menetelmillä LuK-tutkielma 10.1.2017 Sami Hiltunen Fysiikan koulutusohjelma Luonnontieteellinen tiedekunta Oulun Yliopisto

Sisältö 1 Johdanto 2 2 Puun rakenne ja lahoaminen 2 2.1 Makrorakenne.................................. 2 2.2 Mikrorakenne.................................. 3 2.3 Vesi puun rakenteessa.............................. 4 2.4 Puun lahoaminen................................ 5 2.4.1 Kellarikesikkä lahottajana....................... 6 2.4.2 Kosteuden merkitys........................... 6 3 NMR-spektroskopia 6 3.1 Ydinmagneettinen resonanssi.......................... 7 3.1.1 Ytimen spin............................... 7 3.1.2 Zeeman-ilmiö ja energiatilat...................... 7 3.1.3 Makroskooppinen ydinmagnetoituma................. 8 3.2 NMR-signaali.................................. 9 3.2.1 Magneettinen herätekenttä....................... 9 3.2.2 Signaalin havaitseminen........................ 10 3.2.3 Fourier-muunnos............................ 10 3.3 Kemiallinen siirtymä spektrissä........................ 11 3.4 Relaksaatio................................... 12 3.4.1 Relaksaatiomekanismeja........................ 13 3.4.2 T 1 -relaksaatio.............................. 13 3.4.3 T 2 -relaksaatio.............................. 14 3.4.4 Puukudoksen relaksaatiokomponentit................. 16 4 Magneettikuvaus 17 4.1 Gradientti.................................... 17 4.2 Moniuloitteinen kuvanmuodostus....................... 18 4.3 Kuvan tarkkuus................................. 20 4.4 Menetelmistä.................................. 20 5 Johtopäätökset 22 6 Kirjallisuusviitteet 24 1

1 Johdanto NMR-spektroskopia sekä eräs sen merkittävimmistä sovellutusmenetelmistä, MRI, tarjoavat uusia työkaluja erilaisten materiaalien rakenteen tutkimiseen. Erityisesti menetelmän hyödyllisyys ilmenee biologisten materiaalien rakennetutkimuksessa, sillä se tarjoaa mahdollisuuden tutkia biologista solukkoa suurella herkkyydellä vahingoittamatta rakennetta. Näin ollen kohdetta voidaan tarkastella pitkienkin mittausaikojen puitteissa ilman säteilyhaittaa, sillä NMR-spektrometri toimii radiotaajuudella. Tässä tutkielmassa lyhenne NMR tarkoittaa ydinmagneettista resonanssia (nuclear magnetic resonance) sekä MRI magneettikuvantamista (magnetic resonance imaging). Tämän tutkielman tarkoituksena on tarkastella, onko lahoavan puukudoksen seuraaminen yllä mainituin menetelmin mahdollista ja tarkoituksenmukaista. Työssä keskitytään erityisesti kellarikesikkäsienen (Coniophora puteana) lahottaman männyn (Pinus sylvestris) rakenteessa näkyvien muutosten seurattavuuteen magneettikuvauksella ja NMR-spektroskopialla. Lisäksi työssä tarkastellaan puun rakenteen, NMR-spektroskopian ja MRI-kuvantamisen perusperiaatteita niiltä osin, jotka vaikuttavat mahdollisuuksiin tutkia puun sisäistä rakennetta. Tämä katsaus antaa pohjustusta Oulun yliopistossa tehdyn vastaavanlaisen käytännön pilottitutkimuksen tulosten tarkastelun perusperiaatteisiin. Tutkimuksessa kuvattiin kolmeakymmentä kellarikesikkäsienen lahottamaa männyn pintapuusta otettua näytekappaletta kymmenen viikon aikana. Katsauksessa perustellaan myös valittujen menetelmien soveltuvuutta kyseiseen tarkastelukohteeseen. Tutkimiseen käytettiin sekä NMR-, että MRI-menetelmiä. 2 Puun rakenne ja lahoaminen Tässä luvussa esitellään pääpiirteiltään tarkasteltavan puusolukon rakennetta ja sen lahoamisprosessiin vaikuttavia tekijöitä. On syytä huomata biologista kudosta tarkasteltaessa, että elävän organismin rakenteen kuvaus on aina yleistys. Puun rakenteen tiedot perustuvat pääasiassa lähteeseen [1]. 2.1 Makrorakenne Puun rakenne makrotasolla koostuu puun pintaosan kuoresta, joka ympäröi ksyleemiä eli puun kasvuosaa. Tämä kasvuosa koostuu puun vuosirenkaista, jotka männyllä ovat hyvin selkeät. Mänty on niin kutsuttua pehmeää puuta. Se tarkoittaa, ettei männyn rakenteessa ole niin useaa solutyyppiä kuin niin kutsutuilla kovilla puulajeilla. Johdannossa mainitun lahotuskokeen tapauksessa tarkastellaan männyn vaaleampaa pintapuuta, joka on 2

lähempänä puun kuorta kuin sydänpuu. Männyn profiili koostuu vuosirenkaista (kuva 1), jotka sisältävät paksumman vaalean kerroksen kevätpuuta (ew, earlywood) ja ohuemman tummemman kerroksen kesäpuuta (lw, latewood). Tämä rakenne johtuu siitä, että puu kasvattaa eri vuodenaikoina solukkoa eri nopeudella. Kesäpuu on kevätpuuta lujempaa sekä tiheämpää. Tämä kasvun ero riippuu myös monesta muusta ympäristötekijästä, kuten maaperästä, puulajista ja kasvuolosuhteista. Tässä tapauksessa tarkasteltavan puun voidaan olettaa olevan sen verran nuori, ettei kuolleen solukon sydänpuuta ole kerennyt merkittävästi muodostua rakenteeseen. Se häiritsisi lahotuskoetta ja kuvantamismittauksia muuttaessaan vedensitomisominaisuuksia. Kuva 1: Puun poikkileikkauksesta otettu sektori, josta ilmenee puun makrorakenne. Kevätpuu ja kesäpuu muodostavat vuosirenkaan. Kuvassa näkyy myös muita puun poikkileikkauksen osia, jotka tämän tarkastelun kannalta eivät ole niin oleellisia. Lähde: Puuproffa.fi (10.10.2017) 2.2 Mikrorakenne Puun hienorakenne koostuu kasvisoluista (kuva 2). Valtaosa (90 95%) puun rungosta koostuu vesisoluista (trakeideista). Nämä solut osallistuvat veden kuljettamiseen. Trakeidit ovat pitkiä ja soikeita putkilomaisia soluja, jotka suuntautuvat puun kasvusuuntaan. Männyllä näiden solujen halkaisijat puun poikkileikkauksessa ovat kevätpuussa n. 30 µm ja kesäpuussa n. 20 µm. Tällaisen solun sisässä vaihteleva osa (noin 1/3 solun koosta) on onttoa luumenia. Pieni osa männyn solukosta koostuu poikkileikkauksen suuntaisista rakenteellisista tukisoluista ja rauhasen tehtäviä täyttävistä eritesoluista. Männyssä on myös ydinsäteitä, jotka kuljettavat radiaalisessa suunnassa eli keskiöstä poispäin ravintoa pinnan soluille. Rakenteesta löytyy myös pihkatiehyitä, jotka muodostavat verkoston sekä puun kasvusuunnassa että sen paksuussuunnassa. Paksuussuunnassa nämä tiehyet sijaitsevat ydinsäteissä. Eri soluja yhdistävissä soluseinämissä on huokosia, jotta nesteet kykenevät virtaamaan solujen välillä. Huokoset laajenevat puun kostumisen seurauksena suuremmiksi mahdollistaen 3

veden kuljetuksen toimivuuden. Varsinaisten solujen ympärillä on tyypillisen puukudoksen tavoin useista kerroksista koostuvat soluseinämät. Kasvavan puun tapauksessa soluseinämissä sekä luumeneissa on vesiliukoisia nesteitä. Tämä näkyy suoraan puun kosteutena. Soluseinämien rakennekomponentteja ovat selluloosa (glukoosipolymeeri, joka toimii lujittavana kuituna), hemiselluloosa (selluloosa, jonka rakenteessa on myös muita hiilivetyjä ja jotka ovat semikiteisiä) sekä ligniini (puun amorfinen liimana toimiva ja puuta veden haitoilta suojaava osuus). Kuva 2: Pieni osa havupuun solukkorakennetta. Kuvasta ilmenee kevätpuun ja kesäpuun tiheyserot. Voidaan nähdä puun sisältämät vesisolut eli trakeidit. Kuvassa näkyy myös säteen suuntaiset ydinsäteet sekä kasvusuuntainen pihkatiehyt. Solut ovat pitkiä kasvusuunnassa. Lähde: Puuproffa.fi (10.10.2017) 2.3 Vesi puun rakenteessa Puukudos voi sisältää vettä monella eri tavalla sitoutuneena. Hyvän vedensitomiskykynsä ansiosta puuta pidetään hygroskooppisena materiaalina. Vedensitomiskyky johtuu hydroksyyliryhmistä soluseinämien hiilihydraateissa. Hydroksyyliryhmät voivat muodostaa vesimolekyylin vetyatomien ja happiatomin kanssa voimakkaita vetysidoksia. Vesi pääsee kerääntymään myös luumeneihin riippuen puun sisältämän kosteuden määrästä. Puun vesipitoisuus kasvuvaiheessa vaihtelee 60-200 prosentin välillä. Puun kosteuspitoisuudella tarkoitetaan rakenteissa olevan veden massaa m prosentteina verrattuna puun kuivamassaan m 0, eli k = m 100%. (1) m 0 Kun tunnetaan puun massa ennen kuivatusta (m kostea ) ja puun massa kuivatuksen jälkeen (m 0, kuivamassa), saadaan kosteuspitoisuus yhtälöstä k = m kostea m 0 m 0 100%. (2) 4

Veden vapausaste riippuu sen olinpaikasta solukossa. Kosteissa olosuhteissa kuiva puu sitoo rakenteeseensa vettä, kunnes se on tasapainossa ympäristönsä kanssa. Myös ympäristöä kosteampi puu pyrkii tasapainoon luovuttamalla kosteuttaan. Tästä syystä ympäristön kosteus merkitsee paljon lahotuskokeen kannalta. Lahoamisympäristön kosteuden tulisi olla sellainen, että lahoaminen olisi optimaalista. Soluseinämiin imeytynyt vesi on niin kutsuttua sidottua vettä. Kostutettaessa puuta soluseinämät kyllästyvät ensin vedestä, jonka jälkeen kosteutta (vapaata vettä) kertyy luumeneihin. Luumeneissa olevaa vettä kutsutaan vapaaksi, sillä se on helpompi saada poistumaan rakenteesta kuivattamalla, kuin soluseinämiin sitoutunut vesi. Tila, jossa kaikki vapaa vesi on poistunut luumeneista, on puun kuitukyllästyspiste. Tämä tila riippuu soluseinämän veden absorbtiokyvystä, joka puolestaan riippuu soluseinämän molekyylirakenteesta eli puulajista. Männyn kuitukyllästyspisteessä huoneen lämpötilassa puun kosteuspitoisuus on noin 30%. Kuitukyllästyspiste vaihtelee hieman eri olosuhteissa. Puun huokosten muutoksia kosteusprosentin funktiona kuvataan kuvassa 3. Kosteus vaikuttaa sekä puun massaan että sen tiheyteen, tästä syystä puu turpoaa, joka on otettava huomioon näytteiden teossa. Kosteuden vaikutus puun massaan on lähes suoraan kosteuden massan lisääminen. Puun maksimaalinen kosteuspitoisuus on kääntäen verrannollinen puun kuivatuoretiheyteen. Kesäpuussa soluontelot ovat ohuempia ja soluseinämät ovat suuremmat, joten kesäpuun vesipitoisuus on hieman pienempi kuin kevätpuun. Kesäpuussa vesi on myös keskimäärin sidotumpaa. Kuva 3: Kun puun kosteus on yli n. 30%, vettä on kertynyt luumeneihin (vas). Kosteuden poistuessa ensin luumenien vesi häviää. Tämän jälkeen soluseinämiin liuennut vesi alkaa poistumaan. Lopulta puu kutistuu säilyttääkseen tehokkaamman aineenvaihdunnan kosteuden ollessa pieni (vasemmalta oikealle). Lähde: Puuproffa.fi (10.10.2017) 2.4 Puun lahoaminen Puu pilaantuu eri ympäristötekijöiden vaikutuksesta. Tässä keskitytään elollisen luonnon aiheuttamaan pilaantumiseen, niin kutsuttuun biologiseen pilaantumiseen. Tärkein puun pilaantumisen muoto on lahoaminen, jonka seuraamismahdollisuuksia nyt tarkastel- 5

laan. Puun lahoamisella tarkoitetaan lahottajien, eli bakteerien tai sienten aiheuttamaa, hapellisissa olosuhteissa tapahtuvaa puuaineksen eli ksyleemin hajoamista, joka vaikuttaa puun ominaisuuksiin ja rakenteeseen. Lahoaminen on merkittävä tuhoprosessi puutavaralle, jonka hallitseminen on taloudellisesti hyvin suuri etu puutavaran käyttäjälle ja tuottajalle. 2.4.1 Kellarikesikkä lahottajana Kellarikesikkä (Coniophora puteana) on merkittävä lahottaja, joka vaurioittaa erityisesti rakennusten puumateriaalia. Kellarikesikkä luokitellaan ruskolahottajiin, jonka lahottamisprosessissa lähinnä puun polysakkaridit (selluloosa ja hemiselluloosa) vaurioituvat. Ruskolahottaja ei helposti kykene hajottamaan ligniinejä [2]. Tämän prosessin seurauksena puun rakenne muuttuu ruskeaksi ja hauraaksi. Ruskolahoa aiheuttavien sienten kasvuedellytyksenä voidaan pitää sopivaa kosteuspitoisuutta ja lämpötilaa. Erityisesti kellarikesikkä on havupuuainekselle tyypillinen lahottaja. Kellarikesikkä on lahottajana hyvin nopeakasvuinen, joka toimii kohtuullisella aikavälillä lahotuskokeeseenkin nähden. [3] 2.4.2 Kosteuden merkitys Puun kosteuspitoisuus määrää, onko lahoamisprosessi mahdollinen. Lahottajasieni ei kykene asuttamaan puumateriaalia, mikäli sen kosteuspitoisuus on alle 25-30 % [21]. Tätä suuremmilla kosteuspitoisuuksilla sieni kykenee hyödyntämään luumeneihin kertyvää vapaata vettä ravintonaan. On havaittu, että liian kuivissa ja kosteissa olosuhteissa lahoaminen ei edisty. Puun kosteuden lisääntyessä vettä hyödyntävät organismit kykenevät toimimaan tehokkaaammin siihen asti, kunnes saavutetaan kriittinen kosteuspitoisuus. Se on puulajista riippuen 150-170 %, jonka jälkeen lahottajat eivät enää kykene toimimaan. Tätä suuremmilla kosteuspitoisuuksilla puun rakenteen täyttyminen vapaasta vedestä vähentää hapen kulkeutumista, joka rajoittaa aerobisissa olosuhteissa toimivien lahottajien toimintaa. Lahottajan kasvu siis rajoittuu jonkin ympäristötekijän vuoksi, joka voi olla happi, vesi tai rakennepolymeerit. Kellarikesikkä vaatii lähtötilanteeltaan tavallista kosteammat olosuhteet. Optimaalinen kosteuspitoisuus on jopa 50-60 %. Tästä syystä sitä kutsutaan märkälahottajaksi. [3-5] 3 NMR-spektroskopia Tämän luvun tiedot perustuvat Oulun yliopiston fysiikan tutkinto-ohjelman kurssimateriaaleihin ja NMR-spektroskopian perusteoksiin; lähteisiin [6-9]. NMR-spektroskopian lähtökohdat juontuvat kvanttimekaniikasta, mutta tässä käsittelyssä kokeelliselle makroskooppisen näytteen kuvantamiselle riittää ymmärtää perusperiaatteet ja tärkeimmät lainalaisuudet. 6

3.1 Ydinmagneettinen resonanssi 3.1.1 Ytimen spin Atomiytimen nukleoneilla on kvanttimekaaninen ominaisuus, jota kutsutaan spiniksi. Spiniä voidaan ajatella analogiana klassisen mekaniikan kuvaukseen hyrrästä, joka pyörii akselinsa ympäri. Tämän pyörimissuunnan kulmaliikemäärävektori voi suuntautua pyörimistasosta ylöspäin tai alaspäin. Useamman nukleonin muodostaman atomiytimen kokonaisspin saadaan ytimen kuorimallin mukaan (kuorimallissa ytimen nukleonit muodostaa samanlaisen kvantittuneen rakenteen kuin atomimallin elektroniset tilat) parittomien nukleonien spinien määräämänä. NMR-aktiivisilla ytimillä on nollasta eroava kokonaisspin ja siten myös spinimpulssimomentti, jonka pituus on: I = I(I + 1), (3) missä on redusoitu Planckin vakio ja I ytimen kokonaisspinin kvanttiluku, joka on nolla tai positiivinen puoliluku. Spinimpulssimomenttivektorin pituus on kvantittunut. Tämän lisäksi vektorin erään suunnan komponentti (valitaan tämä karteesisen koordinaatiston z-akselin suunnaksi) on kvantittunut. Nollasta eroava spinimpulssimomentti aiheuttaa ytimelle magneettisen dipolimomentin µ, µ = γi, (4) missä vakiokerroin γ on ydinkohtainen vakio, jota kutsutaan gyromagneettiseksi suhteeksi. Myös magneettinen dipolimomentti on kvantittunut johtuen spinimpulssimomentin kvantittumisesta. Gyromagneettinen suhde kuvaa ytimen NMR-aktiivisuuden voimakkuutta. Voimakkain se on protonin, eli 1 H-ytimen kohdalla. Vety on tämän vuoksi yleisin NMR-spektroskopiassa käytetty ydin. Tämän kokeen kannalta se toimii myös hyvin, sillä tarkastelemme vettä (H 2 O), joka sisältää vetyä. 3.1.2 Zeeman-ilmiö ja energiatilat Ydintä ja sen magneettista dipolimomenttia voidaan ajatella analogisesti virtasilmukan tavoin. Kun ydin asetetaan ulkoiseen, z-akselin suuntaiseen staattiseen magneettikenttään B, siihen kohdistuu vääntömomentti τ = µ B. (5) Tällä vääntömomentilla on sähkömagneettinen potentiaalienergia E p = µ B = µ z B, (6) 7

jossa riittää käyttää vain dipolimomentin z-suuntaista komponenttia µ z, sillä tämä komponentti on yhdensuuntainen ulkoisen magneettikentän kanssa. Tästä johtuen energiatasot kvantittuvat silpoutuen spinin suunnan perusteella kahtia. Tässä Zeeman-ilmiössä muodostuu kvantittuneita energiatasoja, joita havainnollistetaan kuvassa 4. Kuva 4: Kuvassa havaitaan, miten erisuuntaiset spinit vuorovaikuttavat ulkoisen magneettikentän kanssa muodostaen kaksi energiatasoa. Korkeampienerginen taso syntyy spinin ollessa vastakkaissuuntainen kentän kanssa. Energiaero riippuu magneettikentän voimakkuudesta. Lähde: Wikimedia commons, 10.10.2017 Tällöin energiatasot ovat muotoa E = γ Bm. (7) Kvanttiluvun m kuvaamien energiatasojen välillä ydin voi siirtyä emittoimalla tai absorboimalla fotonin. Kvanttimekaniikan perusteella siirtymä voi olla vain m = ±1. Muut siirtymät eivät ole suoraan havaittavia. Kun tarkastellaan NMR-aktiivisia spin 1/2 -ytimiä, voidaan ajatella kvanttiluvun m olevan m = ±1/2, toisin sanoen ydin on spin ylös tai spin alas -tilassa. Siirtymään liittyvän fotonin energia on kahden vierekkäisen energiatason erotus: E = γ B. (8) Emittoituneen fotonin taajuutta kutsutaan ytimen Larmor-taajuudeksi tai resonanssitaajuudeksi kyseisessä magneettikentässä, fotonin taajuudeksi ν saadaan energian yhtälöstä 8 ν = γ B 2π. (9) 3.1.3 Makroskooppinen ydinmagnetoituma Ulkoisessa magneettikentässä ydin keskimäärin orientoituu ennemmin magneettikentän suuntaisesti magneettiselta momentiltaan, kuin sitä vastaan. Tarkasteltaessa yksittäisiä ytimiä niiden lämpöliike on niin suurta, että ytimen terminen energia riittää hyvin sekoittamaan magneettisen momentin suunnan. 8

Makroskooppisella tasolla näiden ilmiöiden yhteisvaikutus nähdään niin sanottuna makroskooppisena ydinmagnetoitumana. Tällöin makroskooppisen näytteen ulkoisen kentän suuntaisten magneettisten momenttien miehitys on hieman suurempi kuin vastakkaissuuntaisten. Tämä muodostaa vektorin, jota kutsutaan magnetoitumaksi M 0. Se on ulkoisen magneettikentän suuntainen (z-akseli), miehityseroa vastaavien ydinten magneettisten momenttien summa. Termisessä tasapainossa magnetoituman suuruus on M 0 = Nγ2 2 I(I + 1), (10) 3kT missä N on ydinten lukumäärä ja kt on terminen energia kyseisessä lämpötilassa. Lämpöliike keskiarvoistaa suurimman osan magnetoitumasta nollaksi. Kokonaismagnetoituman muutokset voidaan silti tarkoilla NMR-spektrometreillä havaita menetelmän herkkyyden vuoksi. 3.2 NMR-signaali 3.2.1 Magneettinen herätekenttä Näytteen asettaminen staattiseen magneettikenttään aiheuttaa kentän suuntaisen (z-akseli) magnetoituman. Kun näytettä häiritään x-akselin suuntaisella magneettisella häiriöpulssilla B x, M 0 -vektori kokee vääntömomentin, joka pyrkii kääntämään tätä xy-tasoon (kohti y-akselia). Pulssin suuruus on pieni verrattuna ulkoiseen magneettikenttään. Kääntyvällä magnetisaatiolla on komponentti xy-tasossa, joka puolestaan reagoi z-suuntaiseen staattiseen kenttään. Magnetisaatio pyörähtää z-akselin ympäri resonanssitaajuudellaan, jolloin x-suuntainen herätekenttä palauttaa sen takaisin z-akselin suuntaiseksi puolen kierroksen jälkeen. Häiriö on siis hyvin väliaikainen, eikä signaalia kerkeä juurikaan muodostua. Tästä syystä tilannetta tarkastellaan koordinaatistossa, joka pyörii näytteen resonanssitaajuudella z-akselin ympäri. Myös häiriöpulssi asetetaan pyörimään samalla taajuudella xy-tasossa. Tällöin magnetisaatio ja häiriöpulssi ovat koko ajan kohtisuorassa. Häiriön ollessa voimassa M 0 -vektori kääntyy xy-tasoon ja häiriötä jatkettaessa yhä kohti negatiivista z-akselia. Kuva 5 havainnollistaa herätekentän vaikutusta. Tämä toteutetaan resonanssitaajuisella vaihtovirralla, joka indusoi näytteeseen pyörivän häiriökentän. Magneettinen herätekenttä voi olla ns. jatkuvaherätteinen tai pulssiherätteinen. Nykyään käytetään lähinnä pulssiherätteistä menetelmää, sillä jatkuvaherätteinen menetelmä vaatii pitemmän heräteajan saadakseen kaikki halutut resonanssit viritettyä. Pulssiherätteinen menetelmä virittää samalla kertaa jonkin verran taajuuksia pulssin kantotaajuuden ympäriltä. 9

Pulsseja kuvataan asteluvulla sen mukaan, kuinka suuren kulman pulssin jälkeinen magnetoitumavektori muodostaa suhteessa ulkoiseen staattiseen magneettikenttään. Esimerkiksi 90 -pulssi kääntää magnetoitumavektorin xy-tasoon ja 180 -pulssi kääntää magnetoituman negatiivisen z-akselin suuntaiseksi. Kuva 5: Kuvassa aluksi magnetisaatiovektori on levossa z-akselilla (vas). Radiotaajuisen pulssin kohdistaminen x-suunnassa kaataa vektroin pyörivän koordinaatiston y-akselille (oik). Kyseessä on 90 -pulssi. 3.2.2 Signaalin havaitseminen Herätepulssi jättää magnetisaation asentoon, jolla on myös xy-tason suuntainen komponentti. Tämä pyörii z-akselin ympäri resonanssitaajuudella herätekentän poistamisen jälkeenkin. Magneettinen prekessio indusoi näytteen ympärillä olevaan kelaan vaihtojännitteen, joka on verrannollinen magnetisaation x- tai y-komponentin muutosnopeuteen. Tuleva signaali on muotoa s(t) = f dm x dt, (11) missä f kuvaa riippuvuutta signaalin ja magnetisaation muutosnopeuden välillä. Kyseessä on siis radiotaajuinen (RF) signaali. Magnetisaatio kuitenkin palautuu niin kutsuttujen relaksaatiomekanismien vuoksi z-komponentin suuntaiseen lepotilaan. Tällöin xysuuntainen komponentti pienenee suhteellisen nopeasti vaimentaen myös havaitun signaalin amplitudin. Kyseessä on eksponentiaalisesti vaimeneva signaali (FID, Free Induction Decay). 3.2.3 Fourier-muunnos Saamme menetelmän tuloksena vapaan vaimenemisen signaalin. Jotta tämä oskilloiva FID-käyrä voidaan muuttaa spektriksi, tarvitaan Fourier-muunnosta. Pulssiherätteisen menetelmän yksittäinen ajan funktiona esitetty pulssi, joka on muotoa P(t), voidaan muuntaa Fourier-muunnoksella taajuusjakaumaksi F (ν). Tällainen taajuusjakauma sisältää suuren määrän lähekkäisiä eritaajuisia herätesignaaleja. Tästä syystä lyhyt pulssi vaikuttaa useaan eri resonanssitaajuuksiseen ytimeen (resonanssitaajuuksien 10

erot johtuvat kemiallisesta siirtymästä, joka perustellaan myöhemmin). Ytimen i xy-tasossa aiheuttama signaali s i voidaan esittää sini- ja kosinifunktioiden avulla. Lyhyemmin se saadaan esitettyä kompleksisesti Eulerin kaavan avulla: s i = s i x + is i = Ae t T 2 [cos(2πν i t) + isin(2πν i t)] = Ae t T 2 e i2πν it, (12) missä A = 2πfM i 0ν 0, ν i on ytimen i resonanssitaajuus, ν 0 on referenssitaajuus, t on aika, f on signaalin riippuvuusfunktio ja ensimmäinen eksponenttitermi kuvaa relaksaatiota eli se aiheuttaa vapaan vaimenemisen. Tämän muotoinen signaali voidaan muuntaa taajuusjakaumaksi eli NMR-spektriksi Fourier-muunnoksella, jonka jälkeen kyseinen spektri on muotoa: S(ν) = Re(F (s i )) = AT 2 1 + 4π 2 T 2 2 (ν ν i ) 2. (13) NMR-spektri esittää kaikkien eri ydinten i taajuudet vaaka-akselilla ja signaalien intensiteetit pystyakselilla. Matemaattisesti käsittely on samanlainen usealle signaalille erikseen kuin yksittäisellekkin. NMR-spektristä voidaan tulkita kustakin kemiallisesta ympäristöstä lähtöisin oleva signaali (taajuusakseli) ja sen voimakkuus (piikin korkeus). Kuva 6 esittää spektrin syntyä. Kuva 6: Aika-signaali -tasossa oleva FID-signaali voidaan Fourier-muunnoksen avulla muuntaa taajuus-signaali -tasoon. Taajuus kasvaa vasemmalle tässä esitystavassa. Lähde: Hornak: The Basics of NMR 3.3 Kemiallinen siirtymä spektrissä Edellä esitetty ilmiö perustuu kunkin NMR-aktiivisen ytimen kohdalla samoihin fysikaalisiin ominaisuuksiin, joskin gyromagneettisen suhteen eroavaisuus aiheuttaa suuren eron 11

Larmor-taajuuteen eri ydintyypeillä. Menetelmä kuitenkin perustuu sille, että saamme tietoa ytimen kemiallisesta ympäristöstä sen resonanssitaajuuden avulla. Ydintä kiertävät elektronit aiheuttavat ytimelle pienen ulkoista magneettikenttää heikentävän, eli varjostavan, magneettikentän. Erilaisissa kemiallisissa eli elektronisissa ympäristöissä varjostava kenttä on hieman erilainen. Näin ollen eri ympäristöissä olevien ytimien resonanssitaajuudet ovat hieman erit. Tätä eroavaisuutta kuvataan kemiallisella siirtymällä δ, joka määritellään δ = ν ν ref ν 0 10 6 ppm. (14) Tässä ν on ytimen resonanssitaajuus (piikin paikka spektrissä), ν 0 on spektrometrin operointitaajuus, sekä ν ref on referenssiaineen taajuus, joka asetetaan nollakohdaksi. NMRspektrissä kemiallinen siirtymä kasvaa oikealta vasemmalle historiallisista syistä. Tällä menetelmällä taajuustason signaali normitetaan ulkoisesta magneettikentästä riippumattomaksi. Yksittäisen 90 -pulssin aiheuttaman NMR-signaalin esitys kemiallisen siirtymän funktiona on niin kutsuttu zg-koe. Kokeen tulosta kutsutaan tässä tapauksessa protonispektriksi, sillä se on mitattu 1H-ytimen suhteen. Signaalin voimakkuus on suoraan verrannollinen niiden ydinten määrään, josta signaali on lähtöisin. Puukudoksessa esiintyvän veden kannalta kyseinen menetelmä kuvastaa vain puussa esiintyvän kosteuden kokonaismäärää (signaalin voimakkuus), sillä kemiallinen siirtymä veden eri komponenttien välillä on hyvin pientä. Vaikka spektrin tuloksena saadaankin vain yksi leveähkö piikki, vapaa ja sidottu vesi puun rakenteessa näkyy selvästi puun relaksaatioajoissa. Myös epäsuoran spin-spin -vuorovaikutuksen ja suoran dipolivuorovaikutuksen aiheuttamat pienet muutokset ytimen kokemassa magneettikentässä aiheuttavat NMR-spektriin hienorakennetta. Suurilla biologisilla rakenteilla, kuten puukudoksella, ei ole tarkoituksenmukaista tarkastella protonispektrin hienorakennetta, sillä kemiallisen siirtymän arvot ovat likimain jatkuvat kompleksisten biologisten rakenteiden vuoksi. 3.4 Relaksaatio Signaalin havaitsemisen yhteydessä mainittiin relaksaatio, joka ilmiönä tarkoittaa prosesseja, jotka aiheuttavat termisestä tasapainosta poikkeutetun magnetisaation palautumista takaisin termiseen tasapainoon. Relaksaatio on hyvin merkittävä ilmiö lahoamisprosessin seurannan kannalta. Seuraavassa tarkastellaan relaksaatioon vaikuttavia tekijöitä, sen lajit sekä sovellutuksia. 12

3.4.1 Relaksaatiomekanismeja Lämpöliike aiheuttaa vaihtelevia magneettikenttiä näytteen ytimiin, jotka sopivilla taajuuksilla aiheuttavat muun muassa spintilojen välisiä siirtymiä. Relaksaatio palauttaa nettomagnetisaation takaisin tasapainotilaan. Relaksaatiota aiheuttavia mekanismeja ovat: Suora dipolivuorovaikutus: Ytimen spin aiheuttaa saman molekyylin toisessa ytimessä fluktuoivan magneettikentän molekyylin pyörimisliikkeen vaikutuksesta. Kemiallisen siirtymän anisotropia: Elektronien kiertoliikkeestä johtuva varjostava magneettikenttä muuttuu molekyylin asennon muuttuessa. Spin-rotaatiovuorovaikutus: Pyörivässä molekyylissä positiiviset ja negatiiviset varaukset aiheuttavat fluktuoivia magneettikenttiä, sillä ne käyttäytyvät paikallisten sähkövirtojen tavoin. On luonnollista otaksua, että eri vahvuisesti ympäristöönsä sitoutuneet vesimolekyylit kokevat relaksaatiomekanismeja eri tavalla. Veden ollessa tiukasti kiinni soluseinän rakenteessa, yksittäiset molekyylit kokevat enemmän relaksoivia voimia kuin vapaan veden tapauksessa. 3.4.2 T 1 -relaksaatio Spin-ympäristörelaksaatiossa eli T 1 -relaksaatiossa spinsysteemi luovuttaa herätepulssista saamansa energian ympäristöön. Tässä prosessissa tapahtuu näytteen energiatasojen muutoksia kohti termistä tasapainotilaa. Käytännössä tämä relaksaatio kuvaa magnetisaatiovektorin z-komponentin palautumista lepotilaansa. M z -komponentille saadaan esitys: d(m z M 0 ) dt missä M 0 on magnetoitumavektorin pituus tasapainotilassa. = M z M 0 T 1, (15) T 1 -aika voidaan määrittää kokeellisesti kääntämis-palautumismenetelmällä. Magnetoitumavektori käännetään 180 -pulssilla -z-akselin suuntaiseksi, ja sen annetaan palautua relaksaatiomekanismien vuoksi. Tässä vain T 1 -relaksaatio vaikuttaa, sillä muut relaksaatiotavat eivät vaikuta z-suuntaiseen komponenttiin. Magnetisaatio palautuu kohti positiivista z-akselia ajan funktiona. Ajan τ kuluttua M z :n pituus on M z (τ) = M 0 [1 2e τ T 1 ]. (16) 13

Kääntämis-palautumiskokeessa M z :n pituus luetaan 90 -pulssilla, sillä vain xy-tasossa oleva magnetoituma havaitaan spektrometrillä. Kun signaali menee nollaksi (hetkellä τ 0 ), pätee relaatio: T 1 = τ 0 ln2. (17) Tästä saadaan selvitettyä T 1 -aika tutkitulle näytteelle etsimällä signaalin nollakohta τ- ajan funktiona. Tarkempi menetelmä on tehdä sovitus käyrään 16 ottamalla useampi mittauspiste erilaisilla τ-viiveillä ja ratkaisemalla siitä tarkemmin T 1 -aika. Kyseinen koe on nimeltään T1ir-mittaus (T1 inversion recovery, suom. kääntämis-palautumiskoe). Mittauksen yksittäisen osan pulssisarja on esitetty kuvassa 7. Käyräsovitus on parempi menetelmä erityisesti silloin, kun näyte sisältää useita komponentteja, joilla on eri T 1 -ajat. Tällä menetelmällä voidaan sopivaa tietokoneohjelmaa käyttämällä sovittaa useampikin eksponenttikäyrä, jolloin eri komponenttien T 1 -ajat saadaan selville vain yhden keskimääräisen sijaan. Suoritettaessa NMR-mittausta, parannetaan signaali-kohinasuhdetta suorittamalla samat mittaukset kymmeniä, satoja tai peräti tuhansia kertoja. Mittausten välillä on näytteen annettava relaksoitua 3-5 kertaa T 1 -ajan verran, jotta uusi koe voidaan aloittaa tasapainosta. Tästä syystä on näytteiden T 1 -ajat tunnettava lähes aina mittauksia suoritettaessa. Kuva 7: T1ir-pulssisarja: aluksi 180 -pulssilla käännetään magnetoitumavektori ympäri. Odotetaan valitun relaksaatioviiveen verran jonka jälkeen luetaan signaali 90 -pulssilla. Lähde: Hornak: The Basics of NMR 3.4.3 T 2 -relaksaatio Spin-spinrelaksaatio eli T 2 -relaksaatio puolestaan kuvaa xy-tason suuntaisen magnetisaation komponentin vaimenemista tasapainoon, jossa tämän komponentin pituus on nolla. Toisin kuin edellä, T 2 -relaksaatio riippuu vain sellaisista mekanismeista, jotka eivät muuta systeemin kokonaisenergiaa. Yksittäisten ydinten keskinäiset orientaatiot voivat silti muuttua. T 2 -aikaa voidaan kuvata xy-tason magnetisaation M xy käyttäytymisellä 90-14

pulssin jälkeen ajan t kuluttua seuraavasti: M xy (t) = M 0 e t T 2. (18) T 2 -relaksaation lisäksi myös magneettikentän epähomogeenisuudet vaikuttavat xy-tason komponenttien vaimenemiseen nopeuttaen tätä pelkkään T 2 -relaksaatioon verrattuna, sillä epähomogeeninen magneettikenttä aiheuttaa magnetisaation eri osien prekessiota hieman eri taajuudella. Tällöin magnetisaatiovektori viuhkaantuu xy-tasossa. Tästä syystä T 2 -ajan selvittämiseen tarvitaan spin-kaikupulssisarjoja eliminoimaan viuhkaantumisen vaikutus. Spin-kaikupulssisarja on kokeellinen menetelmä, jolla kyetään mittaamaan näytteen T 2 - relaksaatioaika (kuva 8 kuvaa pulssien ajoitusta). Tässä menetelmässä aluksi magnetisaatio kaadetaan y-akselille suunnatun 90 -pulssin avulla, jolloin vektori alkaa prekessoimaan ja tapahtuu viuhkaantumista kuvan 9 mukaisesti. Ajan τ kuluttua magnetisaatio käännetään 180 x-pulssin avulla x-akselin ympäri, jolloin viuhka palautuu ajan 2τ kuluttua aloitushetkeen nähden takaisin yhdeksi kokonaiseksi magnetisaatiovektoriksi. Tällöin aiheutuu niin kutsuttu kaikusignaali, jonka jälkeen viuhkaantuminen alkaa uudelleen alkuperäistä vastakkaiseen suuntaan. Kaiun voimakkuuteen vaikuttaa vain T 2 -relaksaatio. Täten toistettaessa sama operaatio, seuraava kaikupulssi on vaimentunut T 2 -relaksaation vaikutuksesta. CPMG-mittauksessa (Carr, Purcell, Meiboom, Gill) kaiun jälkeen tasaisin väliajoin τ käytetään 180 -pulssia ja aiheutetaan yhä uusia kaikuja. Kaikujen intensiteetit ajan funktiona voidaan suoraan sovittaa T 2 -relaksaation käyrään. Samalla tavoin tietokoneavusteisesti, kuin aikaisemmin T 1 -ajoille, voidaan tähän käyrään sovittamalla selvittää T 2 -aika tai -ajat. Näytteen T 2 -aika on aina lyhyempi kuin T 1 -aika. Kuva 8: Spin-kaikupulssisarja: aluksi 90 -pulssi, jonka jälkeen annetaan magnetisaation viuhkaantua ajan τ, käännetään vektorin prekessiosuunta 180 x-pulssilla, ja odotetaan τ-viiveen ajan kaikusignaalia (tässä t E = 2τ). Kun 180 x-pulssi toistetaan useaan kertaan (CPMG-pulssisarja), syntyvien kaikujen intensiteetit noudattavat yhtälöä 18. Lähde: Hornak: The Basics of NMR 15

Kuva 9: Kuva havainnollistaa kaiun syntymistä spin-kaikukokeessa vaiheittain. A: Magnetisaatio on levossa. B: Magnetisaatio käännetään xy-tasoon RF-pulssilla. C: Epähomogeenisen kentän vuoksi pyörimistaajuus vaihtelee eri puolella näytettä. Magnetisaatio alkaa viuhkaantumaan. D: Magnetisaation komponentit pienentävät toisiaan ja edellisen kuvan FID vaimenee. E: Magnetisaatio käännetään x-akselin ympäri RF-pulssilla. F: Refokusoituminen tapahtuu päinvastaiseen suuntaan peilikuvan tavoin. G: Magnetisaatioviuhka kohtaa y-akselilla ja havaitaan kaiku. Lähde: Wikimedia commons, (10.10.2017) 3.4.4 Puukudoksen relaksaatiokomponentit Puun rakenteen yhteydessä todettiin puun sisältämän veden jakautuvan useaan komponenttiin vapausasteen perusteella. Erityisesti relaksaatioaikoihin tällä on suuri vaikutus, sillä ne riippuvat voimakkaasti näytteen koostumuksesta. Spin-ympäristörelaksaatio riippuu tästä ilmiöstä, ja puusta kuvannettu T 1 -spektri jakautuu komponentteihin. T 2 - relaksaation tapauksessa veden komponentit erottuvat vieläkin selvemmin, sillä se on paljon vähemmän ulkoisen staattisen magneettikentän aiheuttamaa (energiatasojen palautuminen), vaan lähinnä riippuu lähiympäristön siihen aiheuttamista magneettikentän fluktuaatioista. Puukudoksen sisältämän veden jakautumista komponentteihin on siis helpointa seurata T 2 -ajan avulla, sillä se muuttuu hyvin paljon veden vapausasteen funktiona. Pienin, muutaman millisekunnin mittainen T 2 -aika kuuluu soluseinämiin sidotulle vedelle. Muutaman kymmenen millisekunnin luokkaa oleva T 2 -aika kuuluu kesäpuun huokosten ja luumenien sisältämälle vedelle. Pisin T 2 -aika kuuluu puolestaan huokoisemman kevätpuun sisältämälle kaikista vapaimmalle vedelle. Erot kevätpuun ja kesäpuun välillä voidaan selittää sillä, että luumeneissa olevan veden T 2 -arvojen on havaittu skaalautuvan huokoskoon mukaisesti: Suuremmissa huokosissa T 2 -relaksaatiota aiheuttavia kytköksiä on vedelle vähemmän, jolloin relaksaatioaika pitenee. Tällöin relaksaationopeus 1/T 2 on kääntäen verrannollinen huokoskokoon [10, 11]. Vapaan ja sidotun veden välillä on joissakin tapauksissa pieni T 2 -komponentti, joka kuvastaa mikrohuokosissa olevaa, osittain vapaata vettä [12, 14]. Tämä komponenttijako on likimain riippumaton puun kosteuspitoisuudesta [13, 14]. 16

Koska komponentit vaihtelevat sekä T 1 -ajoiltaan että T 2 -ajoiltaan, on tehokkain keino niiden erottelemiseen esittää informaatio 2D-koordinaatistossa, jossa riippuvuus molempien suhteen saadaan käytettyä hyödyksi veden eri komponenttien määrien tulkitsemisessa. Erilaisilla numeerisilla integrointitekniikoilla saadaan suoraan selville komponenttien suhteelliset määrät integroimalla relaksaatiopiikit ja vertaamalla niitä koko signaalin voimakkuuteen. Relaksaatiomittaukset ovat tärkeitä nimenomaan siksi, että ne ovat teknisesti helppoja ja nopeita toteuttaa, sekä tarjoavat suoraan sieneen vaikuttaviin vesitekijöihin verrannollista informaatiota. NMR-relaksomeriaa on hyödynnetty aiemminkin puun kosteuden seurannassa [11, 12, 14, 15, 18]. 4 Magneettikuvaus Pelkän numeerisen datan sijaan usein halutaan suoraan kuvia tarkasteltavasta kohteesta. Kun puhutaan aineen rakenteesta, on hyödyllistä kyetä esittämään materiaalin rakennekuvia. NMR-kuvaus (magneettikuvaus, MRI eli Magnetic resonance imaging) on NMR-spektroskopian sovellusmenetelmä, jota käytetään paljon teollisuudessa ja lääketieteessä. Tämä perustuu magneettisiin kenttägradientteihin. Käyttämissämme menetelmissä kuvantamisessa käytettävänä ytimenä toimii 1 H samoista syistä, kuin aiemminkin. Magneettikuvauksen perusteet pohjautuvat lähteisiin [16-18]. 4.1 Gradientti Gradientilla tarkoitetaan paikan funktiona muuttuvaa magneettikenttää. Gradientti voi olla useampisuuntainen, mutta yksinkertaisin ja yleisimmin käytetty gradientti on lineaarinen ja yksisuuntainen, joka on muotoa B = B 0 + G z z, (19) missä B 0 on magneettikenttä, G z on gradientti eli kentän muutos ja z on paikkakoordinaatti gradientin suunnassa. Tällä tavoin näytteen magneettinen prekessiotaajuus saadaan riippuvaiseksi paikasta (tässä tapauksessa z-akselilla), jolloin se on muotoa ν = γ(b 0 + G z z). (20) 2π Pelkällä yksittäisellä RF-pulssilla saadaan homogeenisesta näyteaineesta näkyviin vain yksittäinen piikki. Puukudos on protonisignaalin näkökulmasta likimain homogeenista. Gradientin avulla saadaan kuitenkin paikasta riippuvaa informaatiota. Valitsemalla gradientin suunta ja RF-pulssin virittämä taajuusalue (pulssin leveys), saadaan kuvattua pulssin taajuutta muuttamalla erilevyisiä avaruudellisia osia haluamastamme kohdasta 17

näytettä. Tästä syystä MRI on menetelmänä erittäin käytännöllinen, sillä signaalit voidaan asettaa lopuksi paikkakoordinaatistoon. Gradienttia havainnollistaa kuva 10. Yksisuuntaisen virittämisen jälkeen kullakin z-akselin lokaatiolla esiintyvän signaalin taajuuden amplitudi on suoraan verrannollinen siihen määrään protoneja eli signaalin aiheuttajaa, joka sijaitsee kysesessä spatiaalisessa näytteen osassa. Näin voidaan muodostaa yksiulotteinen spintiheyskartta kuvattavasta kohteesta, jossa signaali kertoo resonoivien spinien tiheyden kyseisellä z-akselin paikalla. Gradientilla siis saadaan kuvattua näyte haluamastamme kohtaa. Lisäksi gradienttia hyödyntämällä saadaan tärkeää kuvausinformaatiota kappaleen rakenteesta, sillä resonanssitaajuus on tällöin paikasta riippuvainen, jolloin signaalin taajuus ja taajuuden vaihtelut paikasta riippuen voidaan suoraan yhdistää aineen fyysiseen rakenteeseen. Kuva 10: Gradientti tekee kentän näytteen pituussuunnassa paikkariippuvaiseksi, jolloin resonanssitaajuus muuttuu paikan funktiona. Kun halutaan näytteen puolivälistä kuva, käytetään viritystaajuutena sitä RF-pulssin taajuutta, johon näytteen puolivälissä olevan magneettikentän kokevat ytimet reagoivat. Lähde: Wikimedia commons (10.10.2017) 4.2 Moniuloitteinen kuvanmuodostus Koska haluamme kuvainformaatiota monessa suunnassa, tarvitaan useampisuuntaisia gradientteja. Kuva 11 pyrkii selventämään gradienttien vaikutuksen kuvanmuodostukseen: Ensin samanaikaisesti RF-pulssin kanssa asetetaan G s eli niin kutsuttu viipaleenvalintagradientti. Tämän avulla valitaan xy-taso haluamaltamme korkeudelta z-akselilla, kuten edellisessä kuvassa. Näiden pulssien sammuttamisen jälkeen tietyllä korkeudella olevat ytimet prekessoivat kaikki samalla taajuudella. Muut ytimet eivät prekessoi. Seuraavaksi valitaan esimerkiksi x-suuntainen G φ -gradientti, jota kutsutaan vaihekoodausgradientiksi. Vaihegradientin vaikutuksesta resonanssitaajuus muuttuu x-koordinaatin funktiona. Näin ollen aikaisemmat x-akselin ytimet prekessoivat hitaammin kuin myöhem- 18

min akselilla esiintyvät. Otettaessa vaihegradientti pois päältä, kukin ydin kokee saman staattisen vakiokentän, jolloin prekessionopeudet ovat yhtäsuuret. Tällöin vain prekessiovaihe riippuu x-koordinaatista. Vaihe määräytyy G φ -pulssin keston ja amplitudin perusteella. Lopuksi asetetaan y-suuntainen gradientti G f, joka on nimeltään taajuus- tai lukugradientti. Sen avulla ydinten resonanssitaajuus tulee riippuvaiseksi y-koordinaatista. Nyt kullakin samantaajuisella ytimellä on hieman eri vaihe x-suunnassa. Havaitsemalla signaalia ja tunnistamalla havaitun signaalin vaihe ja taajuus, se voidaan paikallistaa hyvin tarkkaan kolmiuloitteisessa avaruudessa. Vaiheen tunnistamiseksi prosessi on toistettava niin monella vaihegradientin arvolla, montako askelta vaihesuunnassa halutaan tunnistaa. Näin ollen paremman resoluution saavuttamiseksi on mittausaikaa pidennettävä. Signaalin prosessoiminen tapahtuu Fourier-muuntamalla raakadata ensin taajuuskoo- Kuva 11: Kolmiulotteisen magneettikuvauksen gradienttien ajastusdiagrammi. Lähde: Hornak: The Basics of MRI dauksen suunnassa. Tuloksena saadaan kyseisen akselin suunnassa näytteen muotoinen taajuusjakauma, jossa signaali yhä on prekessoiva vaihekoodauksen suunnassa. Fouriermuuntamalla data vielä tässä suunnassa löydetään piikki yhdeltä kohdalta myös vaiheakselilla, jolloin signaali on paikallistettu xy-tasossa. Tietoteknisesti informaatio tallennetaan niin kutsutun k-avaruuden datamatriisiksi, jossa data esitetään k:n funktiona. Tämän jälkeen Fourier-muunnoksella se saadaan muutettua kuvaksi. Käytännössä data siis Fourier-muunnetaan useassa suunnassa, jotta syntyvään kuvaan saadaan näkymään kukin paikka-akseli informaatioineen, niin kuin ne kuvattavassa kappaleessa ovat. Tällöin kappaleen rakenteen muutokset ovat totuudenmukaisesti nähtävissä jokaisessa suunnassa. Lopullisen tietokonekäsittelyn jälkeen saadaan näytteestä kolmiuloitteinen kuva, missä 19

signaalin voimakkuus on suoraan verrannollinen kullakin alueella olevien protonien määrään. Edistyneemmillä tietokoneohjelmilla tehdyn värikoodauksen jälkeen saadaan kuva kaksiuloitteiseksi, jossa alueen väri kuvantaa protonien määrää. Koska voimakkain signaali tulee vapaan veden alueista puunäytteen sisässä, voidaan magneettikuvasta suoraan nähdä alueet, jolla vapaata vettä esiintyy. Erityisesti kevätpuussa kuvan kirkkaus on suuri, sillä kevätpuun rakenteessa veden konsentraatio on suuri. Tällaista kuvaa, joka perustuu vety-ydinten spinien määrään tietyssä pienessä tilavuudessa, kutsutaan spintiheyskuvaksi. Spintiheyskuvassa nähdään kirkkaana alueet, jossa puun kuitukyllästyspiste on ylittynyt [19]. 4.3 Kuvan tarkkuus Tuotetun magneettikuvan tarkkuuteen vaikuttaa useat tekijät. Esimerkiksi vaikutusta aiheuttavat näytteen T 2 -ajat sekä gradienttiaskelten määrät kussakin suunnassa, viipaleen paksuus (z-suunnassa olevien erilaisten signaalien määrä yhden xy-tason pisteen kohdalla keskiarvoistuu yhdeksi signaaliksi, joka edustaa tätä pistettä) ja signaali-kohinasuhde. Useammalla pienemmällä viipaleella, suurella askelten määrällä ja useilla toistoilla saadaan mahdollisimman hyvä resoluutio ja signaali-kohinasuhde tarkasteltavasta puunäytteestä. 4.4 Menetelmistä Puusolukossa etenevän sienikasvuston toiminnan seuraamista voidaan toteuttaa useanlaisilla MRI-mittauksilla. Ainakin spintiheyskarttojen ja T 2 -karttojen tuottaminen tarkasteltavista näytteistä on tarkoituksenmukaista jo aiemmin esitetyn perusteella, sillä veden vapausasteet ja määrä korreloivat kyseisten ominaisuuksien kanssa. Esitettyjä mittauksia on hyödynnetty aiemminkin tarkasteltaessa veden lokaatiota puukudoksessa. [11, 14, 15, 19] Eräs MRI:n menetelmä on hyvin nopea magneettikuva, niin kutsuttu Flash-kuva. Sillä tarkoitetaan matalan pulssikulman (ei kaada magnetisaatiota täysin xy-tasoon) kuvantamista. Tässä signaali on vaimeampi mutta kokeen kesto on huomattavasti lyhyempi, sillä näytteen relaksaatiota ei tarvitse odottaa niin pitkään. Kyseisellä kokeella saadaan riittävästi informaatiota kertomaan, onko mittaaminen järkevää ja saadaanko signaalia tarpeeksi paljon. Tätä voidaan käyttää myös näytteiden kohdentamisessa ja siten vertailtavuuden parantamisessa. Spin-spin relaksaation ja spintiheyden tutkiminen magneettikuvausmenetelmillä (kuva 12 esittää kummallakin menetelmällä tuotetut kuvat puukudoksesta) tapahtuu tarkastelemalla jokaista pikseliä erikseen. Kukin pikseli erotellaan edellä esitellyllä monigradient- 20

tisella menetelmällä. Mitä parempi on resoluutio, sitä paremmin pienet spintiheyden ja T 2 -ajan erot havaitaan. T 2 -kartan muodostaminen tapahtuu samalla tavalla, kuin yksittäisen spin-kaikumittauksen suorittaminen. Kuvassa 11 esiintyvään pulssisarjaan lisätään refokusoiva 180 y-pulssi (ja samanaikainen viipaleenvalintagradientti). Spin-kaikumittauksen tavoin kaiku kerätään, tässä tapauksessa lukugradientin avulla, jonka jälkeen sykli toistetaan uudelleen. Kuva 13 havainnollistaa pulssisarjaa tässä tapauksessa. Tuloksena saadaan useampi spintiheyskuva, joiden kirkkaus vaimenee relaksaation myötä. Yksittäisten pikseleiden T 2 -ajat voidaan laskea samojen pikseleiden amplitudeista. Informaatio voidaan muuntaa yksittäiseksi T2- kartaksi, jossa kunkin pikselin T2-aika ilmenee kuvasta. Samoin voidaan T1-kartta muodostaa kääntämis-palautumiskokeen avulla yllä olevaa periaatetta noudattaen. Kuva 12: Tietokonekäsitellyt magneettikuvat eri tavoin käsitellyn männyn rakenteesta, radiaalisuunta on puun keskuksesta ulospäin ja tangentiaalinen tätä vastaan kohtisuora suunta puun leveyssuunnassa. Kuvasta nähdään selvästi erivärisinä ohuemmat kesäpuun ja paksummat kevätpuun juovat. a) Spintiheyskuvat. b) T 2 -kartat. Kuva on lainattu viitteestä [11] 21

Kuva 13: Kuvan 11 pulssisarjaan on lisätty spin-kaikumittauksille tyypillinen refokusoiva 180 y- pulssi (ylin rivi), jotka kaikuviiveen TE jälkeen tuottavat kaikusignaalin (alin rivi). TR kuvaa aikaa, jonka välein koe toistetaan. Saatu vaimeneminen sovitetaan T 2 -relaksaation yhtälöön pikseleittäin, ja tietokoneohjelmalla voidaan tuottaa valmis T 2 -kartta. Lähde: Hornak: The Basics of MRI Spintiheyskartta perustuu pitkään palautumisaikaan ja lyhyeen kaikuaikaan, jotta molempien relaksaatiotapojen vaikutus jää mahdollisimman vähäiseksi. Spintiheydelle on laskettavissa varsinaiset arvot relaksaatioyhtälöiden avulla tai suoraan verrannollisuudesta signaalin intensiteettiin. Spintiheysmittausten avulla voidaan erottaa hieman eri tavoin kudostyyppejä kuin relaksaatioon perustuvilla mittauksilla. [18, 20] 5 Johtopäätökset Kokoavasti voidaan todeta kappaleen 2.4.2 perusteella vapaan veden määrän korreloivan puun lahoamisprosessin edistymisen kanssa silloin, kun vapaata vettä ei ole enempää, kuin kriittinen kosteuspitoisuus edellyttää. Vapaan veden alueet myös kertovat lahoamisprosessin kunkin ajanhetken lokaatiosta, sillä sieni ei kykene helposti hyödyntämään soluseinämissä olevaa kosteutta. Kappaleen 3.4.4 perusteella voidaan löytää veden eri vapausasteet esitettäessä intensiteetti relaksaatioaikojen funktiona. Näistä tiedoista voidaan päätellä myös kvantitatiivisia kosteusominaisuuksia prosessin etenemiseen liittyen. Tarkastellaan esimerkkiä: Kun vapaata vettä, eli pitkiä relaksaatioaikoja on yhtä paljon kuin lyhyitä relaksaatioaikoja (sidottua ja mikrohuokosten vettä), voidaan ajatella sidotun veden olevan noin puolet puun kosteudesta. Intensiteettipiikkien integroinnilla saadaan selville, kuinka paljon kosteudesta on minkäkin komponentin aiheuttamaa suhteessa kokonaiskosteuteen. Kuitukyllästymispiste huomioi vain sen veden, joka ei ole luumeneissa, vaan mikrohuokosissa 22

ja sidottuna soluseinämissä. Koska kuitukyllästymispiste männyllä on noin 30%, ja tässä esimerkissä integroinnin perusteella puolet vedestä osallistuu tämän sidotun kosteuden muodostamiseen, niin selvästi yhtä suuri vesimäärä on vapaana. Tällöin voidaan päätellä puun kosteuspitoisuudeksi 60% ilman puun kuivattamista. Puun kuivamassa tietysti vähenee prosessin edetessä, mutta tällä tavoin voidaan havaita, onko kosteus tietyllä hetkellä suotuisa lahoamiselle. Pelkästään jo NMR-osuus tarkastelusta antaa hyvin paljon informaatiota prosessista. Magneettikuvausta voidaan käyttää lahoamisen seurantaan. Erityisesti voidaan kuvan 12 esittämistä männyn palasista huomata, että puun rakenne ilmenee hyvin selkeästi magneettikuvissa, kunhan kosteus on vain riittävä. Ilman sienenkin vaikutusta kevät- ja kesäpuu on erotettavissa erittäin hyvin. Esimerkiksi kuvassa b) nähdään, miten referenssipalikoilla kesäpuun T 2 -aika on noin 20-30 millisekuntia, kun taas kevätpuun T 2 -ajat ovat korkeammat (40-50 millisekuntia). Tämä on vastaava tulos, kuin aiemmin kappaleessa 3.4.4. Voidaankin päätellä, että sienen tuhotessa puun rakennetta vesi vapautuu entisestään ja prosessin paikka tulee selkeämmin erottuvaksi. Koska sieni kykenee käyttämään vain vapaata vettä, on voimakkaan spintiheyssignaalin tai pitkien T 2 -aikojen seuraaminen tietokonekäsitellyistä kuvista helppo tapa tutkia lahoamisprosessin lokaatiota. On kuitenkin otettava huomioon mahdollisuus, että jokin tuntematon syy saa vapaata vettä kertymään puurakenteeseen ilman varsinaista lahottajan läsnäoloa. Tämän kuitenkin pitäisi pystyä päättelemään ympäröivistä olosuhteista muiden lahoamista ennustavien indikaattoreiden perusteella. Erityisesti vaurioiden paikantamiseen ja laajuuden kartoittamiseen menetelmä soveltuu, mikäli tekninen toteutus sen sallii. Menetelmä vaatii kuitenkin paljon testausta ja käytännön tutkimustyötä, vaikka peruslainalaisuudet ymmärretään ja ne perustelevat NMR:n ja MRI:n käytön toimivuuden. Lahottamisprosessille merkittävät tekijät ovat lämpötila, kosteus ja aika. Niitä voidaan säädellä tarkoitukseen kehitetyllä lahotustekniikalla. Kellarikesikkä lahottajana on lahotuskokeille hyvin suotuisa siksi, että puun korkean optimaalisen lahoamiskosteuspitoisuuden vuoksi puun rakenteessa on nopean lahoamisen aikana hyvin paljon vettä. Lahotuksen nopeus auttaa myös mittausten toteuttamisessa, sillä lahotusjaksoon ei tarvitse varata kovin pitkää aikaa. Hitaammilla sienilajeilla jakso voisi venyä epäkäytännöllisen pitkäksi. Lisäksi aggressiivisen sienilajin käyttäytymisen ymmärtäminen on hyödyllisempää kuin ei-aggressiivisen, sillä tällaiseen lahoamiseen varautumisen on oltava ennakoivampaa. Koska kellarikesikkä kykenee käyttämään puun rakenteesta ravinnokseen vain selluloosaa ja hemiselluloosaa (2.4.1), täydellisen lahoamisen jälkeen sieni kuolee jättäen puusta 23

jäljelle noin 30 40% alkuperäisestä kuivamassastaan, sekä osan itse sienen massaan liittyvistä komponenteista [22]. Lahotusprosessin valmistuttua voidaan kuivattamalla ja punnitsemalla tarkastaa, kuinka täydellisesti prosessi tapahtui. Saatuja tutkimustuloksia voidaan verrata puun lahoamisen täydellisyyteen ja vetää siitä johtopäätöksiä. Tätä tietoa voidaan myös hyödyntää lahotusjärjestelyiden parantamiseksi, jotta olosuhteet saadaan optimoitua. NMR-spektroskopia ja MRI todella ovat menetelmiä, joiden käyttö puukudoksen lahotustutkimuksessa on hyvin monipuolista, ja edellä esitetyn tarkastelun puitteissa myös hyvin tarkoituksenmukaista. Mahdollisesti tulevaisuudessa kannettavat MRI-laitteet tarjoavat työkaluja jopa itse lahoavissa kohteissa tapahtuvaan piilevien rakennemuutosten kaikuluotaukseen ja vikojen paikantamiseen ja ennustamiseen. Menetelmä on ehdottomasti kehityskelpoinen tässä tarkoituksessa. 6 Kirjallisuusviitteet Viitteet [1] P. O. KETTUNEN: Puun rakenne ja ominaisuudet, Materiaaliopin laitos, Tampereen Teknillinen Korkeakoulu, (2001). [2] S. M. HYDE, P. M. WOOD: A mechanism for production of hydroxyl radicals by the brown-rot fungus Coniophora puteana: Fe(III) reduction by cellobiose dehydrogenase and Fe(II) oxidation at a distance from the hyphae Microbiology, 143, 259-266, (1997) [3] https://www.ouka.fi/oulu/ppm/laho (19.7.2017) [4] F. C. WILLIAMS, M. D. HALE: The resistance of wood chemically modified with isocyanates: the role of moisture content in decay suppression International Biodeterioration & Biodegradation Volume 52, Issue 4, December 2003, Pages 215-221 [5] http://www.blackmould.me.uk/coniophora%20puteana.html (19.7.2017) [6] V.-V.TELKKI: Spektroskooppiset menetelmät, NMR-spektroskopia, Oulun Yliopisto, luentomateriaali, (2015). [7] M. PATANEN: Ydin- ja hiukkasfysiikka, Oulun Yliopisto, luentomateriaali, (2017). [8] J. KEELER: Understanding NMR spectroscopy, 2 nd edition, Chichester: John Wileys & sons, LTD, (2010). [9] J. P. HORNAK: Basics of NMR, https://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/index.html, (1997) (9.1.2018) 24

[10] R. S. MENON, YM: Quantitative Separation of NMR Images of Water in Wood on the Basis of T2, Journal of magnetic resonance 82, (1989) [11] M. A. JAVED, P. M. KEKKONEN, S. AHOLA, V.-V. TELKKI: Magnetic resonance imaging study of water absorption in thermally modified pine wood, Holzforschung, (2014) [12] G. ALMEIDA, YM: A NMR study of water distribution in hardwoods at several equilibrium moisture contents, Wood science and technology, (2007) [13] R. S. MENON, YM: An NMR determination of the physiological water distribution in wood during drying, Journal of Applied Polymer science, (1987) [14] V.-V. TELKKI, YM: Moisture in softwoods: fiber saturation point, hydroxyl site content, and the amount of micropores as determined from NMR relaxation time distributions, Holzforschung Vol.67(3), pp.291-300, (2013) [15] P. M. KEKKONEN, YM: Absorption of Water in Thermally Modified Pine Wood As Studied by Nuclear Magnetic Resonance, Journal Of Physical Chemistry C, Vol.118(4), pp.2146-2153, (2014) [16] D. G. NISHIMURA: Principles of Magnetic Resonance Imaging, Department of Electrical Engineering, Standford University, (1996) [17] C. WESTBROOK: MRI at a Glance, (2002) [18] J. P. HORNAK: The Basics of MRI, https://www.cis.rit.edu/htbooks/mri/ (1997) (9.1.2018) [19] U. MÜLLER, YM: Detection of fungal wood decay using Magnetic Resonance Imaging, European journal of wood and wood products, Volume 59, (2001) [20] http://courses.washington.edu/bioen508/lecture7-mri.pdf, (26.7.2017) [21] D. M. GRIFFIN: Water potential and wood-decay fungi, Annual Review of Phytopathology, 15 (1977), pp. 319-329 [22] E. NOVAES, YM: Lignin and Biomass: A Negative Correlation for Wood Formation and Lignin Content in Trees, Plant physiology, (2010) 25