(12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT (10) FI B. (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats. (51) Kv.lk. - Int.kl.

Transkriptio

1 (12) PATENTTIJULKAISU PATENTSKRIFT FI SUOMI - FINLAND (FI) PATENTTI- JA REKISTERIHALLITUS PATENT- OCH REGISTERSTYRELSEN (10) FI B (45) Patentti myönnetty - Patent beviljats (51) Kv.lk. - Int.kl. CO7K 14/285 ( ) CO7K 1/36 ( ) A61K 39/102 ( ) (21) Patenttihakemus - Patentansökning (22) Tekemispäivä - Ingivningsdag (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet US P (73) Haltija - Innehavare 1 Wyeth Holdings Corporation, Five Giralda Farms, Madison, NJ 07940, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (72) Keksijä - Uppfinnare 1 Zlotnick, Gary W., 21 Woodlyn Way, Penfield, NY 14526, AMERIKAN YHDYSVALLAT, (US) (74) Asiamies - Ombud Kolster Oy Ab, Iso Roobertinkatu 23, Helsinki (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Ei tyypittävissä olevan Haemophilus influenzaen puhdistettu P5 proteiini rokotteena ei tyypittävissä olevalle Haemophilus influenzae -kannalle Renat P5 protein av icke-typbar Haemophilus influenzae som vaccin mot en icke-typbar Haemophilus influenzae -stam (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer Munson, Robert S. et al., "Purification and partial characterization of outer membrane proteins P5 and P6 from Haemaphilus influenzae type b", Infection and Immunity, syyskuu 1985, vol. 49, nro 3, p , Munson, Robert S. et al., "Molecular cloning and sequence of the gene for outer membrane protein P5 of Haemophilus influenzae", Infection and Immunity, syyskuu 1993, vol. 61, nro 9, p (57) Tiivistelmä - Sammandrag Esillä oleva keksintö koskee Haemophilus influenzae -bakteerikannan P5-ulkomembraaniproteiinia ja siihen kohdistettuja vasta-aineita. Keksintö koskee myös menetelmää P5-proteiinin eristämiseksi ja rokotekoostumusta käytettäväksi Haemophilus influenzae -infektion hoidossa. Föreliggande uppfinning avser ett P5 yttre protein hos Haemophilus influenza bakteriestammen och däremot riktade antikroppar. Uppfinningen avser även ett förfarande för isolering av P5 protein och en vaccinationskomposition för att användas vid behandling av Haemophilus influenza infektioner.

2 1 Ei tyypittävissä olevan Haemophilus influenzaen puhdistettu P5 proteiini rokotteena ei tyypittävissä olevalle Haemophilus influenzae -kannalle 5 Keksinnön ala Esillä oleva keksintö koskee Haemophilus influenzae -bakteerikannan P5-ulkomembraaniproteiinia ja P5-proteiiniin kohdistettuja vasta-aineita. Keksintö koskee myös menetelmää P5-proteiinin eristämiseksi ja rokotekoostumus- 10 ta käytettäväksi Haemophilus influenzae -infektion hoidossa. Keksinnön tausta Haemophilus influenzae -kannat jaetaan kahteen ryhmään, tyypitettävissä oleviin ja ei-tyypitettävissä ole- 15 viin. Kannat, joissa on tunnettu kapseli, tyypitetään kapselin serologisen reaktion avulla käyttäen referensslantiseerumia. Nykyisin tyypit a f on identifioitu tyypitettävissä oleviksi. Kannat, joilla ei ole kapselia ja jotka eivät reagoi minkään referenssiantiseerumin kanssa, ovat 20 ei-tyypitettävissä olevia. Ei-tyypitettävissä olevat Haemophilus influenzae (NTHi) -infektiot aiheuttavat useita tautitiloja mm. välikorvantulehdusta, sivuontelotulehdusta ja kroonista ahtauttavaa keuhkosairautta (COPD). Haemophilus influenzae 25 tyyppi b (Hib) on aivokalvontulehduksen ja muiden tarttuvien infektioiden pääasiallisin aiheuttaja alle 4-vuotiailla lapsilla. Organismien kapselin polysakkarideja vastaan kohdistetut vasta-aineet ovat bakterisidisia, opsonisia, in vitro, ja suojaavia koe-eläimissä ja ihmisis- 30 sä. Tässä käytettynä opsoninen määritellään mikro-organismien pinnan muokkaamisena siten, että fagosyytit voivat paremmin ne siepata. Koska turvallisia ja tehokkaita rokotteita Haemophilus influenzae tyyppi B -taudin estämiseksi on valmistettu, kaikki rokotteet perustuvat siihen, 35 että tuotetaan vasta-aineita polysakkaridikapselille, joka

3 2 on bakteerissa soluseinämän ulkopuolella. Haemophilus influenzae -kantojen NTHi-kannoilta selvästikin puuttuu kapseli. Siksi vasta-aineet kapselia vastaan eivät ole tehokkaita HTHi-infektioiden estämisessä. 5 Kiinnostuksen kohteena on karakterisoida Haemophilus influenzae -bakteerin ulkomembraaniproteiineja ja lisätä sen rokotepotentiaalia. Munson et al., (J. Clin. Invest, 72 (1983) ) raportoi P2:n, Haemophilus influenzae -kantojen eräiden pääasiallisimpien ulkomemb- 10 raaniproteiinien, puhdistuksen ja karakterisoinnin. Tutkijat havaitsivat, että P2-proteiinia on suuria pitoisuuksia, se on helposti puhdistettavissa ja se indusoi suojaavaa vasta-ainetta kaneissa. P5-proteiinin ajatellaan olevan assosioituneena ulkomembraanin proteiinikerrokseen, ja 15 se uutettiin aiemmin liuottamalla natriumdodekyylisulfaatilla (SDS) ja fraktioimalla orgaanisella liuottimella. (Coulton et al., Can. J. Microbiology 20 (1983) ). On arveltu kuitenkin, että SDS:n käyttö saattaa denaturoida proteiinit tietyissä tapauksissa. 20 Munson ja Granoff (American Society of Microbiology (sivu 544, 1985)) ovat raportoineet P5- ja P6-proteiinien osittaisen karakterisoinnin. Tulokset osoittivat, että vaikka P6:n soluseinämäkompieksi synnytti kaneissa vastaaineita, joilla oli suojaavaa aktiivisuutta rotanpoikas- 25 mallissa, P5 ei tuottanut vasta-ainetta, joka olisi suojaava rotanpoikasissa, eikä sen vasta-aine, jolla oli immunofluoresenssiaktiivisuutta in vitro, reagoinut bakteerin pinnan kanssa immunofluoresenssissa. Perustuen näille havainnoille alan ammattimiehet päättelivät, että P5 ei 30 ollut rokote-ehdokas Haemophilus influenzae typpi b:n aiheuttaman taudin estämiseksi. Keksinnön yhteenveto Esillä olevan keksinnön kohteena on siten antaa käyttöön oleellisesti puhdas Haemophilus influenzae -bak- 35 teerin P5-ulkomembraaniprotelini, vasta-aineita P5-pro-

4 3 teiinia vastaan ja rokotekoostumus käytettäväksi Haemophilus influenzae:n infektiivisten kantojen hoidossa. Esillä olevan keksinnön kohteena on edelleen antaa käyttoon menetelmä P5-proteiinin puhdistamiseksi Haemoahl: 5 lus influenzae -bakteerin ulkomembraanista ja saada proteiini, jota voidaan käyttää aktiivisten vasta-aineiden tuottamiseksi. Näin P5:a voidaan käyttää tuottamaan rokotetta NTH1:11e ja Haemophilus influenzae:n tyyppi b -kannoille. Keksintö tullee perusteellisemmin ymmärretyksi 10 viittaamalla seuraaviin kuvioihin ja yksityiskohtaiseen kuvaukseen. Kuvioiden lyhyt kuvaus Kuvio 1: Kuviossa 1 on natriumdodekyylisulfaatti- (SDS)-geeli puhdistetusta ei-tyypitettävissä olevasta ja 15 tyyppi B:n P5-proteiineista. Sarakkeessa 1 oleva kaksoisjuova edustaa P5-proteiinin lämpämodifioitua ja ei-lämpömodifioitua muotoa. Kuvio 2: Kuviossa 2 on aminoha.pposekvenssi puhdistetusta P5-protelinista, joka kykenee synnyttämään bakte- 20 risidisen vasta-aineen. Kuvio 3: Kuviossa 3 on kokosolun ELISA-päätepistetiltterit, jotka ovat muodostuneet kanin antiseerumista NTHi P5:a kohtaan. Kuvio 4: Kuviossa 4 on kokosolun ELISA-päätepiste- 25 tiitterit, jotka ovat muodostuneet hiiren antiseerumista NTHi P5:a kohtaan. Kuvio 5 Kuviossa 5 on P5-antiseerumin bakterisidinen aktiivisuus P860295:stä useata eri ei-tyypitettävissä olevaa Haemophilus-kantaa vastaan. 30 Edullisen suoritusmuodon yksityiskohtainen kuvaus Esillä oleva keksintö koskee ei-tyypitettävissä olevien Haemophilus influenzae -bakteereiden puhdistettua P5-ulkomembraaniprotaiinia. P5-proteiini on KD:n lämmöllä modifioitavissa oleva ulkomembraaniproteiini, 35 jossa on sekä konservoitunut että variaabeli alue.

5 4 P5-proteiinilla on useita ominaisuuksia, jotka tekevät siitä (ja PePtideistä ja proteiineista, joilla on P5-proteiinin epitoopit) erityisen arvokkaan rokotteeksi ei-tyypitettävissä olevaa Haemophilus influenzae:a vas- 5 taan. Tässä käytettynä epitooppi määritellään antigeenin alueena, johon vasta-aineen variaabeli alue sitoutuu. Useimmilla antigeeneilla on useita epitooppeja ja siksi polyvalentti antiseerumi antigeenille sisältää paljon eri vasta-aineita, joista kukin vasta-aine kykenee sitoutumaan 10 eri epitooppeihin antigeenilla. Päin vastoin kuin tunnetussa tekniikassa julkaistuissa raporteissa, P5-proteiini kykenee synyttämään vasta-aineita, jotka reagoivat bakteerin pinnan kanssa ja ovat bakterisidisia. Protelini on puhdistettu ja sen on osoitettu indusoivan immuunivasteen 15 ei-tyypitettävissä olevan Haemophilus influenzae:n eri kantoja vastaan. Esillä olevan keksinnön proteiineilla ja peptideillä on yhteinen epitooppi P5-proteiinin kanssa ja ne ovat sen kanssa immunologisesti ristireagoivia. Ne voivat si- 20 säitää fragmentteja tai oligopeptidejä, jotka sisältävät P5-proteiinin epitooppeja. Tässä käytettynä oligopeptidit määritellään muutaman monomeerisen toistoyksikön polymeerisinä ketjuina. P5-protelinin N-terminaalinen aminohapposekvenssi on määritetty ja nähdään kuviossa 5. Esillä ole- 25 van keksinnön peptidit ja Proteiinit sisältävät minkä tahansa peptidin tai proteiinin, jolla on ainakin, osa aminohapposekvenssistä, joka on kuvattu kuviossa 2, tai mitä tahansa biologisesti ekvivalentteja sekvenssejä. Muunnetut sekvenssit sisältävät sekvenssejä, joissa funktionaalises- 30 ti ekvivalentit aminohappotähteet korvataan sellaisilla tähteillä sekvenssissä, jotka johtavat hiljaiseen muutokseen. Esimerkiksi yksi tai useampi aminohappotähde sekvenssissä voidaan korvata toisella aminohapolla, jolla on sama polaarisuus, joka toimii funktionaalisesti ekviva- 35 lenttina johtaen hiljaiseen muutokseen. Korvaavat aminoha-

6 5 pot sekvenssissä olevalle -aminohapolle voidaan. valita sen luokan muista jäsenistä, johon aminohappo kuuluu. Esimerkiksi ei-polaariset (hydrofobiset) aminohapot sisältävät glysiinin, alaniinin. leusiinin, isoleusiinin, valiinin, 5 proliinin, fenylalaniinin, tryptofaanin ja metioniinin. Polaariset neutraalit aminohapot sisältävät seriinin, treoniinin, kysteiinin, tyrosiinin, asparagiinin ja giutamiinin. Varatut (emäksiset) aminohapot sisältävät arginiinin, lysiinin ja histidiinin. Negatiivisesti varautuneet 10 (happamat) aminohapot sisältävät asparagiinihapon ja glutamiinihapon. Esillä olevan keksinnön peptidit ja proteiinit sisältävät myös fragmentteja tai oligopeptidejä, joilla on sekvenssissä edustettuina olevia P5-proteiinin enitooppeja 15 tai_ tällaisten fragmenttien tai epitooppien mitä tahansa analogeja. Lisäksi mikä tahansa peptideistä tai proteiineista voidaan modifioida muihin molekyyleihin konjugpintia. varten, esim. kiinnittämäilä kytkeviä ryhmiä, kuten aminohappoja kysteiini ja lysiini, tai muita kytkeviä ryh- 20 miä. Kuten jäljempänä on yksityiskohtaisesti kuvattu, P5-proteiini ja tämän keksinnön peptidit ja proteiinit ovat käyttökelpoisia useissa eri muodoissa (esim, yksin tai seoksissa) rokotteissa. Näihin tarkoituksiin peptidit 25 ja proteiinit tuotetaan eristämällä Haemophilus influenzae;sta tai svntetisoimalla kemiallisesti tai mahdollisesti biotekniikan keinoin, kuten rekombinantin ekspressiolla eri isäntäsoluissa. Natiivi P5-proteiini puhdistetaan Haemophilus in- 30 differentiaalisella detergenttiuuttomenetelmällä. Menetelmään ei sisälly denaturoivien eikä pelkistävien. aineiden, kuten natriumdodekyylisulfaatin ja 2-merkaptoetanolin käyttöä, tässä järjestyksessä, jotka voivat tuhota tärkeitä proteiinin antigeenisia epitooppeja, ja 35 joita ei laajalti pidetä turvallisilla ihmisille annettaviksi.

7 6 Menetelmä vaatii ensin Haemophilus influenzae -solujen ulkomembraanikomponenttien saamisen. Ulkomembraanikomponentit voidaan valmistaa kokonaissolumembraanifraktiosta- KOkonaismembraanifraktiot on tyypillisesti valmis- 5 tettu differentiaalisedimentaatiolla Haemophilus influenzae -solujen hajottamisen jälkeen sellaisilla menetelmillä kuten sonikointi, jauhaminen tai puristaminen ranskalaisen puristimen läpi tai muulla homogenisointilaitteella. Kokonaismembraanifraktio fraktioidaan sen jälkeen sisä- ja ui- 10 komembraaneihin tiheysgradienttisedimentaatiolla tai sisämembraaniainesosien differentiaalisolubilisaatiolla tietyillä detergenteillä kuten POlYoksietyleenioktyylifenolilla (Triton X-100") tai N-lauroyylisarkosiinilla, natriumsuolalla (sarkosyyli). Edullisessa suoritusmuodossa 15 ulomman membraanin komponentit valmistetaan sisempien membraanien differentiaalisolubilisaatiolla 0,1-2-%:isella (w/v) Triton X-100:lla 100 mm HEPES-NaOH:ssa, 1 mm mgc1,:ssa, ph 7,4. Tämä uutto suoritetaan tyypillisesti kahdesti. 20 Ulkomembraanikomponenttien vaihtoehtoinen lähde, Haemophilus influenzae:n kasvatusalusta, on käyttökelpoinen. Alusta sisältää bakteerin uikomembraanin suojakomponentteja (joita kutsutaan "blebn :eiksi). Katso Loeb, M.R., infection and immunity 55/11 (1987) P5-proteiinin liukeneminen ulkomembraani-soluseinämä-kompleksista saavutetaan sen jälkeen kolmivaiheisella differentiaalisolubilisaatiolla. Ensimmäisessä vaiheessa käytetään 0,1-10-%:ista, tyypillisesti 0,1-2-%:ista (w/v) dodekvylisulfobetaiinin (Zwittergent" 3-14) vesi- 30 liuosta poistamaan ulkomeinbraaniproteiinit. Edullisesti käytetään 1-%:ista liuosta ja uutto tehdään yleensä 2 3 kertaa. ZwittergentTM 3-14 ja 0,5 M NaCl-uuttojen jälkeen P5-proteiini liu tetaan 1-%:isella sarkosyylillä 50

8 7 mm Tris-HC1:ssä, ph 8, 5 mm Na2EDTA:11a. Uutteet säädetään 1-*:isiksi Zwittergent" 3-14:n suhteen samaan puskuriin ja dialysoidaan kymmenkertaista 1-%:isen zwittergenttm 3-14:n ylimäärää vastaan 50 mm Tris-HC1:ssä, ph 8, 5 mm 5 Na2EDTA:ssa (3x) yli 24 tuntia. Sen jälkeen dialysoitu uute ajetaan anioninvaihtopylvään (DEAE) ja kationinvaihtopylvään (8) läpi, jotka on kytketty peräkkäin. Pylväät erotetaan ja S-pylväs eluoidaan nousevalla suolagradientilla samassa Zwittergent:iä sisältävässä puskurissa. Puhdis 10 tettu 135-Protelini eluoituu Yhtenä Piikkinä SD8-PAGE-analyysin mukaan (kuvio 1). Tällä menetelmällä puhdistetussa P5-proteiinissa on suhteellisen vähän bakteeriendotoksiinia, ja se sopii annettavaksi ihmisille. P5-proteiinin puhdistettu preparaat 15 ti formuloidaan sen jälkeen yksin farmaseuttiseksi koostumukseksi, kuten esimerkiksi rokotteeksi Haemophilus influenzae:lle, tai seoksessa adjuvanttien kanssa ja/tai muiden organismien antigeenien kanssa, jotka liittyvät välikorvantulehdukseen tai muihin tauteihin. Haluttaessa 20 proteiini fragmentoidaan standardeilla kemiallisilla tai entsymaattisilla tekniikoilla antigeenisten segmenttien tuottamisaksi. Tämän keksinnön peptidit ja proteiinit voidaan syntetisoida kemiallisesti aminohapposekvenssin mukaan, joka 25 nähdään kuviossa 2, tai edellä kuvattujen tämän sekvenssin muunnelmien mukaan. Mikä tahansa standardi kemia peptidien ja proteiinien kiinteä- tai nestefaasisynteesille on käyttökelpoinen. Kemiallinen synteesi voi olla erityisen sopiva oligopeptidien tuottamiseksi, joilla on P5 -proteiinin 30 epitoopit. Kokemus vasta-aineista Haemophilus influenzae:n kapselin polysakkaridille osoittaa, että vasta-aineiden kyky tappaa bakteerit in vitro -määrityksissä korreloi hyvin kykyyn synnyttää suojaava immuunivaste ihmislapsilla 35 (Fedea et al., 3. Infeot. Dis. 150 (1989) ).

9 8 Anti-P5-proteiinin vasta-aineet, jotka ovat syntyneet vasteena tämän keksinnön peptideille ja proteiineille, testataan käyttäen samanlaisia in vitro -määritysjärjestelmiä, jotta voidaan demonstroida kyky tappaa Haemo- 5 philus influenzae -soluja. Nämä tulokset osoittavat samanlaista korrelaatiota P5-proteiinin mahdollisuudelle saada aikaan suojaava immuunivaste ja toimia rokotteessa ihmislapsille, lapsille ja aikuisille. In vitro -komplementtivälitteinen bakterisidisyys- 10 määritys (Musher et al., Infect. Immun. 39 (1983) , Anderson et al., 3. Clin. Invest. 51 (1972) 31-38), jota on aikaisemmin käytetty mittaamaan PRP:n ja lipopolysakkaridien (LPS) vasta-aineiden bakterisidista aktiivisuutta Haemophilus influenzae:a vastaan, on käyttökelpoi- 15 nen sen määrittämiseksi, onko vasta-aineella, joka on kohdistettu tiettyä peptidiä, proteiinia tai sen fragmenttia vastaan, bakterisidista aktiivisuutta ei-tyypitettävissä olevaa Haemophilus influenzae:a vastaan. Esillä olevan keksinnön peptidit ja proteiinit ovat 20 käyttökelpoisia immunogeeneina alayksikkörokotteissa rokotettaessa ei-tyypitettävissä olevaa Haemophilus influenzae:a vastaan. Rokotteet ovat hyödyllisiä estämään tai vähentämään alttiutta akuuttiin välikorvantulehdukseen ja muihin tauteihin, joita ei-tyypitettävissä olevat organis- 25 min kannat aiheuttavat, yleensä rokottamaan lapsia tai aikuisia välikorvantulehdusta vastaan tai lapsille, joilla on riski sairastua välikorvantulehdukseen tai muihin sairauksiin (esimerkiksi lapset, joilla on ollut korvatulehduksia). 30 Tämän keksinnön peptidit ja proteiinit formuloidaan univalentteina ja muitivalentteina rokotteina. Tässä käytettynä univalentit rokotteet määritellään yksikomponenttisina ja multivalentit rokotteet määritellään monikomponenttisina.

10 9 Itse P5-proteiinia käytetään edellä kuvatuilla menetelmillä tuotettuna tai eristettynä tai sekoitettuna muihin antigeeneihin. Tämän keksinnön peptidit tai proteiinit annetaan 5 multivalenttelna alayksikkörokotteina yhdessä muiden Haemophilus influenzae:n antigeenien kanssa. Kuten on mainittu peptidit ja proteiinit, joilla on P5-proteiinin epitooppeja, herättävät bakterisidisia vasta-aineita, jotka toimivat synergistisesti Haemophilus 10 influenzae:n tapossa muiden Haemophilus influenzae:n ulkomembraaniproteiineja vastaan olevien vasta-aineiden kanssa. Keksinnön suoritusmuodossa P5-proteiinia (tai peptidiä tai proteiinia, joilla on sen kanssa yhteinen epitooppi) annetaan siis Yhdessä muiden Haemophilus influenzae:n ui- 15 komembraaniproteiinien (tai peptidien tai proteiinien, joilla on sen epitoopit) kanssa synergistisen bakterisidisen aktiivisuuden saavuttamiseksi. Erityisen edullisia Haemophilus influenzae:n ulkomembraaniproteiineja ovat peptidoglykaardinassosioituneet ulkomembraanilipoproten- 20 nit (PAL) ja Haemophilus-lipoproteiini PCP, jonka ovat kuvanneet Deich, P.A. et al., J. Bacteriol. 170/2 (1988) , joka on liitetty tähän viitteenä. Annettaessa P5-proteiinipeptidiä yhdessä muiden ulkomembraaniproteiinien epitooppien kanssa se joko annetaan erikseen, seokse- 25 na tai konjugaattina tai geneettisenä fuusiopeptidinä tai -protelinina. Esimerkiksi PAL:a, PCP:tä tai mitä tahansa proteiinia, peptidiä tai niistä peräisin olevaa epitooppia annetaan seoksena tai konjugaattina tai fuusioituna P5 proteiinin kanssa tai P5-proteiinista peräisin olevana 30 peptidinä tai proteiinina. Konjugaatti muodostetaan standardeilla proteiinimateriaalin kytkemistekniikoilla. P5- proteiinia tai mitä tahansa siitä peräisin olevaa peptidiä tai proteiinia voidaan käyttää yhdessä muiden organismien (esim. kapseloidut tai ei-kapseloidut, bakteerit, viruk- 35 set, sienet ja parasiitit) antigeenien kanssa. Esimerkiksi

11 10 P5-proteiini on käyttökelpoinen yhdessä muiden sellaisten mikro-organismien antigeenien kanssa, jotka ovat osallisina välikorvantulehdukseen ja muihin tauteihin. Nämä sisältävät Streptococcus pneumonia:n, Streptococcus PYogenes:h, 5 ryhmä A, Staphylococcus aureus:n, RS-viruksen (respiratory syncytial virus) ja Branhemella catarrhalis:n. Formuloitaessa rokotekoostumuksia peptidin tai proteiinin kanssa, yksin tai erilaisissa kuvatuissa kombinaatioissa, immunogeeni säädetään sopivaan pitoisuuteen ja 10 formuloidaan minkä tahansa sopivan rokoteadjuvantin kanssa. Immunogeeni voidaan myös sisällyttää liposomeihin tai konjugoida polysakkarideihin ja/tai muihin polymeereihin käytettäväksi rokoteformulaatiossa. Esillä olevan keksinnön rokotteita annetaan ihmi- 15 sille tai eläimille useilla tavoin. Näihin kuuluvat ihonsisäinen, lihaksensisäinen, vatsaontelonsisäinen, suonensisäinen, ihonalainen, suun kautta ja nenän kautta tapahtuva antotapa. Tämän keksinnön peptidiä ja proteiineja annetaan 20 myös elävänä rokotteena. Tätä varten valmistetaan rekombinanttimikro-organismeja, jotka ekspressoivat peptidejä tai proteiineja. Rokotteen saaja rokotetaan rekombinantilla mikro-organismilla, joka lisääntyy vastaanottajassa, ekspressoi P5-proteiinipeptidiä tai proteiinia ja herättää 25 Haemophilus influenzae:n immuunivasteen. Edullisia eläviä rokotevektoreita ovat rokkovirukset, kuten vaccinia (Paoletti ja Panicali, US-patenttijulkaisu nro ) ja heikennetytsalmonella-kannat (Stocker, US-patenttijulkaisu nro ). 30 Elävät rokotteet ovat erityisen edullisia, koska ne saavat aikaan pitkäaikaisen ärsykkeen, joka voi antaa oleellisesti pitkään kestävän immuniteetin. Kun immuunivasta antaa suojan myöhempää Haemophilus influenzae -infektiota vastaan, elävää rokotetta itsessään voidaan käyt- 35 tää estävänä rokotteena Haemophilus influenzae :a vastaan.

12 11 Multivalentit elävät rokotteet valmistetaan yhdestä tai muutamasta rekombinantista mikro-organismista, jotka ekspressoivat eri Haemophilus influenzae:n epitooppeja (esim. muita ulkomembraaniproteiineja, kuten PAL:a ja 5 PCP:tä tai niiden epitooppeja). Lisäksi muiden patogeenisten organismien epitooppeja voidaan sisällyttää rokotteeseen. Esimerkiksi vaccinia-virusta voidaan muokata siten, että se sisältää koodaavia sekvenssejä muille epitoopeille Haemophilus influenzae:n epitooppien lisäksi. Tällaista 10 rekombinanttia virusta voidaan itsessään käyttää immunogeenina multivalentissa rokotteessa. Vaihtoehtoisesti vaccinia:n ja muiden virusten seos, joista kukin ekspressoi eri geeniä, joka koodaa Haemophilus influenzae:n ulkomembraaniproteiinien eri epitooppeja ja/tai muiden tautia 15 aiheuttavien organismien epitooppeja, voidaan formuloida multivalenttina rokotteena. Toinen esillä olevan keksinnön rokote on inaktivoitu virusrokote. Inaktivoidut rokotteet ovat "kuolleita" siinä merkityksessä, että niiden infektiviteetti on tuhot- 20 tu, yleensä kemiallisella käsittelyllä (esim. formaldehydikäsittelyllä). Edullisesti viruksen infektiivisyys tuhotaan vaikuttamatta proteiineihin, jotka sisältävät viruksen immunogeenisyyden. Inaktivoitujen rokotteiden valmistamiseksi kasvatetaan suuria määriä rekombinanttia virus- 25 ta, joka ekspressoi haluttuja epitooppeja, viljelmässä, jotta saadaan tarpeellinen määrä tarkoituksenmukaisia antigeeneja. Seos inaktivoituja viruksia, jotka ekspressoivat eri epitooppeja, on hyödyllinen "multivalenttien" rokotteiden muodostamiseksi. Tietyissä tapauksissa nämä 30 "multivalentit" inaktivoidut rokotteet ovat edullisia elävään rokoteformulaatioon verrattuina siksi, että mahdollisesti muodostuu vaikeuksia elävien virusten keskinäisestä vuorovaikutuksesta yhdessä annettuna. Kummassakin tapauksessa inaktivoitu virus tai virusseos formuloidaan sopi- 35 vaan adjuvanttiin immunologisen vasteen lisäämiseksi anti-

13 12 geeneja kohtaan. Sopivia adjuvantteja ovat: pinta-aktiiviset aineet, esim. heksadekyyliamiini, oktadekyyliaminohappoesterit, oktadekyyliamiini, lysolesitiini, dimetyylidioktadekyyliammoniumhromidi, N,N-dioktadekyyli-N'-W-bis 5 (2-hydroksietyylipropaanidiamiini), metoksiheksadekyyliglyseroli ja pluronipolyolit; polyamiinit, esim. pyraani, dekstraanisulfaatti, poly-ic, carbopol; peptidit, esim. muramyylidipeptidi, dimetyyliglysiini, tuftsiini; öljyemulsiot ja mineraaligeelit, esim. alumiinihydroksidi, 10 alumiinifosfaatti jne. Esillä olevan keksinnön peptidit ja proteiinit ovat myös käyttökelpoisia tuottamaan polyklonaalisia vastaaineita käytettäväksi passiivisessa immunoterapiassa Haemophilus influenzae:a vastaan. Ihmisen immunoglobuliini on 15 edullinen, koska heterologinen immunoglobuliini saattaa nostattaa vahingollisen immuunivasteen sille vieraille immunogeenisille komponenteille. Polyklonaalista antiseerumia saadaan yksilöiltä, jotka on immunisoitu kuvetuissa muodoissa olevilla peptideillä tai proteiineilla. Sen jäl- 20 keen immunoglobuliinifraktio rikastetaan. Esimerkiksi immunoglobuliinit, jotka ovat spesifisia P5-protelinin epitoopeille, rikastetaan immunoaffiniteettitekniikoilla käyttämällä tämän keksinnön peptidejä tai proteiineja. Vasta-aine adsorboidaan spesifisesti antiseerumista immu- 25 noadsorbenttiin, joka sisältää P5-proteiinin epitooppeja, ja eluoidaan sen jälkeen immunoadsorbentista rikastettuna immunoglobuliinifraktiona. Lisäksi nukleiinihappoja, joilla on P5-protelinia koodaavan geenin nukleotidisekvenssi tai mikä tahansa nuk- 30 leotidisekvenssi, joka hybridisoituu sen kanssa, voidaan käyttää koettimina nukleiinihappohybridisaatiomäärityksissä Haemophilus influenzae:n osoittamiseksi eri kudoksista tai potilaiden kehon nesteistä. Koettimia voidaan käyttää minkä tahansa tyyppisessä hybridisaatiomäärityksessä, mm. 35 Southern blot:eissa (Southern, J. Mol. Biol. 98 (1975)

14 13 506), Northern blot:eissa (Thomas et al., Proc. Nati- Acad. Sci. USA 77 (1989) ), pesäkebloteissa (Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) ) jne. Hybridisaatio-olosuhteiden ankaruutta voi- 5 daan vaihdella määrityksen vaatimuksien mukaan. Keksintöä valaistaan edelleen seuraavin esimerkein. Esimerkki 1 P5:n puhdistus P5:n proteiiniuutteita saadaan sekä NTHi- että Hib- 10 kannoista ulkomembraanien differentiaalisella detergenttiuutolla. Zwittergent-oktyyliglukosidi ja Zwittergent ja 0,5 M NaCl -uuttojen jälkeen P5-proteiini liuotetaan 1-%:iseen sarkosyyliin 50 mm Tris-HC1:ssä, PH 8, 5 mm Na2EDTA:ssa. Uutteet säädetään 1-%:isiksi Zwitter- 15 genttm 3-14:n suhteen samassa puskurissa ja dialysoidaan kymmenkertaista ylimäärää vastaan 1-%:ista Zwittergent" 3-14, 50 mm Tris-HC1:ssä, ph 8, 5 mm Na2EDTA:ssa (3x) yli 24 tuntia. Dialysoitu uute ajetaan sen jälkeen peräkkäin kytkettyjen anioninvaihto (DEAE) - ja kationinvaihto (S)- 20 Pylvään läpi- Pylväät erotellaan toisistaan ja S-pylväs eluoidaan nousevalla suolagradientilla samaan Zwittergent:ä sisältävään puskuriin. Puhdistettu P5-proteiini eiuoituu SDS-PAGE-analyysissä yhtenä huippuna (kuvio 1). Esimerkki 2 25 Proteaasidigestio, peptidin eristys ja proteiinin sekvenointi Puhdistettua NTHi P5:a ja Hib P5:a käytetään suoraan N-terminaalisen aminohapposekvenssin määrittämiseksi (kuvio 5). NTHi-proteiinin kokonaissekvenssi määritetään 30 osittain päällekkäisten peptidien avulla, jotka on saatu digeroimalla useilla Proteaaseilla mm. endopeptidaaseilla Lys-C, Arg-C, Glu-C, papaiini, trypsiini ja kymotrypsiini. Syanogenbromidia käytetään myös proteiinin pilkkomiseen metionilnitähteistä suurten fragmenttien muodostamiseksi. 35 Peptidit eristetään käyttäen mikrohuokoista, korkean suo-

15 14 rituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC), ja sekvenssit määritetään proteiinisekvenaattorilla. Peptidien asettelussa käytetään hyväksi osittain Päällekkäisiä PePtidejä ja homologiaa E. coli:n OmpA-proteiiniin nähden (kuvio 2). 5 Esimerkki 3 Kökosolun ELISA-määritys Kokonaiset formaliinilla kiinnitetyt Haemophilus influenzae -solut useista eri kannoista valmistetaan midlog-faasisoluista r jotka ovat kasvaneet, kunnes 0D490-arvo 10 on 1,0, BHI-XV-alustassa. Solut pestään kahdesti fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS) (7 mm NaHPO4-7H20, 2 mm KH2PO4, 2 mm CK1, 137 mm NaCl, ph 7,4), suspendoidaan sen jälkeen PBS:ään, joka on 0,3-%:inen formaliinin suhteen ja inkuboidaan huoneenläm- 15 pötilassa 1-2 tuntia. Formaliini poistetaan pesemällä solut PBS:ssä ja solut suspendoidaan uudelleen PBS:ään lopulliseen pitoisuuteen 0D620 = 0,2. Sen jälkeen lisätään mikrotiitterilevyn kuoppiin 75 p1 soluja ja kuivataan yön yli 37 'C:ssa. Levyjä blokataan PBS 0,1-%:isella Tween :11ä yhden tunnin ajan ja pestään mikrolevypesurilla. Kuoppiin lisätään 100 pl antiseerumia, joka on laimennettu PBS:ään, joka sisältää 0,15 mm CaCl2 a, 0,5 mm MgC12:a, 1 % gelatiinia ja 0,3 % Tween-20 a (PCM-GT), ja levyjä inkuboidaan 37 'C:ssa kaksi tuntia. Pesun jälkeen sitoutuneet 25 vasta-aineet osoitettiin vuohen anti-hiiri-(igga-igm):11ä, joka oli konjugoitu alkaaliseen fosfataaslin (TAGO) ja laimennettu PBS:ään, 0,05-%:iseen Tween-20:een, 0,1-%:iseen gelatiiniin, yhdessä tunnissa 37 'C:ssa. Solut pestään jälleen ja levyjä kehitettiin p-nitrofennrlifos 30 faatti (SIGMA) -liuoksessa, 1 mg/ml, dietanoliamiinissa 30 minuuttia. Reaktio sammutetaan 3 N NaOH:n lisäyksellä. Levyt luetaan lukijalla 0D450:ssä, vertailu 0D620:ssa. Kokosolujen ELISA-tulokset kanin ja hiiren anti-p5-seerumille nähdään kuvioissa 3 ja 4, tässä jäxjestyksessä.

16 15 Esimerkki 4 Bakterisidisyysmääritys Soluja useista eri Haemophilus influenzae -kannoista kasvatetaan yön yli BHI-XV-alustassa. Seuraavana päivä- 5 nä valmistetaan tuoreet viljelmät laimentamalla 1:10 yli yön kasvatusta, ja kasvatetaan kunnes 0%0 = 1,0. Solun kasvun aikana komplementtilähde, fetaalivasikan seerumia preadsorboidaan P solujen kanssa tunnin ajan. Solut pelletoidaan sen jälkeen komplementista ja preadsorboitu 10 kornplementti steriilisuodatetaan 0,2 pm:n suodattimen läpi ja säilytetään jäillä ennen käyttöä. Kaikki tällä tavoin seulottu antiseerumi lämpöinaktivoidaan 56 cc:ssa 15 minuuttia komplementtiaktiivisuuden poistamiseksi, ja laimennetaan 1:5 PCM:ään, jonka jälkeen laimennetaan edelleen 15 kaksinkertaiseen tilavuuteen, mikä tehdään 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille. Bakteerisolut, jotka ovat kasvaneet 0D410:aan 1,0, laimennetaan 1: PCM:ään, joka sisältää kompiementtilähteen 1:5 laimennettuna. 15 p1 tätä liuosta lisätään antiseerumin laimennossarjaan ja levyjen annet- 20 tiin inkuboltua 45 minuuttia 37 C:ssa. Tämän jälkeen 10 i1 kustakin reaktiosta pannaan levylle BHI-XV:ssä. Yön yli tapahtuvan inkuboinnin jälkeen 37 C:ssa pesäkkeet lasketaan bakterisidisten tiitterien määrittämiseksi (käänteisarvo korkeimmasta antiseerumilaimennoksesta, joka 25 kykenee tappamaan yli 50 bakteereista preimmuuniseerumikontrolleihin verrattuna). Bakterisidisyystulokset P5:n suhteen esitetään kuviossa 6.

17 16 SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: Zlotnick Dr., Gary W. (ii) TITLE OF INVENTION: Purified Nontypable Haemophilus influenzae P5 Protein as a Vaccine for Nontypable Haemophilun Influenzae Strain (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 1 (iv) CORRESPONDENCE ADDRESS: (A) ADDRESSEE: Amerinan Cyanamid Company (5) STREET: One Cyanamid Plaza (C) CITY: Wayne (D) STATE New Jersey (5) COUNTRY: US (F) Z/P: (v) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (3) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (Dl SOFTWARE: Patentin Releaae #1.0, Version #1.25 (Id) CURRENT APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: US (5) FILING DATE: 07-MAR-1994 (C) CLASSIFICATION: (viii) ATTORNEY/AGENT INFORMATION: (A) NAME: RaZrington, Jamea J (C) REFERENCE/DOCKET NUMBER: 32,144 (ix) TELECOMMUNICATION INFORMATION: (A) TELEPHONE: 201/ (B) TELEFAX: 201/ (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 338 amino acids (3) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: unknown (D) TOPOLOGY: unknown (ii) MOLECJLE TYPE: protein (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1: Ala Pro Gin Giu Asn Thr Phe Tyr Ala Gly Vai Lye Ala Gly Gin Gly Ser Phe Eia Aep Gly /1e Aan Asn Asn Gly Ala Tie Lys Giu Asp Ser

18 17 Ile Asp Leu Thr Len Giy Tyr Gly Tyr Arg Arg Asn Thr Phe. Thr Tyr Giy Val Phe Gly Gly Tyr Gln lie Len Aan Gin Aep Asn Phe.Gly Leu Ala Ala Glu Len Gly Tyr Aep Aan Phe Gly Arg Vai Lya Phe Arg Ala Glu Gly Lya Thr Lys Ala Lys His Thr Asu His Giy Ala His Len Ser Leu Lys Gly Ser Tyr Gin Vai Leu Asp Gly Len Asp Val Tyr Gly Lys Ala Gly Vai Ala Len Vai. Arg Ser Asp Tyr Lys Phe Tyr 125 Gin Ala Pro Asn Ser Thr Arg Asp Xaa Lys Lys Giy Thr His Thr Ala Arg Ala Ser Gly Len Phe Ala Vai Gly Ala Gin Tyr Ala Vai Leu Pro Gin Leu Ala Val Arg Leu Glu Tyr Glh Gin Len Thr Arg Vai Gly Lys Tyr Arg Pro Gin Asp Lys Aan Ala Pro Ser Ile. Asn Pro Asn Thr Ala Ile His Tyr Asn Pro Xaa Ile Gly Ser Ile Asn Ala Gly Ile Ser Tyr Arg Phe Giy Gin Gly Ala Ala Pro Vai Lys Thr Phe Ser Leu Asn Leu Asp Val Thr Phe Ala Phe Gly Lys Ala Aan Len Lye Pro Gin Ala Gin Ala Thr Len Asp Ser lie Tyr Gly Glu Met Ser Gin Vai Lys Ser Ala Lys vai Ala Vai Ala Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Asp Ala Phe Asn Vai Lys Leu Ser Gin Glu Arg Ala Asp Ser Val Ala Asn Tyr Phe Vai Ala Lys Gly Vai Ala Ala Asp Ala Ile Ser Ala Thr Gly Tyr Gly Lys Ala Aan 29p Pro Vai Thr Giy Ala. Thr Xaa Aap Gin Vai Trp Gly Arg Trp Ala Len Ile Ala Thr Len Ala Pro Aep Arg Arg Vai Gin lie Ala Vai Aan Gly Thr Lys

19 18 Patenttivaatimukset 1. Natiivi Haemophilus influenzae- bakteerikannan P5-ulkomembraaniproteiini, joka on saatavissa puhdistusme- 5 joka käsittää Haemophilus influenzae-solujen ei-denaturoivan differentiaalidetergenttiuuton. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen. proteiini, jossa mainittu. puhdistusmenetelmä käsittää mainittujen solujen ulkomembraanin yhdistepreparaatin uuttamisen N-lauroyyli- 10 sarkösiinin natriumsuolan vesiliuoksella, joka uutto käsittää vaiheet, joissa: (a) uutetaan liukenematonta jäännöstä, joka käsittää P5-proteiinia sulfobetaiinin vesiliuoksella; (b) liuotetaan liukenematon jäännös vaiheesta (a) 15 N-lauroyylisarkosinaatilla: (c) dialysoidaan vaiheen (b) jäännös sulfobetaiinilla (d) viedään dialysoltu uute anioninvaihtopylvään ja kationinvaihtopylvään läpi; 20 eluoidaan P5-proteiini sopivasta katiöninvaihtopylväästä, ja (f) otetaan talteen eleellisest..i puhdas P5-proteiini kationinvaintopylväästä eluoinnin jälkeen. 3., Patenttivaatimuksen 1 mukainen P5-proteiini, 25 jolla on sekvenssin nro 1 aminohapposekvenssi, tai sen mikä tahansa muunnettu sekvenssi, jossa aminohappotähteitä on lisätty, sisällytetty, korvattu tai poistettu vahingoittamatta proteiinin bakterisidisiä tai opsonisia ominaisuuksia tai molempia, jolloin proteiini synnyttää bak- 30 vasta-aineita Haemophilus influenzae-bakteeria Vastaan isännässä. 4. Menetelmä P5-proteiinin eristämiseksi ja puhdistamiseksi Haemophilus influenzae-bakteerin ulkomembraanista ulkomembraanin yhdistepreparaatin uuttamisen jälkeen 3.5 N-lauroyylisarkosiinin natriumsuolan vesiliuoksella, jolloin menetelmä käsittää seuraavat vaiheet:

20 19 (a) uutetaan liukenematonta jäännöstä, joka. käsittää P5-proteiinia sulfobetaiinin vesiliuoksella; (b) liuotetaan liukenematon jäännös vaiheesta N-lauroyylisarkosinaatilla: 5 (c) dialysoidaan vaiheen (b) jäännös iinilla (d) viedään dialys tu uute anioninvaihtopylvään ja kationinvaihtopylvään läpi; (e) eluoidaan P5-proteiini sopivasta kationinvaih- 10 topylväästä, ja (f) otetaan talteen. oleellisesti puhdas P5-proteiini kationinvaihtopylväästä eluoinnin jälkeen. 5. Rokotekoostumus, joka sisältää immunogeenisen määrän jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaista laein- 15 sesti puhdasta natiivia. Haemophilus influenzae-bakteerin P5-protelinia farmaseuttisesti hyväksyttävässä vehikkelissä ja valinnaisessa adjuvantissa. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen rokotekoostumus, joka lisäksi. sisältää vähintään yhden lisaantigeenin tai 20 yhden tai useamman organismin, 7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen rokotekoostumus, jossa organismi on bakteeri, virus, parasiitti, tai sieni. 8. Rokotekoostumus, joka käsittää antigeenikonjugaatin, joka koostuu oleellisesti jonkin patenttivaatimuk 25 sen 1-3 mukaisesta puhtaasta natiivista P5-proteiinista konjugoituna organismin antigeeniin tai sen epitooppiin tai epitooppeihin farmaseuttisesti hyväksyttävässä vehikkelissä ja valinnaisessa adjuvantissa. 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen rokotekoostumus, 30 jossa organismi on Haemophilus influenzae. 10. Immunogeeninen määrä jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaista Haemophilus influenzae-bakteerin oleellisesti puhdasta natiivia P5-proteiinia käytettäväksi immunisointiin Haemophilus influenzae-bakteeria vastaan Immunogeenisen määrän jonkin patenttivaatimuksen mukaista. Haemophilus influenzae-bakteerin natiivia

21 20 P5-proteiinia käyttö lääkkeen valmistamiseksi immunisointia varten Haemophilus influenzae-bakteeria vastaan. 12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen käyttö, jossa Droteiinilla on oleellisesti. sekvenssin nro 1 sekvenssi 5 tai sen mikä tahansa muunnettu. sekvenssi, jossa aminohappotähteitä on lisätty, sisällytetty, korvattu tai poistettu vahingoittamatta oleellisesti proteiinin bakterisidisiä tai opsonisia ominaisuuksia tai molempia. 13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen käyttö, 1 0 jossa proteiini annetaan yhdessä ainakin yhden muun Hae- mophilus influenzae-bakteerin antigeenih kanssa 11. Immunegeeninen määrä Haemophilus influenzaebakteerin oleellisesti puhdasta natiivia P5-proteiinia, joka on peräisin välikorvantulehduksen, sivuontelötuleh- 15 duksen tai kroonisen ahtauttavan keuhkosairauden etiologisesta tekijästä, käytettäväksi ehkäisemään tai hoitamaan välikorvantulehdusta, sivuontelotulehdusta tai kroonista a htauttavaa keuhkosairautta tai vähentämään altistumista niihin Immunogeenisen määrän Haemophilus influenzaebakteerin oleellisesti puhdasta natiivia P5-proteiinia, joka on peräisin välikorvantulehduksen, sivuontelotulehduksen tai kroonisen. ahtauttavan keuhkosairauden etiologisesta tekijästä, käyttö lääkkeen valmistukseen välikorvan- 25 tulehduksen, sivuontelotulehduksen tai kroonisen ahtauttavan keuhkosairauden ehkäisemiseksi tai hoitamiseksi tai altistumisen vähentämiseksi näihin tauteihin.

22 21 Patentkrav 1. Nativt P5 yttre membranprotein av bakteriestammen Haemophilus influenzae, vilket kan erhållas genom ett rengöringsförfarande, som omfattar icke-denaturerande differentialdetergentextraktion av Haemophilus influenzae celler. 2. Protein enligt patentkrav 1, där nämnda rengöringsförfarande omfattar extraktion av ett föreningsprepa- 10 rat hos nämnda cellers yttre membran med en vattenlösning av N-lauroylsarkos natriumsalt, vilken extraktion omfattar steg där: (a) ett olösligt residuum, vilket omfatter P5 protein, extraheras med en vattenlösning av sulfobetain; 15 (b) dec olösliga residuet från steg (a) upplöses med N-lauroylsarkosinat; (c) residuet från steg (b) dialyseras med sulfobetain; (d) det dialyserade extraktet passeras genom en anjonbyteskolonn och en katjonbyteskolonn; (e P5 protein elueras från en lämplig katjonbyteskolonn, och (f) väsentligen rent P5 protein återvinns från katjonbyteskolonnen efter elueringen P5 protein enligt patentkrav 1, vilket har sekvens nr 1 aminosyrasekvens eller vilken som helst modiflerad sekvens därav, där aminosyraresiduer har tillsatts, inlagts, ersatts eller avlägsnats otan skada tili proteinets baktericida eller opsoniska egenskaper eller bäda, 30 varvid proteinet framkallar baktericida antikroppar mot Haemophilus influenzae bakterie i en värd. 4. Förfarande för isolering och rengöring av P5 nrotein från Haemophilus influenzae bakteriens yttre membran efter extrahering av den yttre membranens förenings- 35 preparat med en vattenlösning av N-lauroylsarkös atriumsalt, varvid förfarandet omfattar följande steg:

23 22 (a) ett oiösligt residuum, vilket omfatter P5 protein, extraheras, med en vattenlösning av sulfebetain; (b) det olösliga residuet från steg (a) upplöses med N-lauroylsarkesinat; 5 (c) residuet från steg (b) dialyseras med sulfobetain7 (d) det dialyserade extraktet passeras genom en anjonbyteskolonn och en katjonbyteskolenn; (e) P5 protein elueras från en lämplig katjonby- 10 teskolonn, och (.f) väsentligen rent P5 protein återvinns från katjonbyteskolonnen. efter elueringen. 5. Vaceinsammansättning, sem innehåller en immunogenisk rnängd av ett väsentligen rent nativt P5 protein ev 15 Haemophilus influenzae bakterie enligt något av patentkraven 1-3 i en farmaceutiskt godtagbar vehikel och ± ett valfritt adjuvans. 6. Vaccinsammansättning enligt patentkrav 5, Vilken ytterligare omfattar åtminstone en tilläggsantigen ei- 20 ler en eller flera organismer. 7. Vaccinsammansättning enligt patentkrav 6, där organismen är en bakterie, ett virus, en parasit eller en svamp. 8. Vaccinsammansättning, vilken omfattar en anti- 25 genkonjugat, som består väsentligen av ett rent nativt P5 protein enligt något av patentkraven 1-3, konjugerat organismens antigen. eller i dess epitop eller i en för epitoper farmaceutiskt godtagbar vehikel eller i ett va1- fritt adjuvans Vaccinsammansättning enligt patentkrav 8, där organismen är Haernophiius influenzae. 10. Immunologisk mängd av ett väsentligen rent nativt P5 protein av Haemephilus influenzae bakterie enligt något av patentkraven 1-3 för användning i immunisering 35 met Haemephilus influenzae bakterie.

24 Immunologisk mängd av ett rent nativt P5 protein av Haemophilus influenzae bakterie enligt något av patentkraven 1-3 för användning 1 immunisering mot Haemophilus influenzae bakterie Användning enligt patentkrav 11, där proteinet har väsentligen sekvens nr 1 sekvens eller vilken som helst modifierad sekvens därav, där aminosyraresiduer har tiiisatts, inlagts, ersatts eller avlägsnats utan att skada proteinets baktericida eller opsoniska egenskaper eller 10 bäda, 13. Användning enligt patentkrav 11 eller 12, där proteinet administreras tillsammans med åtminstone en andra antigen_ av Haemophilus influenzae bakterie. 14. Immunologisk mängd av ett väsentligen rent na- 15 tiet P5 protein av Haemophilus influenzae bakterie, som härstammar från en etiologisk faktor av otitis media, sinuit eller kronisk obstruktiv lungsjukdom, för användning i förebyggande av, behandling av eller minskning av mottaglighet för otitis media, sinuit eller kronisk obstruk- 20 tiv lungsjukdom. 15. Immunologisk mängd av ett väsentligen rent nativt P5 protein av Haemophilus influenzae bakterie, som härstammar från en etiologisk faktor av otitis media, sinuit eller kronisk obstruktiv lungsjukdom, för användning 25 i framstälining av ett läkemedel för förebyggande av, behandling av eller minskning av mottaglighet för otitis media, sinuit eller kronisk obstruktiv lungsjukdom.

25 Fig. 1 Coomassie-värjätty SDS-page -geeli puhdistetusta ei-tyypitettävissä olevasta ja tyypin B P5-proteiineista Standardit tnk. nfiffp»rirk 45i" ') ".: 43,700 28,900 18,400 Sarakkeet 1. Ei-tyypitettävissä oleva P5 (P860295) 2. Tyyppi B P5 (Eagan) P5 NTHI-kannasta P (sarake nro 1) ja HIB Eagan -kannasta (sarake nro 2) analysoitiin (15-%:issa SDS-page -geeleissä. Kaksoisjuova s.arakkeessa nro 1 edustaa P5:n lämpömodifioitua ja ei-lämpömodifioi tuja muotoja.

26 Fig. 2 Atignment Workspace ei Unthied, using Clus-tal msthod with PAM250 resiciue weight table. AP."* z-51-;`z, V>.~,ISQYHDTGF I` IMDEVICI=01 Wiral PTHENQtGAG APGGYOVN?YVGF----EMqY r r b 30 4b NTHi P5 (P860 APQaTTFYAGVKAGQGSPIID-:GINTNNGAIKEDSDLTLGYGYRRNTFTYGVF=QILNQDNPGLAAELGY 69 Eco13, OMP A s API~TGAT~S~G-F~GFTHENQLGAG AIGGYWNPYVGF---EMGY 55 Sd OMP A AP vls~gfidnng=iqlgag AFGGYWNPYVGF----EMGY 55 ELEMMISMEM DWLGRKPYKG-SVENGAYKAQGVQLTAKE.GYPITDD -XXX1=XX:50~ 8b 9b NTI-Ii. P5 (P860 DNIFGRVICFRAEGIVERAWHTNHWrLSLKGSTEVIMLDVYGNAGVAINRSDYIWYEA.PNSTRDKKGTHTA 139 Ecoli OMP A s DrAWRMPYKG-S=A?1(AQGVQ1/17=PITDDLD --SHVY - GICNKIDT 117 Sd OMP A aqlgrmpykg-svengamqgvqltaelgypitd=vytrlggmvwradtk- 122 GVSPVPAGGVEYAITPETATRLEYQWTNNIG LAHTI= PDNGXLSI,GVSYRF CI, 1 0 / 0 1'0 1å i10 NTHi P5 (P860 ItASGLEAVG.AEYAVT,PELAVRLEYQQ1.1=1=QDKnAPSINSPHTAII-ZYNPXIGSWAGISYREGQG 209 Ecoli OMP A s GVSPVP'AGG=ITPZIATRLEY~IG DAHTIGTR. PIINGMT...g=TAPGQG 173 Sd 01,5, A GVSPVFAC-GVEWAITPEIATRLEYQ~G DAHTIGTR PIZIGLISLGVSYBEGQG 178 EAAPVVAPAPAPAPEVQ17=LKSDVLF~ATLI(PEGQAALDQUISQL=PK Å b0 2l0 2å0 NTHi P5 (P860 -AAPV ANLI(PQAQT-LDSIYGEMSQV -RSAKV ADRX 242 Ecoli OMP A s EAAWVAPA.PAPAPEVQTKEIFTLICSDVLFHEMAT=EGQAALDQLYSQLSNLOPRDGSVVVLGYTDRI 243 Sd OM? A EAAPVVAPAPAPAPEVQTICHFTLKSE=MCATLICPEG":30LYSQLSNLDPKDGSVVV=DRI 248 TDRI GSDAYNI SEFLRA.GSVVDYI,I SKGIPADKISARGMGESNPVT=CDNVKQRAALIDCLAPDRR J { NTHi P5 ( P860 GSDARNIVICLSQERADSVAItih 312 Ecoli OMP A s GSDAYNQGLSMRAQSWDYLI SRGIPADKIS~G~VTGHTCURVKQRAALIECLAPDRR 308 Sd OMP A GSEVLYNQGLSERRAQSVVIDYLI SKGIPADICISARGWESNPVTGHTCDNVXQRAALIDCLAPDRR 313 VETEVKGIKDVVTQPQA 3å0 NTHi P5 (P860 VEIAVNGTX 321 Ecoli QMP A s VEIEVKGIKINVTQPQA 325 Sd OMP A VEIEVKGIEDIVVTQPQA 330

27 Fig. 3 Koko solun ELISA -päätepistetiitterit, jotka on saatu kanin antiseerumista, joka kohdistuu NTHI P5:tä vastaan P P P NTH1-kanna t N83016-E 0 2x104 4x104 6x104 8x104 1x105 Päätepistetiitteri Päätepistetiitteri = käänteisarvo korkeimmasta laimennoksesta, joka antaa optiseksi tiheydeksi 0,1 405 nm:ssä Kanit rokotettiin (tutkimus nro T ) viikoilla 0, 4, 8 15,ugieläin NTHI P5:llä P DMPL:stä ihonalaisella injektiolla. Tässä annetut päätepistetiitterit ovat viikon 10 veristä. Kaikki 0-seerumi päätepistetiitterit olivat alle Kanin vasta-aineet osoitettiin TAGO:11a vuohen anti-kani IgG + IgM:11ä, joka oli konjugoitu alkaaliseen fosfataasiin

28 Fig. 4 Koko solun ELISA-päätepistetiitterit, jotka on kehitetty hiiren antiseerumista, joka kohdistuu NTHI P5 ta vastaan P860 E95 P NTHI-kannat S2 P P X105 4X105 6X105 8X105 1X106 Päätepistetiitteri Päätepistetiitteri = käänteisarvo korkeimmasta laimennoksesta, joka antaa optiseksi tiheydekst 0,1 405 nm:ssä. Hiiret rokotettiin (tutkimus nro T ) viikoilla 0, 4, 8, 12 10,ugieläin NTHI P5:1Iä P DMPL:stä ihonalaisella injektiolla, Tässä annetut Päätepistetiitteritovatviikon 10 veristä. Kaikki 0-seerumi päätepistetiitterit olivat alle Hiiren vasta-aineet osoitettiin TAGO:11a, vuohen anti-hiiri- IgG + IgM:11ä, joka oli konjugoitu alkaaliseen fosfataasiin

29 Fig. 5 P860295:stä peräisin olevan hiiren P5-antiseerumin bakterisidinen aktiivisuus useita eri ei-tyypitettävissä olevia haemophilus-kantoja vastaan kanta BC-päätepistetiitteri P P P Positiivinen kontrolli > 640 (P860295:stä peräisin olevat kokonaismempraanit) BC endpoint = käänteisarvo korkeimmasta laimennoksesta, joka saa aikaan > :n tapon Hiiret rokatettiin (tutkimus nro T ) viikoilla 0, 4, 8, ug/eläin NTHI P5:11ä P I- 3DMPL:stä ihonalaisella injektiolla. Tässä annetut BC-päätepistatiitterit ovat viikon 10 veristä. 0-seerumit seulottiin, eivätkä ne osoittaneet bakterisidista aktiivisuutta.