E. coli PCR-menetelmä putkirikkotilanteiden varalle Ajankohtaista laboratoriorintamalla

Transkriptio

1 E. coli PCR-menetelmä putkirikkotilanteiden varalle Ajankohtaista laboratoriorintamalla Erikoistutkija Tarja Pitkänen

2 Pikatesti elinkykyisten E. coli -bakteerien tunnistamiseen Suomen talousvedestä PCR-tekniikalla HANKE ( ) Tutkimusryhmä THL:ssä Tarja Pitkänen Anna-Maria Hokajärvi Pia Räsänen Annastiina Rytkönen Rahoitus Vesihuoltolaitosten kehittämisrahasto 11 vesihuoltolaitosta eri puolilta Suomea Yhteistyössä Sosiaali- ja terveysministeriö Valvira Yhteistyölaboratoriot Eurofins Kokemäenjoen vesiensuojeluyhdistys Lounais-Suomen vesiensuojeluyhdistys MetropoliLab Oy Savo-Karjalan Ympäristötutkimus Oy ScanLab Tampereen yliopisto Tarja Pitkänen

3 Mittaustulos: E. coli -bakteeria vedessä Mitä se kertoo: Vesi on saastunut ihmisten tai eläinten ulosteilla Onko suolistoperäisiä bakteereja paljon vai vähän Vedessä voi olla suolistoperäisiä taudinaiheuttajamikrobeja Vettä ei pidä juoda Mitä se ei kerro: Mitä taudinaiheuttajia vedessä on Milloin tilanne alkoi ja milloin se korjaantuu Mistä saastuminen on peräisin Tarja Pitkänen

4 Valvontatutkimusmenetelmät Perustuvat pesäkeviljelyyn: Kalvosuodatus tai MPN-menetelmä SFS-EN ISO (Chromocult): h SFS 3016 (Les ENDO): 21 h + varmistukset 1-2 pv SFS-EN ISO (Colilert-18): 18 h Kuva: Pentti Sormunen Tarja Pitkänen

5 Molekulaarista vesimikrobiologiaa Kohteena bakteerien ribosomaalinen RNA Tunnistaa aktiiviset ja lepotilaiset solut Ei tunnista kuolleita soluja (vrt. DNA-pohjainen geenianalyysi) Kohdesolujen elävyys/säilyvyys RNA-lähestymistapa: rrna kopioiden määrä riippuu solun aktiivisuustasosta Kapoor, Pitkänen et al. 2015, AEM, 80(1): pp Tarja Pitkänen

6 PCR-tulos (alternative) viljelytulos (reference) Tarja Pitkänen

7 Hankkeen tavoitteet Kehittää ja tuoda markkinoille juomavesien mikrobiologisen turvallisuuden testaamiseen soveltuva nopea mikrobien havaitsemismenetelmä Luoda edellytykset vesimikrobiologian alalla käytettävien molekyylibiologisten menetelmien entistä tehokkaammalle jalkauttamiselle tutkimuslaitoksista paikallisiin testauslaboratorioihin Lopputuloksena: pikamittausmenetelmä, jonka avulla vesilaitokset voivat palata putkirikkokorjausten jälkeen normaalitilaan mahdollisimman nopeasti vesiturvallisuutta vaarantamatta Tarja Pitkänen

8 Raision ja Naantalin alueelle vettä toimittava runkolinja on rikki (Yle ) Putkirikkotilanteiden näytteenoton haasteet ja mahdollisuudet Tarja Pitkänen

9 Näytteenotto Kuka huolehtii ja mistä otetaan? Näytteet pulloon Perinteinen menetelmä Saastumisen/puhdistumisen todentaminen putkirikkotilanteessa Näytetilavuus 100 ml 1000 ml Näytteen tallennus (kalvosuodatus) ja analysointi laboratoriossa mahdollisimman pian Suuren tilavuuden näytteenotto (ultrasuodatus) Verkoston puhtauden todentaminen Näytetilavuus esim. 100 l Näytepatruunan jatkokäsittely laboratoriossa Tarja Pitkänen

10 Näytteenottovälineistö DEUF-patruuna Steriili adapteri ja tulppa Vesimittari tilavuuden mittaamiseen Steriili näytteenottoletku Letkut vesimittariin ja viemäriin / ulos (steriiliys ei välttämätön) Natriumtiosulfaattijauhe (1 g) + ruisku kloorin inaktivointiin Tarja Pitkänen

11 DEUF-näytteenotto käytännössä Varmista ennalta, onko paineellinen järjestelmä, jossa näytteenottohana? Jos ei, onko verkkovirta? = Näytteenotto uppopumpulla Jos ei, akkukäyttöinen letkupumppu Tarvittaessa DEUF voidaan tehdä laboratoriossa kanisterinäytteistä Työskentely kertakäyttökäsineet kädessä Yhdistä letku vesilähteeseen ja johda läpimennyt vesi vesimittarin läpi Lähetä patruuna kylmävaraajien kanssa analysoitavaksi

12 DEUF-patruunan jatkokäsittely laboratoriossa 1. Patruunan tyhjentäminen näytevedestä 2. Patruunan eluointi 3. Konsentraatin jatkokäsittely (pc-suodatus) 4. Suodatin nukleiinihappojen eristykseen Tarja Pitkänen

13 Tarja Pitkänen

14 PCR-analyysi Tarja Pitkänen

15 E. coli -PCR menetelmä Menetelmän tarkoitus Tarvikkeet ja reagenssit Näytteiden esikäsittely RNA-eristys qpcr Validointi & verifiointi Tarja Pitkänen

16 Menetelmän tarkoitus Tavoitteena tunnistaa elinkykyinen E. coli talousvedestä nopeasti qpcr-menetelmän käyttö: ei pitkää kasvatusta, tulos tunneissa Elinkykyisen mikrobin tunnistus tehdään käyttämällä RNA-templaattia Kvalitatiivinen tunnistus: esiintyy/ei esiinny Tarja Pitkänen

17 E. coli-pcr menetelmä Perustuu Hollannissa tehtyyn validointiraporttiin E. colin tunnistamiseksi juomavesiverkosta PCR-menetelmällä Watercycle Research Institute, KWR, 2017 Validointi vertaamalla viljelymenetelmään, sekä laboratorioiden välinen testaus Raportin pohjalta tehty menetelmäohje: Näytteen suodatus RNA-eristys cdna-synteesi qpcr Kuva: KWR, Validation of a realtime RT-PCR method for rapid detection of E. coli in distributed drinking water. Tarja Pitkänen

18 Tarvikkeet ja reagenssit Näytteenottovälineet Suodatuslaitteisto näytteiden esikäsittelyyn Magneettiteline, -kynä tai eristysautomaatti, sekä RNAeristyskitti qpcr-laitteisto sekä cdna-synteesikitti ja qpcr-kitti Alukkeet ja koettimet, standardisekvenssi Tarja Pitkänen

19 Näytteiden esikäsittely Näytteenotto ja kuljetus laboratorioon viileässä DEUF-patruunan purku DEUF-kontrollit DEUF-eluointiliuoksen ja/tai pullonäytteen suodatus 0,4 µm polykarbonaattisuodattimelle Näytteen konsentrointi, kerätään bakteerisolut Positiivikontrolli ja metodikontrolli Jatkokäsittely tai säilöntä -80 o C 24 tunnin kuluessa näytteenotosta Kuva: THL:n labra Tarja Pitkänen

20 RNA-eristys Poistetaan näytteestä ylimääräinen, PCR-reaktiota haittaava materiaali NucliSENS-eristyskitillä (Biomerieux) Bakteerisolut suodattimelta hajotetaan kemiallisesti ja mekaanisesti Eristetään RNA sitomalla se magneettipartikkeleihin ja pesemällä pois epäpuhtaudet Käsin tai robotilla Tuloksena 50 µl RNA-liuosta Kuva: THL:n labra Tarja Pitkänen

21 cdna-synteesi- ja qpcr-menetelmät Jotta RNA:ta voidaan lukea PCRreaktiolla, se on käännettävä DNA-molekyyliksi Käänteiskopioijaentsyymillä Kaksi vaihtoehtoa: Yksivaiheinen menetelmä, joka on hieman nopeampi ja yksinkertaisempi Kaksivaiheinen menetelmä, joka on hieman hitaampi ja työläämpi, mutta josta saadaan halutessa cdna:ta talteen One-step: Two-step: Tarja Pitkänen

22 Yksivaiheinen menetelmä HawkZ05 Fast One-step RT-PCR Kit (Roche) cdna-synteesi- ja qpcr-reagenssit sekä RNA pipetoidaan samaan putkeen/kuoppalevylle Ensin lämpöohjelman käänteiskopiointia varten Sitten qpcr-ohjelma Voidaan ohjelmoida samaan ohjelmaan ja ajaa peräjälkeen Yksi pipetointivaihe vähemmän, kaikki cdna-käytetään qpcrreaktioon Kuva: Bioline: One-step real-time RT-PCR versus two-step real-time RT-PCR Tarja Pitkänen

23 Seuraavaksi hankkeessa THL:n käyttöönottovalidointi Kirjallinen menetelmäohje PCR-valmiuksien kehittäminen Menetelmäperehdytyspäivä (Kuopio) Menetelmän (tai sen osien) testaus osallistuvissa laboratorioissa Simuloidut näytteet, putkirikkonäytteet

24 Kysymyksiä, kommentteja? p Kiitos mielenkiinnostanne!