Bakteeriperäisen turistiripulin diagnostiikka nukleiinihaponosoitusmenetelmillä

Transkriptio

1 Bakteeriperäisen turistiripulin diagnostiikka nukleiinihaponosoitusmenetelmillä Sointu Mero HUSLAB Labquality Days

2 Luennon sisältöä: matkailutaustaa ulosteen bakteeriviljely nukleiinihaponosoitusmenetelmät yleistä esimerkki neljästä erilaisesta kaupallisesta sovelluksesta HUSLABin in-house PCR käyttöönoton suunnittelua 2

3 Matkailutaustaa vuosittain tehdään yli 1000 miljoonaa kansainvälistä matkaa, ja matkustusennuste vuodelle 2030 on peräti 1800 miljoonaa käsittäen työ- ja lomamatkat sekä teollisuus- että kehitysmaihin suomalaiset tekivät yhteensä 7,7 miljoonaa yli yön kestävää ulkomaanmatkaa vuonna 2012 maailmanlaajuisesti ripuli on yleisimpiä kuolemaanjohtavia infektiosairauksia aiheuttaen jopa 2 miljoonaa kuolemaa vuosittain matkailijoiden ripulitapauksista bakteerit aiheuttavat jopa 80% tautitapauksista CDC:n listalla yleisimmät akuutin ripulin taudinaiheuttajat ovat ovat Campylobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., ja STEC (shigatoksiinia tuottava E.coli) 3

4 Ulosteen bakteeriviljely Perinteisesti bakteeriperäiseksi epäillyn ripulin etiologian selvittämiseen on käytetty ulosteen bakteeriviljelyä (F-BaktVi1) salmonellat, shigellat, yersiniat, kampylobakteerit joissain paikoissa lisäksi aeromonas ja plesiomonas HUSLABissa verisestä ulosteesta EHEC ja matkatietojen perusteella Vibrio cholerae Patogeeneiksi epäillyt bakteerit tunnistetaan maldi-tofilla (tai biokemiallisesti) ja spesifisillä vasta-aineilla agglutinoimalla, sekä niille määritetään antibioottiherkkyys Diagnostiikkaan kuluu aikaa 2-4vrk 4

5 Nukleiinihaponosoitusmenetelmät Tarjoavat nopean ja yksinkertaisen tavan osoittaa näytteestä patogeenisen mikrobin/mikrobien nukleiinihappoa Viime vuosina markkinoille on tullut useita bakteeriperäisen ripulin diagnostiikkaan tarkoitettuja nukleiinihaponosoitusmenetelmiä Menetelmät poikkeavat toisistaan valmistajasta riippuen patogeenipaneeli 4-16 mikrobia täysautomaatio / PCR-reaktioseos käsityömäärä <1min PCR-diagnostiikkaan kuluva kokonaisaika ~3-5h Valmistajilta löytyy myös erillisiä kittejä virus- ja parasiittitutkimuksiin 5

6 BD MAX TM Enteric Bacterial Panel Campylobacter (coli ja jejuni) Salmonella spp. Shigella spp. STEC (stx1 ja/tai stx2-geeni) herkkyys 96,9-100% tarkkuus 98,3-100% Ashman et al ECCMID

7 Täysautomaatti sisältää näytteen esikäsittelyn, DNAeristyksen ja monistuksen, sekä detektion (~3h) ulostenäyte siirrostetaan lyysispuskuriin (<1min käsityö / näyte) näytteet sekä reagenssit ladataan laitteeseen (24näytettä / ajo) tulokset ilmoitetaan kullekkin patogeenille POS / NEG 7

8 The LightMix Gastro Panel EHEC Panel Gastro Panel (Bacteria) EHEC Panel Aeromonas Yersinia Campylobacter Shigella Salmonella Plesiomonas EAE-EHEC STX1-EHEC STX2-EHEC 8

9 Cobas 4800 System (cobas x 480 Instrument, cobas z 480 Analyzer) täysautomaatti sisältäen näytteen esikäsittelyn, DNA-eristyksen ja monistuksen, sekä detektion ready-to-use, load-and-go 96 näytettä /sarja, ja 384 näytettä / päivä alle 20min käsityö täydelle sarjalle The LightMix Modular Assays LightCycler 480 / LightCycler 96 mahdollistaa oman kustomoidun patogeenipaneelin suunnittelun (sisältäen myös virukset ja parasiitit) suosittelee ulostenäytteille suunniteltua DNA-eristysprotokollaa 9

10 Amplidiag TM Bacterial GE Campylobacter Salmonella Shigella / EIEC (enteroinvasive E.coli) Yersinia EHEC (enterohemorrhagic E.coli) ETEC (enterotoxigenic E.coli) EAEC (enteroaggregative E.coli) EPEC (enteropathogenic E.coli) herkkyys 99,0% tarkkuus 99,9% 10

11 kitti sisältää: qpcr-oligomixin ja Amplidiag TM Analyzer software -ohjelman tulokset luvataan 3 tunnissa (DNA-eristysautomaattia tai qpcr-laitetta ei ole erikseen määritelty) Mobidiag lupaa auttaa laboratoriota näytteen esikäsittelyn ja DNA-eristyksen suunnittelussa, jos tarvetta 11

12 xtag Gastrointestinal Pathogen Panel Salmonella Shigella Campylobacter Clostridium difficile Toxin A/B ETEC LT/ST Escherichia coli O157 STEC stx1/stx2 Yersinia enterocolitica Vibrio cholerae Entamoeba histolytica Cryptosporidium Rotavirus A Adenovirus 40/41 Norovirus G1/G2 herkkyys 84,6 100%, tarkkuus 94,9 100% Clinical Performance Characteristics of the xtag Gastrointestinal Pathogen Panel (GPP): A Multi-Center Clinical Evaluation. Luminex Molecular Diagnostics. 12

13 kitti sisältää reagenssit nukleiinihapon monistukseen, PCR:n jälkeiseen hybridisaatioon ja detektioon DNA-eristys ei kuulu kittiin, mutta siihen suositellaan Biomeriéuxin NucliSENS EasyMAG -reagensseja tulokset ~5h (sisältäen DNA-eristyksen n.1h) tulosten analysointi TDAS software ohjelmalla, ja tulkinta jokaiselle patogeenille POS / NEG MAGPIX Luminex 100/200 TM 13

14 in-house F-BaktVIP Salmonella sp. Shigella / EIEC (enteroinvasiivinen E.coli) Yersinia enterocolitica/pseudotuberculosis/pestis Campylobacter jejuni/coli Vibrio cholerae EHEC (enterohemorraaginen E.coli) ETEC (enterotoxigeeninen E.coli) EAEC (enteroaggregatiivinen E.coli) EPEC (enteropatogeeninen E.coli) tunnistus PCR:llä sukutasolle, tarkempi lajinimi ja antibioottiherkkyys viljelyllä viljely jos PCR positiivinen vain PCR-tunnistus herkkyys 100%, tarkkuus 100% Antikainen ym. A Polymerase Chain Reaction Assay for Rapid Detection of 9 Pathogens Directly From Stools of Travelers With Diarrhea. CGH 2013;11:

15 Yhdistelmätutkimusta (VIP= viljely ja PCR) varten laboratorioon lähetetään kolme näytetikkua kaksi viljelyyn yksi qpcr:ään DNA-eristys suoritetaan Tecan Freedom EVO laitteella Biomeriéuxin NucliSENS EasyMAG -reagensseilla qpcr, tulosten tulkinta ja puoliautomaattinen siirto potilastietojärjestelmään, ~4h 15

16 F-BaktVIP tutkimus otettiin HUSLABissa käyttöön syksyllä 2012 Yhdistelmätutkimuksella optimoidaan menetelmien hyödyt PCR-tulos, esim. NhO+ SALMONELLA, vastataan nopeasti (näytteen saapumista seuraavana arkipäivänä) harvinaiset tai hankalasti viljeltävät patogeenit (EHEC ja Vibrio cholerae) viljellään / tutkitaan vain positiivisen PCR-reaktion perusteella negatiivinen viljelytulos 2-4vrk kuluttua: NhO NEGATIIVINEN VILJELY NEGATIIVINEN viljelytutkimuksesta saadaan tarvittava antibioottiherkkyysmääritystulos yleisvaaralliset bakteerit saadaan eristettyä ja lähetettyä THL:n tartuntatautien mikrobikantakokoelmaan tartuntatauti-ilmoitus Tulosten tulkinta +/- tilanteissa 16

17 Mikään menetelmä ei sovi kaikille Nukleiinihaponosoitusdiagnostiikan käyttöönottoa suunnittelevan laboratorion on mietittävä mikä menetelmä soveltuu parhaiten juuri kyseiselle laboratoriolle näytemäärä käytössä oleva laitekanta ja kapasiteetti pärjätäänkö sillä? ollaanko tekemässä laitehankintoja? täysautomaatio vai in-house tyyppinen PCR-testi? Viljelytutkimus / yhdistelmätutkimus viljelläänkö edelleen kaikki näytteet? viljelläänkö vain PCR-positiiviset näytteet? Positiivisen potilaan seurantatutkimukseksi suositellaan kyseistä viljelyllä tehtävää osatutkimusta (F-CampVi, F-SalmVi, F-ShigVi, F-YersVi, F-VichVi ja F-EHECVTx) PCR-tutkimus ei ole juridisesti merkittävä esim. salmonella-kantajuuden osoittamisessa 17

18 KIITOS! 18