IMUSUONITUKSEN ENNUSTEELLINEN MERKITYS MUNASARJASYÖVÄSSÄ

IMUSUONITUKSEN ENNUSTEELLINEN MERKITYS MUNASARJASYÖVÄSSÄ Mari Lappalainen Opinnäytetyö Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Naistentautien ja synnytysten klinikka Marraskuu 2011

2 ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen koulutusohjelma LAPPALAINEN, MARI A.: Imusuonituksen ennusteellinen merkitys munasarjasyövässä Opinnäytetyö, 28 sivua Opinnäytetyön ohjaaja: dosentti Maarit Anttila (LT, erikoislääkäri) Marraskuu 2011 Avainsanat: munasarjasyöpä, imusuonitus, ennuste, VEGF-C & -D, D2-40, immunohistokemia, hyaluronaani Munasarjasyöpä kuuluu naisten yleisimpiin syöpiin erityisesti korkean elintason maissa. Munasarjasyövän kuolleisuusluvut ovat pysyneet hoitojen kehityksestä huolimatta korkeina, sillä suurin osa syövistä on diagnoosihetkellä pitkälle edenneessä vaiheessa. Imusuonituksella on tärkeä rooli syöpien leviämisessä imusolmukkeisiin ja muihin kudoksiin. Imusuonten kehittymistä säätelevät eri kasvutekijät, tärkeimpinä VEGF-C ja -D, jotka stimuloivat niiden kasvua. Useissa tutkimuksissa on todettu, että syöpäkasvaimet voivat tuottaa edellä mainittuja ja muita uudisimusuonitukseen tarvittavia kasvutekijöitä. Imusuonituksen uudismuodostus on tärkeä syövän kasvun ja leviämisen mahdollistava keino ja tämän vuoksi tärkeä tutkimuksen kohde. Toistaiseksi imusuonituksen ennusteellisesta merkityksestä munasarjasyövässä on vain vähän tietoa. Hyaluronaani on soluväliaineen sokerimolekyyli, jonka aineenvaihdunta häiriintyy syövässä, jolloin sen määrä moninkertaistuu samalla edistäen syövän etenemistä eri mekanismein. Tutkimuksissa on todettu positiivinen korrelaatio hyaluronaanin määrän ja munasarjasyövän aggressiivisuuden välillä. Tämän työn tarkoituksena oli tutkia 83 immunohistokemiallisesti värjätystä (DAKO,D2-40) munasarjasyöpänäytteestä imusuonituksen laajuutta (LVD) ja selvittää, onko tällä ennusteellista merkitystä ja löytyykö yhteyttä hyaluronaanipositiivisuuteen. Tulosten perusteella LVD:n vaihtelu oli näytteissä runsasta ja imusuonitus sijaitsi useimmiten kasvaimen reuna-alueilla. Tutkimuksessa ei tullut ilmi merkittävää yhteyttä LVD:n ja kliinispatologisten muuttujien, kuten hyaluronaanipositiivisuuden, erilaistumisasteen, syöpätyypin tai levinneisyyden, välillä. LVD ei myöskään korreloinut tautikuolleisuuteen, mutta havaittiin kuitenkin, että runsaampi imusuonitus oli viitteellinen lyhyemmän tautivapaan ajan suhteen.

3 Sisältö 1. JOHDANTO... 4 2. MUNASARJASYÖPÄ... 5 2.1. Epidemiologiaa ja riskitekijöitä... 5 2.2. Etiologiaa... 7 2.3. Epiteliaalinen munasarjasyöpä... 7 2.4. Oireet ja diagnostiikka... 8 2.5. Hoito ja ennuste... 10 3. IMUSUONISTO... 13 3.1. Imusuoniston rakenne ja tehtävät... 13 3.2. Imusuoniston kehityksen säätely ja kasvutekijät... 13 3.3. Imusuoniston merkitys syövässä... 14 3.4. Imusuonituksen merkitys munasarjasyövässä... 17 4. HYALURONAANI... 18 5. TUTKIMUSMATERIAALI JA -MENETELMÄT... 19 5.1. Tutkimusmateriaali... 19 5.2 Immunohistokemia... 20 5.2.1 D2-40... 20 5.2.2 Hyaluronaani... 20 5.3. Värjäyksen tulkinta... 21 6. TULOKSET... 22 7. POHDINTA... 26 LÄHTEET... 28

4 1. JOHDANTO Tilastojen mukaan naisista 1/70 sairastuu elinaikanaan ja 1/100 kuolee munasarjasyöpään. Munasarjasyöpä on tappavin kaikista gynekologisista syövistä, ja suurin osa syövistä diagnosoidaankin vasta levinneessä vaiheessa. (Bhoola 2006). Sukurasite on munasarjasyövän tärkein riskitekijä. Mutaatioihin kasvaimenestogeenissä BRCA1 tai BRCA2 liittyy lisääntynyt munasarjasyövän riski. Yli 90 % invasiivisista munasarjasyövistä on epiteliaalisia eli lähtöisin pintaepiteelistä. Munasarjasyövän levinneisyydessä käytetään kansainvälistä FI- GO-luokittelua (I-IV). (Hennessy 2009). Varhaisen vaiheen syövillä on hyvä ennuste, levinneen taudin ennuste riippuu pääasiassa kirurgisen hoidon radikaaliusasteesta. Syövän hoito on ensisijaisesti kirurginen, minkä lisäksi solunsalpaajilla (usein platinapohjaisen solunsalpaajan ja taksaanin yhdistelmä) on suuri merkitys syövän hoidossa. (Bhoola 2006). Imusuoniston tehtävä on säädellä kudosten nestetasapainoa ja sillä on tärkeä tehtävä elimistön puolustusjärjestelmässä. Uudisimusuonten muodostusta tapahtuu sikiön kehityksen lisäksi tulehdusten, haavan paranemisen ja kasvainten metastasoinnin aikana, ja imusuonituksella onkin olennainen osa monien sairauksien, mm. syövän kehittymisessä (Alitalo 2005). Usein syövät lähettävät etäpesäkkeitä imuteitä pitkin alueellisiin imusolmukkeisiin ennen laajempaa metastasointia. Imusolmukemetastaaseihin liittyy myös huonontunut ennuste verrattuna paikallisesti rajoittuneeseen tautiin. Imusuonituksen uudismuodostus on tärkeä syövän kasvun ja leviämisen mahdollistava keino. Uudismuodostusta säätelevät ensisijaisesti VEGF-perheen C ja D sekä niiden reseptori VEGFR-3. (Sundar 2006). Hyaluronaani on soluvälitilan pitkäketjuinen sokerimolekyyli, jolla on suuri merkitys syövän biologiassa. Sen hajoamistuotteiden on havaittu edistävän syövän kasvulle välttämätöntä verisuonten kasvua (Kultti 2009). Useissa tutkimuksissa on saatu todisteita hyaluronaanin tärkeydestä syövän kasvussa ja metastasoinnissa (Sironen 2010). Syventävissä opinnoissani tutustuin munasarjasyöpään ja imusuonituksen merkitykseen syövässä ja metastasoinnissa. Työhöni liittyy 83 immunohistokemiallisesti värjätyn munasarjasyöpänäytteen analysointi valomikroskoopilla ja käyttäen SPSS-tilasto-ohjelmaa. Tavoitteena oli selvittää imusuonituksen merkitystä munasarjasyövässä sekä arvioida, on-

5 ko imusuonituksen laajuudella yhteyttä hyaluronaanipositiivisuuteen. Tutkimusaineisto on kerätty Kuopion yliopistollisen sairaalan ja Keski-Suomen keskussairaalan potilaista. 2. MUNASARJASYÖPÄ 2.1. Epidemiologiaa ja riskitekijöitä Maailmanlaajuisesti munasarjasyöpä on kuudenneksi yleisin naisten syöpä ja se kattaa 4 % kaikista naisten syövistä (Parkin 2005). Keskimäärin elinikäinen riski sairastua munasarjasyöpään on 1:70 (Cannistra 2004). Ilmaantuvuus on korkeinta Euroopassa ja Yhdysvalloissa ja matalinta Japanissa ja kehitysmaissa (Hennessy 2009). Käypä hoito -sivuston mukaan munasarjasyöpä on Suomessa kuudenneksi yleisin naisten syöpä ja toiseksi yleisin gynekologinen syöpä ja siihen kuolee enemmän potilaita kuin muihin gynekologisiin syöpiin yhteensä (Munasarjasyöpä: Käypä hoito -suositus, 2007). Vuonna 2009 Suomessa munasarjasyöpään sairastui 433 ja kuoli 294 naista, ilmaantuvuuden ollessa tuolloin 8,1 ja kuolleisuuden 4,6 / 100 000 henkilövuotta. Ilmaantuvuus on korkeimmillaan 55 74- vuotiailla. Pohjois-Savon sairaanhoitopiirissä keskimääräinen sairastuneiden määrä vuosina 2005 2009 oli 21. Noin 70 % munasarjasyövistä oli diagnoosihetkellä levinneitä (Cancerregistry 2011). Tärkein riskitekijä munasarja- ja rintasyövän suhteen on sukurasite. Naisilla, joilla on mutaatio kasvaimenestogeenissä BRCA1 tai BRCA2, on lisääntynyt riski sairastua munasarjasyöpään. BRCA1-mutaation kantajilla arvellaan olevan 39 46 %:n riski sairastua munasarjasyöpään, BRCA2-mutaation aiheuttama riski on arviolta 12 20 %. BRCA1- ja 2- mutaatioiden kantajille suositellaankin munasarjojen ehkäisevää poistoa, kun lapsia on haluttu määrä (Hennessy 2009). Kohonnut riski liittyy myös HNPCC-oireyhtymään, jossa on kyse mutaatiosta DNA:n korjausgeeneissä (Cannistra 2004). Muita riskitekijöitä ovat aikainen kuukautisten alkamisikä, myöhäinen menopaussi ja lapsettomuus (Hennessy 2009). Aiemmin tuloksettomiin lapsettomuushoitoihin liitettiin lisääntynyt syöpäriski (Whittemore 1992), mutta uusimmissa tutkimuksissa yhteyttä ei ole havaittu (Jensen 2009). Myös pitkäkestoisen hormonikorvaushoidon on todettu lisäävän munasarjasyöpää (Beral 2007). Munasarjasyövältä suojaavia tekijöitä ovat synnytykset, imetys, ehkäisytablettien käyttö ja sterilisaatio (Hennessy 2009) sekä kohdun poisto (Green 1997).

6

7 2.2. Etiologiaa Munasarjasyövän etiologiasta on useita hypoteeseja, eikä tarkkaa patogeneesia ole saatu selville. Vallalla olevan ovulaatio-hypoteesin (Fathalla 1971) mukaan etiologian arvellaan perustuvan ovulaatioiden aiheuttamiin vaurioihin munasarjan pintaepiteelissä ja inkluusiokystien muodostumiseen. Myös ympäristötekijöillä näyttäisi olevan merkitystä munasarjasyövän synnyssä, sillä yhdysvaltoihin muuttaneiden japanilaissiirtolaisten tyttärillä näyttäisi olevan yhtä suuri sairastumisriski kuin kantaväestöllä, vaikka japanissa muutoin munasarjasyöpä on huomattavasti harvinaisempi kuin muissa kehittyneissä maissa (Gabra 2007). 2.3. Epiteliaalinen munasarjasyöpä Yli 90 % invasiivisista munasarjasyövistä on epiteliaalisia, loput munasarjasyövistä ovat itusolu- ja sukupienakasvaimia. Yleisin pintaepiteelistä lähtöisin oleva kasvaintyyppi on seroosi ja toiseksi yleisimmät ovat endometrioidi ja musinoosi, muut ovat harvinaisempia. (Taulukko 1) TAULUKKO 1. Munasarjasyöpien histologinen jakauma. Histologia % Epiteliaaliset kasvaimet (karsinoomat) 92 96 Seroosi 40 Endometrioidi 10 24 Musinoosi 3 10 Kirkassolukarsinooma 5 11 Pahanlaatuinen Brennerin tuumori alle 0,1 Erilaistumaton 6 Sekamuoto 5 Itusolukasvaimet 3 5 Sukupienakasvaimet 5 10 Munasarjasyöpä: Käypä hoito -suositus, 2007 Erilaistumisasteen perusteella kasvaimet luokitellaan lievästi, kohtalaisesti tai vahvasti erilaistumattomiin (asteet 1 3). Epiteliaalinen munasarjasyöpä jaetaan tyypin I tai II luokkaan riippuen siitä, miten kasvain on kehittynyt. Tyypin I kasvaimet kehittyvät asteittain

8 hyvänlaatuisista muutoksista pahanlaatuisiksi ja ovat lievästi erilaistuneita, kun taas tyypin II kasvaimet kehittyvät suoraan huonosti erilaistuneiksi syöviksi (Hennessy 2009). Munasarjasyöpä leviää kolmella eri tavalla, kapselin rikkouduttua suoraan ympäröiviin lantion elimiin, hilseilemällä vatsaonteloon syöpäsoluina ja imuteitse. Hilseilleet syöpäsolut kulkeutuvat pallean hengitysliikkeiden ja suoliston liikkeiden mukana ympäri vatsaonteloa, niinpä etäpesäkkeet pallean pinnalla ja vatsakalvolla ovat yleisiä. Imuteitä pitkin syöpä leviää lantion alueen ja para-aortaalisiin imusolmukkeisiin. Lähes kaikissa levinneissä syövissä ja 20 %:ssa varhaisvaiheen syövissä tauti on levinnyt imusolmukkeisiin (Bhoola 2006). Veriteitse leviäminen on harvinaista munasarjasyövässä, joissakin tapauksissa syöpä kuitenkin voi levitä veriteitse mm. maksakudokseen ja keuhkoihin (Leminen ja Lehtovirta 2006). 2.4. Oireet ja diagnostiikka Munasarjasyöpä on alussa usein oireeton ja myöhemminkin taudin oireet voivat olla niin epäspesifisiä, että diagnoosiin päästään vasta kun syöpä on jo levinnyt. Yleisimpiä oireita ovat vatsakivut ja vatsan turvotus (askites), suolisto-oireet, virtsavaivat ja yleinen heikkous. Suurimmalla osalla levinnyttä syöpää sairastavista voidaan havaita palpoituva kasvain, mikä ohjaa oikeaan diagnoosiin. Munasarjasyövän lopullinen diagnoosi perustuu leikkauksessa irrotetun kudosnäytteen histopatologiseen tutkimukseen. Leikkausta edeltävästi tehdään diagnoosiepäilyn varmistamiseksi laboratorio- ja kuvantamistutkimuksia. Kasvainmerkkiainetutkimuksista tärkeimpänä pidetään CA 125:ta, joka on kohonnut yli 80 % levinnyttä syöpää sairastavista (Cannistra 2004), muita käytössä olevia merkkiaineita ovat CEA (karsinoembryonaalinen antigeeni), AFP (alfafetoproteiini), βhcg (β-korioninen gonadotropiini) ja LD (laktaattidehydrogenaasi), nämä lähinnä nuorilla potilailla itusolukasvainten poissulkemiseksi (Benedet 2000). Emättimen kautta tehtävä ultraäänitutkimus kuuluu perustutkimuksiin, ja se näyttäisi olevan tietokonetomografiaa parempi havaitsemaan lantion seudun kasvaimia ja antamaan informaatiota kasvaimen laadusta. Laparotomiateitse tehtävässä leikkauksessa saadaan histologinen varmistus ja kasvaimen luokitus. (Cannistra 2004). Taulukossa 2 on nähtävillä

9 FIGO:n (International Federation of Gynecology and Obstetrics) luokitus, joka perustuu kirurgisiin, sytologisiin ja histopatologisiin löydöksiin munasarjasyövässä.

10 TAULUKKO 2. Munasarjasyövän levinneisyysluokittelu (FIGO) Luokka Levinneisyys I Kasvain rajoittunut munasarjoihin A Kasvain vain toisessa munasarjassa, munasarjan kapseli ehjä, pinnassa ei kasvainta, ei kasvainsoluja askiteksessa eikä huuhtelunäytteissä B Kasvain molemmissa munasarjoissa, munasarjojen kapselit ehjät, pinnassa ei kasvainta, ei kasvainsoluja askiteksessa eikä huuhtelunäytteissä C Kasvain toisessa tai kummassakin munasarjassa ja lisäksi munasarjan kapseli revennyt tai kasvainta munasarjan pinnassa tai askiteksessa taikka huuhtelunäytteissä kasvainsoluja II Kasvain toisessa tai kummassakin munasarjassa ja lantion alueella A Kasvain levinnyt kohtuun tai munanjohtimiin, ei kasvainsoluja askiteksessa eikä huuhtelunäytteissä B Kasvainta muissa lantion kudoksissa, ei kasvainsoluja askiteksessa eikä huuhtelunäytteissä C Kasvain levinnyt muihin lantion elimiin ja kasvainsoluja askiteksessa tai huuhtelunäytteissä III A B C IV Kasvain toisessa tai kummassakin munasarjassa, kasvainta peritoneumissa lantion ulkopuolella tai alueellisissa imusolmukkeissa, maksassa pinnallisia etäpesäkkeitä Primaarikasvain lantion alueella ja mikroskooppisesti varmistettu leviäminen lantion ulkopuolelle peritoneumiin, ei kasvainkudosta imusolmukkeisssa Vatsaontelon pesäkkeet kooltaan alle 2 cm, ei kasvainkudosta imusolmukkeissa Vatsaontelon pesäkkeet kooltaan yli 2 cm tai kasvainkudosta imusolmukkeissa Kasvain toisessa tai kummassakin munasarjassa, etäpesäkkeet vatsaontelon ulkopuolella, pleuranesteessä kasvainsoluja, maksassa parenkyymipesäkkeitä Munasarjasyöpä: Käypä hoito -suositus, 2007 2.5. Hoito ja ennuste Munasarjasyövän hoito on ensisijaisesti kirurginen. Tavoitteena on kasvaimen täydellinen poisto tai ellei tämä onnistu, sytoreduktio eli mahdollisimman täydellinen poisto (Cannistra 2004), sillä levinneessä taudissa sytoreduktion jälkeinen jäljelle jääneen kasvaimen koko on tärkein ennustetekijä (Hennessy 2009). Jokaista 10 %:n lisäystä poistettavassa kasvainmassassa vastaa 5,5 %:n parantuminen eloonjäännin mediaanissa, ja paras etu sytoreduktiosta eloonjäämisen suhteen saadaan, kun jäännöskasvaimen koko on alle 1 cm (Bristow 2002). Standardileikkauksessa poistetaan kohtu, munanjohtimet ja munasarjat, osa vatsapaitaa ja epäilyttävät imusolmukkeet, koepaloja otetaan lantion sekä para-aortaalisista imusolmukkeista, tutkitaan vatsaontelon seinämät ja huuhdellaan vatsaontelo (Hennessy 2009). Joidenkin tutkimusten mukaan imusolmukkeiden systemaattisella poistolla olisi

11 hyödyllinen vaikutus potilaan ennusteeseen (Crawford 2005). Toispuoleista munasarjan ja munatorvenpoistoa voidaan harkita potilaalle, jolla on aste IA tai IC -luokan tauti ja on tarve säilyttää hedelmällisyys (Hennessy 2009). Suurin osa munasarjasyöpäpotilaista saa leikkauksen jälkeen adjuvanttisolunsalpaajalääkitystä, jonka tarkoituksena on poistaa jäljelle jäänyt syöpä. Ainoastaan potilaat, joilla on luokan 1A tai B ja gradus 1 -kasvain, eivät saa adjuvanttihoitoa, sillä yli 90 %:lla heistä on todettu olevan yli kymmenen vuoden tautivapaa ennuste ilman lisähoitoja. Muille potilaille annetaan (3-) 6 sykliä yhdistelmähoitoa karboplatiinilla ja paklitakselilla, mikä on munasarjasyövän ensisijainen solunsalpaajahoito. Vatsaontelon sisäinen solunsalpaajalääkitys on joissakin tutkimuksissa parantanut potilaiden ennustetta (Armstrong 2006), mutta sen käyttöä komplisoivat toksisuus ja tekniset ongelmat, joten sitä ei ole hyväksytty yleiseen käyttöön munasarjasyövän hoidossa (Hennessy 2009). Primaaristi on mahdollista saavuttaa hyvä hoitovaste, mutta optimaalisesta kirurgiasta ja solunsalpaajahoidosta huolimatta jopa 75 %:lla levinnyttä tautia sairastavista tauti uusii (Kikuchi 2005). Uusiutuvassa taudissa toisen linjan hoito valitaan sen perusteella, onko syöpä herkkä vai vastustuskykyinen solunsalpaajalle (platinajohdokselle). Kasvain on herkkä solunsalpaajalle, jos vaste hoitoon kestää yli kuusi kuukautta. Vastaavasti kasvain on vastustuskykyinen solunsalpaajalle, mikäli tauti etenee primaarin hoidon aikana tai jos vaste kestää alle kuusi kuukautta (Markman 1991). Platinalle herkän kasvaimen uusiutuman hoidossa käytetään karboplatiinia yhdistettynä paklitakseliin, platinapohjaiselle solunsalpaajalle vastustuskykyisen kasvaimen uusiutumassa valitaan muu solunsalpaaja, esimerkiksi doketakseli, gemsitabiini tai vinorelbiini. Koska vaste toisen linjan hoitoon on varsin vähäinen, noin 20 % (Bhoola 2006), voidaan ajatella, että kyse on palliatiivisesta hoidosta, jonka hyödyt ja haitat kannattaa punnita tarkkaan, kuunnellen potilaan tahtoa. Palliaatio perustuu hyvälle kivunlievitykselle, ja tarvittaessa voidaan kirurgisesti helpottaa mm. suolisto- tai virtsatietukosoireita. Kivuliaaseen lantion kasvaimeen voidaan joissakin tapauksissa käyttää sädehoitoa, jolla ei muutoin ole roolia munasarjasyövän hoidossa (Hennessy 2009) Kehitteillä on uusia hoitomuotoja, joiden vaikutuskohteena on syöpäkudoksen lisäksi kasvainta ympäröivä strooma, verisuonitus tai immuunivaste. Toistaiseksi täsmälääkkeiden tehosta uusiutuneen munasarjasyövän hoidossa on vähän kokemuksia. Ensimmäinen syövän hoitoon hyväksytty verisuonten kasvua estävä täsmälääke bevasitsumabi yksinään

12 (Cannistra 2007) tai liitettynä pieniannoksiseen syklofosfamidihoitoon (Garcia 2008) näyttäisi tuottavan noin 20 %:n hoitovasteen. Munasarjasyövän ennuste riippuu ennen kaikkea levinneisyydestä. Levinneessä munasarjasyövässä (FIGO III-IV) viiden vuoden elossaoloennuste on 19 47 %, mutta varhaisen vaiheen (FIGO I-II) syövän ennuste on hyvä, 71 90 % on elossa viiden vuoden kuluttua. (Heintz 2006). Varhaisen vaiheen syövissä ennustemerkitystä on levinneisyysluokituksella, kapselin läpäisevyydellä, erilaistumisasteella, histologisella tyypillä, potilaan iällä ja askiteksen sytologialla. Levinneessä taudissa jäljelle jääneen kasvaimen koon lisäksi merkittäviä ennustetekijöitä ovat levinneisyysluokka, histologinen tyyppi, ikä, erilaistumisaste ja leviäminen imusolmukkeisiin (Hennessy 2009). Edellä mainittujen pääasiallisten ennustetekijöiden lisäksi myös muilla muuttujilla on tutkimuksissa havaittu olevan ennustevaikutusta. Muun muassa soluadheesioon liittyvät tekijät ovat tärkeitä syövän kehityksen kannalta. Esimerkkinä solunulkoinen polysakkaridi, hyaluronaani, jonka määrän on todettu olevan koholla levinneissä, huonosti erilaistuneissa kasvaimissa, muodostaen itsenäisen ennustetekijän eloonjäännin suhteen (Anttila 2000).

13 3. IMUSUONISTO 3.1. Imusuoniston rakenne ja tehtävät Imusuoniverkosto muodostuu päistään avonaisten ohuiden imukapillaarien yhdistyessä laajempiin kokoojasuoniin ja lopulta imusolmukkeiden kautta imutierunkoihin ja rintatiehyen sekä oikean imutiehyen kautta laskimoverenkiertoon. Imukapillaarit muodostuvat yhdestä solukerroksesta (LEC; lymphatic endothelial cell), eikä niissä ole tyvikalvoa, ympäröiviä perisyyttejä tai sileää lihasta, vaan ne ovat kiinnittyneet solunulkoiseen tilaan elastisilla ankkurifilamenteilla. Suurempia kokoojasuonia ympäröi supistumiskykyinen sileälihaskerros, ja niissä on läpät edesauttamassa imunesteen virtausta yhteen suuntaan (Alitalo 2005). Imusuoniston tärkein tehtävä on säädellä kudosten nestetasapainoa kuljettamalla valtimokapillaareista tihkunutta proteiinipitoista nestettä ja makromolekyylejä takaisin verenkiertoon. Lisäksi imusuonituksella on tärkeä tehtävä elimistön puolustusjärjestelmässä, lymfosyyttien ja antigeeniä esittelevien solujen kulkeutuessa niitä pitkin imusolmukkeisiin, joissa tunnistetaan elimistölle vieraat tekijät ja saadaan aikaan immuunivasteen kehittyminen (Tammela 2005). Ohutsuolen suolinukassa imusuonten tehtävänä on absorboida ravinnon rasvoja, kylomikroneita, ja kuljettaa ne edelleen verenkiertoon (Tammela ja Alitalo 2010). Imusuonituksella on myös tärkeä osa monien sairauksien, kuten syövän, lymfedeeman ja tulehdustilojen kehittymisessä (Alitalo 2005). 3.2. Imusuoniston kehityksen säätely ja kasvutekijät Sikiön kehityksen jälkeen uusien imusuonten muodostusta tapahtuu tulehdusten, haavan paranemisen ja kasvainten metastasoinnin aikana (Tammela ja Alitalo 2010). Imusuonten uudismuodostus tapahtuu pääasiassa olemassa olevien imusuonten versomisena. Imusuonten kehityksen ja säätelyn mekanismeja on alettu ymmärtää vasta viime vuosina, kun on tunnistettu niihin vaikuttavia molekyylejä. Uusien imusuonten kasvua (lymphangiogenesis) säätelevät monet kasvutekijät, joista tärkeimpiä ja eniten tutkittuja ovat VEGF (vascular endothelial growth factor) -perheen VEGF-C ja -D sekä niiden reseptori VEGFR-3. VEGF-C ja -D kasvutekijät lisäävät myös verisuonten kasvua (angiogenesis) (kuva 1).

14 Myös angiopoietiinien on todettu edistävän imusuonten kasvua, tehokkaimmaksi on osoittautunut Ang-1 (Tammela 2005b). Muita imusuonten uudismuodosta lisääviä kasvutekijöitä ovat verihiutaleperäinen kasvutekijä (PDGF), hepatosyyttikasvutekijä (HGF), ja insuliininkaltaiset kasvutekijät (IGF-1 ja IGF-2) (Van der Auwera 2006, kuva 2). KUVA 1. VEGF-perheen kasvutekijät ja niiden reseptorit. Reseptoreista VEGFR-1 ja VEGFR-2 välittävät verisuonten ja VEGFR-3 imusuonten muodostusta (Al-Rawi 2005) KUVA 2. Imusuonten muodostukseen vaikuttavat kasvutekijät ja niiden reseptorit (Van der Auwera 2006) 3.3. Imusuoniston merkitys syövässä Imusuonistolla on olennaisen tärkeä merkitys monissa syövissä, sillä kasvainsolujen tunkeutuminen imusuoniin ja imusolmuke-etäpesäkkeiden kehittyminen vaikuttaa merkittävästi syövän levinneisyysluokkaan ja syöpäpotilaan ennusteeseen (Schoppmann 2002). Alueellisten imusolmuke-etäpesäkkeiden esiintyminen on yleistä kiinteiden kasvainten

15 kohdalla, ja se on merkki levinneestä taudista ja huonommasta ennusteesta (Sundar ja Ganesan 2007). Imuteiden rakenne mahdollistaa kasvainsolujen tunkeutumisen niihin huomattavasti helpommin kuin verisuoniin, johtuen väljistä solujen välisistä liitoksista ja perisyyttien ja tyvikalvon puutteesta (Saharinen 2004), lisäksi imutiet ovat laajempia kuin verisuoniston kapillaarit (Al-Rawi 2005). Nykytietämyksen mukaan imusuonten uudismuodostus on ratkaisevassa asemassa syöpäsolujen leviämisessä alueellisiin imusolmukkeisiin (Al-Rawi 2011). Aiemmin uskottiin syövän leviämisen imuteiden kautta olevan pelkästään passiivinen prosessi, mutta viime vuosina saadun tutkimustiedon myötä on käynyt ilmi, että uudisimusuonitus, jota säätelee monimutkaisesti kasvutekijät, syto- ja kemokiinit, vaikuttaa aktiivisesti syövän leviämiseen (Ji 2006). Syöpäkasvaimen nopean kasvun vasteena imusuonistossa tapahtuu dramaattisia muutoksia, kuten imusuonten endoteelisolujen (LEC) versomista ja kasvainta ympäröivien imuteiden laajentumista (He 2005). Kasvainsolut ja makrofagit tuottavat imusuonikasvutekijöitä, jotka tehostavat kasvaimen ympärillä olevien imuteiden kasvua ja laajentumista sekä helpottavat kasvainsolujen tunkeutumista niihin (Alitalo 2005). Tutkimuksissa on osoitettu positiivinen korrelaatio VEGF-C:n ja -D:n ilmentymisen ja imutieinvaasion, imusolmuke- ja kaukometastasoinnin ja huonon eloonjäämisennusteen välillä useissa syövissä (Achen 2005). Siirtogeenisissä koe-eläinmalleissa on todettu VEGF-C:n ja -D:n yli-ilmentymisen johtavan imusuonten uudismuodostukseen ja lisäävän kasvaimen leviämistä alueellisiin imusolmukkeisiin jopa sellaisissa kasvaimissa, jotka eivät normaalisti leviä imusolmukkeisiin (Alitalo 2005). Vastaavasti useissa kasvainmalleissa saatiin imusolmukemetastasointi vähenemään 60 70 % estämällä VEGFR-3-reitti (Achen 2005). (Kuva 3)

16 KUVA 3. VEGF-C/D:n lisääntyneen ilmentymisen vaikutus imusuonten uudismuodostukseen ja imusolmukemetastasointiin (A). VEGF-C/D / VEGFR-3 -signaloinnin esto on koeeläinmalleissa estänyt imusolmukemetastoinnin (B). (Sundar ja Ganesan 2007) Kiistanalaista on ollut, onko syöpäkudoksen sisäisillä (ITL; intratumoral lymphatics) vai sitä läheisesti ympäröivillä imusuonilla (PTL; peritumoral lymphatics) suurempi merkitys syövän patologiassa ja leviämisessä imusolmukkeisiin (Van der Auwera 2006). Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että PTL:t olisivat toiminnallisia (Achen 2005), kun taas ITL:t korkeasta kasvaimen sisäisestä paineesta johtuen olisivat huonosti toimivia ja merkityksettömiä metastasoinnin kannalta (Padera 2002). Viime vuosien aikana ymmärrys imusuonituksen merkityksestä ja metastasoinnin mekanismeista syövissä on parantunut uusien imusuonimarkkereiden myötä. Tutkimuksissa käytetyimpiä näistä ovat LYVE-1, D2-40 ja podoplaniini. LYVE-1 on imutiespesifinen hyaluronaanireseptori ja D2-40 on monoklonaalinen vasta-aine, joka reagoi mm. itusolutuumoreihin, mutta on todettu luotettavaksi imusuonimarkkeriksi. Markkerien löytyminen on mahdollistanut tutkimukset imusuonituksen tiheyden (LVD; lymphatic vessel density, MVD; microvessel density) merkittävyydestä syövän ennustetekijänä tai välineenä, jolla voisi ennustaa imusolmukemetastasointia (Sundar ja Ganesan 2007). Useissa syövissä

17 LVD:n on havaittu korreloivan imusolmukemetastasointiin ja huonoon ennusteeseen (Achen 2005). Tutkimuksissa LVD:n on havaittu korreloivan imusolmukemetastasointiin ainakin kolorektaalisyövässä (Matsumoto 2007), pään ja kaulan levyepiteelikarsinoomissa (Kayzas 2005), rintasyövässä (Nakamura 2005) ja mahasyövässä (Kitadai 2005). 3.4. Imusuonituksen merkitys munasarjasyövässä Imusuonituksen ennusteellisesta merkityksestä munasarjasyövässä on toistaiseksi vähän tietoa. Munasarjasyövässä on todettu VEGF-C-tason korreloivan imusolmukemetastoinnin ja huonomman ennusteen kanssa (Nishida 2004). VEGF-D-taso korreloi myös imusolmukemetastasointiin ja huonoon ennusteeseen, ja sen on todettu olevan itsenäinen ennustetekijä munasarjasyövässä (Yokoyama 2003). Imusuonituksen ennusteellisesta merkityksestä munasarjasyövässä on näyttöä joissakin tutkimuksissa, LVD:n on havaittu olevan merkittävä ennustetekijä taudin etenemisen ja eloonjäännin suhteen (Li 2009, Sundar 2006). Toisaalta erään tutkimuksen mukaan imusuonten muodostumisella ei havaittu vaikutusta munasarjasyövän kehityksessä (Birner 2000).

18 4. HYALURONAANI Hyaluronaani on solujen pinnalla valmistettava, soluvälitilassa esiintyvä pitkäketjuinen sokerimolekyyli. Sillä on tärkeä rooli kudosten toiminnassa, ja sitä esiintyy lähes kaikissa kudoksissa. Hyaluronaanilla on suuri merkitys syövän biologiassa. Useissa syövissä hyaluronaania kertyy syöpäkudokseen, jossa se muokkaa solunsisäisiä viestireittejä, lisäten syöpäsolujen jakautumista, liikkuvuutta ja tunkeutumista ympäröivään kudokseen (Sironen 2010). Hyaluronaanin on todettu suojaavan syöpäsoluja ja tekevän ne vastustuskykyisemmiksi elimistön immuunipuolustukselle sekä syöpälääkkeille, ja sen hajoamistuotteiden on havaittu edistävän syövän kasvulle välttämätöntä verisuonten kasvua (Kultti 2009). Hyaluronaanin tärkeydestä syövän kasvussa ja metastasoinnissa on saatu näyttöä useissa kokeellisissa ja kliinisissä tutkimuksissa, ja korkealla hyaluronaanipitoisuudella on todettu yhteys kasvaimen huonoon erilaistumiseen ja aggressiivisuuteen (Sironen 2010). Aggressiivisimmissa munasarjasyövissä hyaluronaanin määrän on havaittu lisääntyvän jopa satakertaiseksi (Kultti 2009), ja korkeaa hyaluronaanitasoa voidaan pitää itsenäisenä ennustetekijänä munasarjasyövässä, jolloin se on yhteydessä potilaan huonoon ennusteeseen. Hyaluronaania voidaankin pitää yhtenä mahdollisena kohteena syöpähoitojen kehittelyssä (Anttila 2000).

19 5. TUTKIMUSMATERIAALI JA -MENETELMÄT 5.1. Tutkimusmateriaali Tutkimusmateriaalina oli 83 munasarjasyöpäpotilaan immunohistokemiallisesti värjätyt kasvainnäytteet. Näytteet edustivat epiteliaalista munasarjasyöpää, ja ne ovat peräisin Kuopion yliopistollisen sairaalan ja Keski-Suomen keskussairaalan potilaista. Tarkemmat tiedot tutkimusmateriaalista ovat taulukossa 3. Muuttuja N (%) Ikä (mediaani) 62 Histologinen tyyppi seroosi 28 (33,7) musinoosi 11 (13,3) endometrioidi 26 (31,3) kirkassoluinen 7 (8,4) muu epiteliaalinen 11 (13,3) Gradus 1 12 (14,5) 2 35 (42,2) 3 36 (43,4) Levinneisyys I 20 (24,1) II 13 (15,7) III 38 (45,8) IV 12 (14,5) Jäännöskasvain ei 30 (36,1) < 2cm 18 (21,7) >2cm 31 (37,3) Residivointi ei 31 (37,3) kyllä 12 (14,5) Tilanne seurannan lopussa kuollut munasarjasyöpään 44 (53,0)

20 kuollut muuhun syyhyn 6 (7,2) elossa 33 (39,8) TAULUKKO 3. Potilasmateriaali jaoteltuna kliinispatologisten muuttujien mukaan 5.2 Immunohistokemia 5.2.1 D2-40 Formaliinilla kiinnitetyille ja parafiiniin valetuille kudosleikkeille tehtiin immunohistokemiallinen värjäys kaupallisella monoklonaalisella vasta-aineella, D2-40 (DakoCytomation), jonka on tutkittu luotettavasti tunnistavan ja sitoutuvan imusuonten endoteeliin. Värjäyksessä käytettiin Vectastain Elite ABC (Vector Laboratories Inc) -kittiä. Immunoperoksidaasivärjäyksessä kiinnitettiin aluksi primäärivasta-aine (D2-40) näytteessä olevaan antigeeniin, minkä jälkeen lisättiin biotinyloitu sekundäärivasta-aine, joka kiinnittyi primäärivasta-aineeseen. Tämän jälkeen sekundäärivasta-aineessa olevaan biotiiniin kiinnitettiin avidiini-biotinyloitu entsyymikompleksi ja lopuksi lisättiin substraattikromogeeni, joka reagoi entsyymin kanssa muodostaen näkyvän värireaktion. 5.2.2 Hyaluronaani Biotinyloitu hyaluronaanikompleksin kiinnittymisalue aggrekaaniin ja sidosproteiini (bhabc) valmistettiin naudan nivelrustosta ja testattiin puhtauden suhteen. Jaksot deparafinoitiin ksyleenissä, rehydroitiin moniarvoisilla alkoholeilla ja pestiin 0,1 M natriumfosfaattipuskurilla (ph 7,4). Endogeeninen peroksidaasi inaktivoitiin yksiprosenttisella vetyperoksidilla 5 minuutin ajan ja epäspesifi sitoutuminen estettiin yksiprosenttisella naudan seerumin albumiinilla natriumfosfaattipuskurissa. Jaksot inkuboitiin sidosproteiinissa (bhabc; 2.5 µg/ml, laimennettu yksiprosenttisessa naudan seerumin albumiinissa) yön yli 4 C:n lämpötilassa. Näytelasit pestiin puskuriliuoksessa ja inkuboitiin avidiini-biotiiniperoksidaasissa (ABC, Vectastain Elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) sekä pestiin puskuriliuoksella. Näytteet värjättiin 0,05-prosenttisella diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla (DAB Sigma, St. Louis, MO, USA) ja 0,03-prosenttisella vetyperoksidilla puskuriliuoksessa. Näytelasit vastavärjättiin Mayersin hematoksyliinillä 2 minuutin ajan, pestiin, dehydroitiin ja kiinnitettiin Depexissä (BDH Poole, UK). Värjäyksen spesifisyys kontrolloitiin pilkkomalla osa jaksoista ennen värjäystä Streptomyces-hyaluronidaasilla

21 proteaasi-inhibiittorien läsnäollessa tai blokkaamalla bhabc-koetin preinkuboimalla hyaluronaanioligosakkarideilla. 5.3. Värjäyksen tulkinta Imusuonivärjäyksen tulkinnassa laskentamenetelmänä oli koko kudosnäytteen seulonta kvantitoiden D2-40-värjätyt imusuonet valomikroskoopilla 100x (10x okulaari ja 10x linssi) -suurennoksella. Mikroskopoidessa havainnoitiin lisäksi imusuonituksen paikantuminen kasvaimen sisälle (intratumoraalisesti), reuna-alueelle (peritumoraalisesti) tai molempiin.

22 6. TULOKSET Tulosten analysoinnissa käytettiin SPSS-tilasto-ohjelmaa, jonka avulla oli tarkoitus selvittää, löytyykö imusuonten lukumäärän (LVD) ja kliinispatologisten muuttujien (levinneisyysaste, erilaistumisaste, syöpätyyppi, hyaluronaanipositiivisuus, tautikuolleisuus) korrelaatiota. Tutkittuja histologisia näytteitä oli 83, joissa imusuonten absoluuttinen lukumäärä vaihteli välillä 0 585, mediaanin ollessa 75 (kuva 4). Imusuonia oli todettavissa 70 näytteessä, ja suurimmassa osassa ne sijaitsivat pääosin peritumoraalisesti (82,9 prosenttia näytteistä), 7,1 prosentissa imusuonet sijaitsivat lähinnä intratumoraalisesti ja lopuissa 10 prosentissa imusuonitusta havaittiin molemmissa yhtä lailla. Tässä tutkimuksessa ei tullut esille tilastollista merkitsevyyttä yllä mainittujen muuttujien osalta. Imusuonten lukumäärän ei todettu korreloivan munasarjasyövän erilaistumisasteeseen (kuva 5), levinneisyysasteeseen (kuva 6) tai syöpätyyppiin (kuva 7). LVD:n mediaanin mukaan korrelaatiota ei tullut esille tautikuolleisuudessa (kuva 8), mutta runsas imusuonitus oli kuitenkin viitteellinen lyhyemmän tautivapaan ajan suhteen (kuva 9). Hyaluronaaniekspression ja LVD:n välillä ei myöskään todettu korrelaatiota syöpäsolujen epiteelissä eikä stroomassa.

23 KUVA 4. Imusuonten lukumäärän jakauma KUVA 5. Imusuonten lukumäärä syövän erilaistumisasteen mukaan, p=ns, Kruskall Wallis-testi

24 KUVA 6. Imusuonten lukumäärä levinneisyysasteen mukaan, p=ns, Kruskall Wallis-testi KUVA 7. Imusuonten lukumäärä syöpätyypin mukaan, p=ns, Kruskall Wallis-testi KUVA 8. Tautikuolleisuuden ennuste kymmenen vuoden seurannassa LVD:n perusteella, p=0.5 Kaplan Meier-testi

KUVA 9. Tautivapaan ajan ennuste kymmenen vuoden seurannassa LVD:n perusteella. p=0.6, Kaplan Meier-testi 25

26 7. POHDINTA Tässä tutkimuksessa ei voitu havaita merkittävää yhteyttä LVD:n ja kliinispatologisten muuttujien välillä. LVD ei myöskään korreloinut tautikuolleisuuteen, mutta runsas imusuonitus oli kuitenkin viitteellinen lyhyemmän tautivapaan ajan suhteen. Munasarjasyövän leviäminen tapahtuu suurelta osin hilseilynä vatsaonteloon, ja tästäkin johtuen imusuonten kautta leviämisen merkityksestä on ollut hankalaa tehdä johtopäätöksiä. Laajemmat tutkimukset alkuvaiheen syövistä selventäisivät LVD:n ennustearvoa, ja sitä, voisiko LVD:n määrittämisestä olla hyötyä harkittaessa, ketkä potilaista tarvitsevat solunsalpaajahoitoja (Sundar 2006). Kuitenkin toistaiseksi löytyy vain harvoja julkaistuja tutkimuksia uudisimusuonituksen merkityksestä munasarjasyövässä. Viime vuosien aikana imusuonten uudiskasvun säätelyä on tutkittu runsaasti ja tämä on lisännyt huomattavasti tietämystä imusuonten merkityksestä tautiprosesseissa, kuten syövän metastasoinnissa (Thiele ja Sleeman 2006). Imusuonispesifisten reseptorimarkkereiden ja säätelymolekyylien löytyminen on parantanut mahdollisuuksia tutkia imusuonituksen merkitystä syövissä (Tammela ja Alitalo 2010). Tämä tietenkin avaa lupaavat näkymät jatkotutkimukselle ja uusien imusuonten kasvua ja näin ollen metastasointia estävien hoitokeinojen kehittämiselle. Syövän aikaansaaman uudisimusuonituksen ja sen merkitykseen liittyvä tutkimus on vasta aluillaan, ja tärkeitä kysymyksiä tutkimukselle tulevaisuudessa onkin monia. Tärkeä tutkimuskohde olisi selvittää, mikä on uudisimusuonituksen ja imusolmukemetastasoinnin merkitys laajemmalle metastasoinnille muihin elimiin. Oleellista on myös tutkia, mikä on saavutettavissa oleva hyöty ja tehokkuus syövän hallinnassa kehitettäessä menetelmiä, jotka estävät uudisimusuonten muodostumista (Thiele ja Sleeman 2006). LVD:n merkityksellisyyden suhteen tutkimustuloksissa on ollut paljon ristiriitaisuuksia, minkä on ajateltu johtuvan standardisoitujen menetelmien puutteesta immunohistokemiallisten värjäysten ja imusuonituksen arvioinnissa. Toimenpiteitä menetelmien yhdenmukaistamiseksi on kuitenkin ehdotettu 2006 julkaistussa katsausartikkelissa (Van der Auwera 2006).

27 Tässä työssä käytetty imusuonten laskentatapa oli yksinkertainen ja helppo suorittaa. Laskentatapaa voi kritisoida siitä, ettei se ottanut huomioon histologisen näytteen pinta-alaa, vaan jokainen näyte seulottiin kvantitoiden kokonaisuudessaan. Tämän menetelmän ongelmana on myös se, että laskentatulos riippuu mikroskopoijan perehtyneisyydestä ja kokemuksesta tunnistaa yksittäiset imusuonet. Usein tarvitaan vähintään kaksi mikroskopoijaa, jotta yksilökohtainen "kädenjälki" voitaisiin häivyttää. Imusuonten kvantitointi on ollut yleisimmin käytetty laskentatapa LVD:n määrittämiseksi, mutta muitakin menetelmiä on kehitetty, esimerkkinä Chalkleyn laskenta, jossa käytetään erillistä mikroskooppiin asennettavaa seulaa. Siinä on 25 satunnaisesti sijoitettua täplää, ja sijoittamalla ne runsaasti imusuonitusta sisältäville alueille (hot spot), voidaan arvioida imusuonituksen tiheyttä. Yksittäisten imusuonten laskemisen sijaan tässä menetelmässä lasketaan täplien maksimaalinen määrä. Menetelmä on mahdollisesti objektiivisempi, mutta se on edelleen riippuvainen mikroskopoijan tekemästä valinnasta (hot spot) (Van der Auwera 2006). Imusuonituksen uudismuodostuksen mekanismien ymmärtäminen voisi osoittautua hyödylliseksi syövän adjuvanttihoidoissa, joiden tavoitteena on estää syöpäkasvaimen kasvu tai uusien kasvainten ilmaantuminen (Van der Auwera 2006). Tulevaisuuden toiveena on saada käyttöön hoitokeinoja, joiden tavoitteena on vähentää ennenaikaisia syöpäkuolemia. Imusuoniin liittyvä tutkimustyö on kuitenkin vasta alussa, ja moniin kysymyksiin on vielä löydettävä ratkaisuja, ennen kuin tutkimustietoa päästään soveltamaan syöpäpotilaiden hoitoon.

28 LÄHTEET Achen MG, McColl BK, Stacker SA. Focus on lymphangiogenesis in tumor metastasis. Cancer Cell 2005;7:121 7 Alitalo K, Tammela T, Petrova TV. Lymphangiogenesis in development and human disease. Nature 2005;438:946-53 Al-Rawi, MAA, Jiang, WG. Lymphangiogenesis and cancer metastasis. Frontiers in Bioscience 2011;16:723-39 Al-Rawi MAA, Mansel RE, Jiang WG. Molecular and cellular mechanisms of lymphangiogenesis. European Journal of Surgical Oncology 2005;31:117-21 Anttila MA, Tammi RH, Tammi MI, Syrjänen KJ, Saarikoski SV, Kosma VM. High levels of stromal hyaluronan predict poor disease outcome in epithelial ovarian cancer. Cancer Research 2000;60:150-155 Armstrong DK, Bundy B, Wenzel L. Huang HQ, Baergen R, Lele S, Copeland LJ, Walker JL, Burger RA. Intraperitoneal cisplatin and paclitaxel in ovarian cancer. New England Journal of Medicine 2006;354:34-43 Benedet JL, Bender H, Jones H, Ngan HY, Pecorelli S. FIGO staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers. FIGO Committee on Gynecologic Oncology. International Journal of Gynaecology & Obstetrics 2000; 70(2): 209-62 Beral V, Bull D, Green J, Reeves G. Ovarian cancer and hormone replacement therapy in the Million Women Study. Lancet 2007;369:1703-10. Bhoola S, Hoskins WJ. Diagnosis and management of epithelial ovarian cancer. Obstetrics & Gynecology 2006;107(6): 1399-410 Birner P, Schindl M, Obermair A, Plank C, Breitenecker G, Kowalski H, Oberhuber G. Lymphatic microvessel density in epithelial ovarian cancer: its impact on prognosis. Anticancer Research 2000;20(5):2981-5 Bristow RE, Tomacruz RS, Armstrong DK, Trimble EL, Montz FJ. Survival effect of maximal cytoreductive surgery for advanced ovarian carcinoma during the platinum era: a meta-analysis. Journal of Clinical Oncology 2002;20:1248-59. Cannistra SA. Cancer of the ovary. New England Journal of Medicine 2004;351: 2519-29 Cannistra SA, Matulonis UA, Penson RT, Hambleton J, Dupont J, Mackey H, Douglas J, Burger RA, Armstrong D, Wenham R, McGuire W. Phase II study of bevacizumab in patients with platinum-resistant ovarian cancer or peritoneal serous cancer. Journal of Clinical Oncology 2007;25(33):5180-6 Crawford SC, Vasey PA, Paul J, Hay A, Davis JA, Kaye SB. Does aggressive surgery only benefit patients with less advanced ovarian cancer? Results from an international comparison within the SCOTROC-1Trial. Journal of Clinical Oncology 2005;23(34):8802-11 Fathalla MF. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia? Lancet 1971; (2): 163. Gabra H. Epithelial ovarian cancer. Kirjassa Dewhurst s Textbook of obstetrics and gynaecology [elektroninen aineisto]/(seitsemäs painos)toim. Edmonds DK. Lontoo: Blackwell publishing 2007, s.625-34 Garcia AA, Hirte H, Fleming G, Yang D, Tsao-Wei DD, Roman L, Groshen S, Swenson S, Markland F, Gandara D, Scudder S, Morgan R, Chen H, Lenz HJ, Oza AM. Phase II clinical trial of bevacizumab and

29 low-dose metronomic oral cyclophosphamide in recurrent ovarian cancer: a trial of the California, Chicago, and Princess Margaret Hospital phase II consortia. Journal of Clinical Oncology 2008;26(1):76-82 Green A, Purdie D, Bain C, Siskind V, Russell P, Quinn M, Ward B. Tubal sterilization, hysterectomy and decreased risk of ovarian cancer. Survey of Women s Health Study Group. International Journal of Cancer 1997;71:948-51 He Y, Rajantie I, Pajusola K, Jeltsch M, Holopainen T, Ylä-Herttuala S, Harding T, Jooss K, Takahashi T, Alitalo K.Vascular endothelial cell growth factor receptor 3-mediated activation of lymphatic endothelium is crucial for tumorcell entry and spread via lymphatic vessels. Cancer Research 2005;65:4739-46 Heintz AP, Odicino F, Maisonneuve P, Quinn MA, Benedet JL, Creasman W T, Ngan HY, Pecorelli S, Beller U. Carcinoma of the ovary. FIGO 6th Annual Report on the Results of Treatment in Gynecological Cancer. International Journal of Gynaecology & Obstetrics 2006;95(1): S161-S92 Hennessy BT, Coleman RL, Markman M. Ovarian cancer. Lancet 2009;374:1371-82 Jensen A, Sharif H, Frederiksen K, Kjaer SK. Use of fertility drugs and risk of ovarian cancer: Danish Population Based Cohort Study. British Medical Journal 2009;338:b249 Ji RC. Lymphatic endothelial cells, tumor lymphangiogenesis and metastasis: New insights into intratumoral and peritumoral lymphatics. Cancer and Metastasis Reviews 2006;25:677-94 Kayzas PA, Gellef S, Batistatou A, Agnantis NJ, Stefanou D. Evidence for lymphangiogenesis and its prognostic implications in head and neck squamous cell carcinoma. Journal of Pathology 2005;206:170-177 Kikuchi Y, Kita T, Takano M, Kudoh K, Yamamoto K. Treatment options in the management of ovariancancer. Expert Opinion on Pharmacotherapy 2005;6(5):743-54 Kitadai Y, Kodama M, Cho S, Kuroda T, Ochiumi T, Kimura S, Tanaka S, Matsumura S, Yasui W, Chayama K. Quantitative analysis of lymphangiogenic markers for predicting metastasis of human gastric carcinoma to lymph nodes. International Journal of Cancer 2005;115(3):388-92 Kultti A. Hyaluronan in cancer : regulation and consequences of hyaluronan biosynthesis. Kuopion yliopiston julkaisuja. D. Lääketiede 2009, no. 470 Leminen A, Lehtovirta P. Munasarja-ja munanjohdinkasvaimet. Kirjassa Ylikorkala O, Kauppila A, toim. Naistentaudit ja synnytykset. Keuruu: Kustannus Oy Duodecim 2006, s.239-256 Li L, Liu B, Li X, Yang S, Xiao J, Chen M, Zhang Y, Ma J. Vascular endothelial growth factor D and intratumoral lymphatics as independent prognostic factors in epithelial ovarian carcinoma. The Anatomical Record 2009;292: 562-9 Markman M, Rothman R, Hakes T, Reichman B, Hoskins W, Rubin S, Jones W, Almadrones L, Lewis, JL. Second-line platinum therapy in patients with ovarian cancer previously treated with cisplatin. Journal of Clinical Oncology 1991;9:389-93 Matsumoto K, Nakayama Y, Inoue Y, Minagawa N, Katsuki T, Shibao K, Tsurudome Y, Hirata K, Nagata N, Itoh H. Lymphatic microvessel density is an independent prognostic factor in colorectal cancer. Diseases of the Colon & Rectum 2007;50(3):308-14 Munasarjasyöpä (online). Käypä hoito -suositus. Suomalaisen Lääkäriseuran Duodecimin ja Suomen Gynekologiyhdistyksen asettama työryhmä. Helsinki: Suomalainen Lääkäriseura Duodecim, 2007 (viitattu 23.3.2011). Saatavilla Internetissä: www.kaypahoito.fi Nakamura Y, Yasuoka H, Tsujimoto M Imabun S, Nakahara M, Nakao K, Nakamura M, Mori I, Kakudo K. Lymph vessel density correlates with nodal status, VEGF-C expression, and prognosis in breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment 2005;91(2):125-32

30 Nishida N, Yano H, Komai K, Nishida T, Kamura T, Kojiro M. Vascular endothelial growth factor C and vascular endothelial growth factor receptor 2 are related closely to the prognosis of patients with ovarian carcinoma. Cancer 2004;101:1364-74 Padera TP, Kadambi A, di Tomaso E, Carreira CM, Brown EB, Boucher Y, Choi NC, Mathisen D, Wain J, Mark EJ, Munn LL, Jain RK. Lymphatic metastasis in the absence of functional intratumor lymphatics. Science 2002;296:1883-6 Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global Cancer Statistics, 2002. CA Cancer Journal for Clinicians 2005;55:74-108 Saharinen P, Tammela T, Karkkainen M J, Alitalo K. Lymphatic vasculature: development, molecular regulation and role in tumor metastasis and inflammation. Trends in Immunology 2004;25:387-395 Schoppmann SF, Horvat R, Birner P. Lymphatic vessels and lymphangiogenesis in female cancer: mechanisms, clinical impact and possible implications for anti-lymphangiogenic therapies. Oncology Reports 2002;9(3):455-60 Sironen RK, Tammi M, Tammi R, Auvinen PK, Anttila M,. Kosma VM. Hyaluronan in human malignancies. Experimental Cell Research 2011;317:383 91 Sundar SS, Ganesan TS. Role of lymphangiogenesis in cancer. Journal of Clinical Oncology 2007;25:4298-307 Tammela T, Petrova TV, Alitalo K. Molecular lymphangiogenesis: new players. Trends in Cell Biology 2005;15:434-41 Tammela T, Alitalo K. Lymphangiogenesis: Molecular mechanisms and future promise. Cell 2010;140: 460-476. Tammela T, Saaristo A, Lohela M, Morisada T, Tornberg J, Norrmen C, Oike Y, Pajusola K, Thurston G, Suda T. Angiopoietin-1 promotes lymphatic sprouting and hyperplasia. Blood 2005;105:4642 48 (b) Van der Auwera I, Cao Y, Tille JC, Pepper MS, Jackson DG, Fox SB, Harris AL, Dirix LY, Vermeulen PB. First international consensus on the methodology of lymphangiogenesis quantification in solid human tumours. British Journal of Cancer 2006;95(12):1611-25 Whittemore AS, Harris R, Itnyre J. Characteristics relating to ovarian cancer risk: collaborative analysis of 12 US case-control studies. II. Invasive epithelial ovarian cancers in white women. Collaborative Ovarian Cancer Group. American Journal of Epidemiology 1992;136:1184-203 www.cancerregistry.fi (luettu 17.3.2011) Yokoyama Y, Charnock-Jones DS, Licence D, Yanaihara A, Hastings JM, Holland CM, Emoto M, Umemoto M, Sakamoto T, Sato S, Mizunuma H, Smith SK. Vascular endothelial growth factor-d is an independent prognostic factor in epithelial ovarian carcinoma. British Journal of Cancer 2003;88:237-44