PCR syöpädiagnostiikassa ja seurannassa -tekniikka ja sovellutuksia Veli Kairisto Kl. kemian ja lab.hematologian el. oyl., dos. Tyks-Sapa, Tykslab
Polymeraasiketjureaktio (PCR)
Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (RQ-PCR)
100% 25%
10 9 10 8 10 7 10 6 10 5 10 4 1000 100 10 1
10 5 10 4 1000 100 10 1
10% 1% 0,1% 0,01%
Kvantitatiiviseen PCR:ään liittyvät käsitteet Leukemia 2007;21:604
EuroMRD:n ASO-qPCR tulkintakonsensus Standard curve: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 dilutions in DNA from normal PB MNC (mixture of at least 5 healthy controls) in at least duplicate. Slope between 3.1 and 3.9 and corr.coefficient > 0.98 At least 250 ng DNA and maximally 1.0 µg of DNA in each PCR tube we use 500 ng which corresponds to 80.000 cells. Triplicate analysis evaluates ~240.000 cells Quantitative range: lowest dilution, that gives reproducible amplification Ct replicates < 1.5 Has the lowest Ct > 3 lower than lowest Ct of the background signal Sensitivity lowest dilution, that has at least one well positive ( CT replicates not relevant) Has the lowest Ct > 1 lower than the lowest Ct of the background signal Leukemia 2007;21:604
EuroMRD perustettu 2001, nykyisin 57 osallistujalaboratoriota www.euromrd.org
Kontrolli- housekeeping geeni nukleiinihappojen degradoituminen ja ja PCR-inhibiittorien määrä vaihtelee näytekohtaisesti niin paljon, että sisäisen PCR-kontrollin käyttö on välttämätöntä keskenään vertailukelpoisten RQ-PCRtulosten saamiseksi tulos korjataan fuusiogeenin ja kontrolligeenin tai sen RNAtranskriptien välisen suhteen avulla olettaen, että kontrolligeenin ekspressio on vakio; näin tuotettu tulos riippuu yhtä paljon fuusiogeenin ekspressiosta kuin kontrolligeenin ekspressiosta Eu-Biomed EAC (Europe against Cancer) projektin monikeskusvertailun perusteella suosittelemat RNAkontrollitranskriptit: ABL, GUS ja B2M DNA-pohjaisessa molekyylihematologisessa analytiikassa käytetyin kontrolligeeni on albumiinigeeni
Housekeeping-geeni kandidaatteja molekyylihematologiaan Leukemia 2003:17; 2474
Leukemia 2003:17; 2474
Molekyylihematologisen jäännöstautianalytiikan edellytykset merkittävä tauti-infiltraatio tai tautisolujen nukleiinihappojen vapautuminen vereen, luuytimeen tai muuhun tilaan, mistä toistuva näytteenotto on mahdollista periaatteessa mitä tahansa pahanlaatuiselle kloonille spesifinen mutaatio tai geenin uudelleenjärjestymä käy molekulaariseksi markkeriksi molekulaariseen jäännöstautianalytiikkaan soveltuvien markkereiden esiintyvyys eri pahanlaatuisissa hematologisissa taudeissa: - AML (>60%) - ALL (>95%) - KML (~100%) - krooniset myeloproliferatiiviset taudit ( >60%) - KLL, myelooma (~90%) - Manttelisolulymfooma, Follikulaarinen lymfooma (~90%)
Luuydinnäytteestä tehtävien jäännöstautianalyysien laatu on kriittisesti riippuvainen luuydinnäytteen laadusta perifeerisen veren käyttökelpoisuus jäännöstautianalyysiin riippuu taudista KML: ei merkittävää tasoeroa veren ja luuytimen välillä T-ALL: 1-10 kertaa suurempi jäännöstautiosuus luuytimestä AML, precursor B-ALL: 1-1000 kertaa suurempi jäännöstautiosuus luuytimestä optimaalinen näyte: vähintään 2 miljoonaa luuytimen solua ensimmäinen aspiraatio punktiokohdasta, toiseen aspiraation tulee merkittävästi verta volyymi tulee olla välillä 2 ml 5 ml, ei yli >5 ml, sillä merkittävä laimeneminen verellä solusaaliin tulisi olla vähintään 2 miljoonaa mononukleaarista luuytimen solua saavutettavissa oleva herkkyys riippuu tutkitun DNA:n määrästä 2 milj. solua sisältää noin 13 ug DNA:ta hyvän eristysmenetelmän saanto n. 50%: 6 ug DNA:ta yhdessä qpcr-reaktiossa tutkitaan 0,5 ug DNA:ta, mikä vastaa noin 80 000 solua spesifisesti toimivat alukkeet ja koetin tunnistavat yhden tautisolun DNA:n rutiinisti tehtävällä kolmella rinnakkaisreaktiolla tulee tutkituksi 240 000 solun DNA:n, joten herkkyys 1 / 240 000 = 4E-6 = 0,0004%
Fuusiogeenit, kuten ALL:n tai KML:n BCR-ABL, osoitetaan lähetti-rna:sta
Leukemia 2003:17;2318
reference mrna BCR-ABL mrna MRD by qpcr: 25% MRD by qpcr: 25%
10 12 KML-jäännöstauti keskimääräinen tilanne dg-vaiheessa International Scale 100% KML-tautisolujen määrä elimistössä 10 11 10 10 sytogeneettinen vaste täydellinen sytogeneettinen vaste 10 9 merkittävä molekulaarinen vaste (MMR) 10 8 10 7 10 6 molekulaarinen vaste (MR4) molekulaarinen vaste (MR4.5) molekulaarinen vaste (MR5) PCR-negatiivinen, jäännöstautia ei osoitettavissa 10% 1% 0,1% 0,01% 0,003% 0,001% 0,0001% KML jäännöstauti IS-asteikolla
AML:n molekulaarinen diagnoosi Jos positiivinen, käytetään MRD-markkerina AML1-ETO - fuusio; t(8;21) Lisätutkimuksena C-KIT-geenin eksonin 17 sekvensointi Fuusiogeeniseulonta positiivinen CBFB-MYH11 fuusio; inv(16), t(16;16) PML-RARA; t(15;17) Aina diagnoosivaiheessa: Fuusiogeeniseulonta Bm-Fuus-mR ja ennusteellisena tutkimuksena FLT3-geenin mutaatiohaku Bm-FLT3-D ============================== Dg-vaiheessa riittävä näytemäärä tärkeä! 2 x 4 ml luuydintä ja sytopenisellä potilaalla myös 8 ml verta CPT-putkiin =============================== Fuusiogeeniseulonta negatiivinen BCR-ABL; t(9;22) NPM1-geenin valtamutaatiot Bm-NPM1-D jos neg. 1. 2. 3. 3. AML:n jatkofuusiogeeniseulonta MLL-MLLT3; t(9;11), DEK-NUP214; t(6;9), NUP98-NSD1; t(5;11) FLT3-tutkimus positiivinen (käytetään MRD-markkerina, jollei muita mutaatioita) CEBPA-geenin mutaatiotutkimus (tehdään, jollei muita mutaatiolöydöksiä)
ALL:n jäännöstautianalytiikka useaan ALL:n alatyyppiin liittyvä spesifinen fuusiogeeni mahdollistaa herkän jäännöstautianalytiikan - BCR-ABL t(9;22) (ALL-aikuisista n. 30%, ALL-lapsista n. 5%) TEL-AML1 t(12;21) (ALL-aikuisista n. 1%, ALL-lapsista n. 30%) E2A-PBX1 t(1;19) (ALL-aikuisista n. 3%, ALL-lapsista n. 6%) MLL-AF4 t(4;11) (ALL-aikuisista n. 6%, ALL-lapsista n. 2%) SIL-TAL1 del(1) (ALL-aikuisista n. 1%, ALL-lapsista n. 1%) IgH- ja/tai TCR- antigeenireseptorigeenit ovat uudelleenjärjestyneitä yli 95%:lla ALL-potilaista, jonka vuoksi on mahdollista konstruoida kloonispesifinen qpcr-jäännöstautianalyysi (ASO-PCR) lähes kaikille ALL-potilaille (ASO=alleelispesifinen oligonukleotidi) IgH uudelleenjärjestymä-pcr:ssä konsensusalukkeilla herkkyys n. 1-5% Kvantitatiivisen ASO-PCR:n herkkyys parhaimmillaan 1/240 000 = 0,0004%
Immunoglobuliinigeenin klonaalisen uudelleenjärjestymän hyödyntäminen kloonispesifisen ASO-analyysin suunnittelussa Blood 2015;26:3996
Immunoglobuliinigeenin klonaalisen uudelleenjärjestymän hyödyntäminen kloonispesifisen ASO-analyysin suunnittelussa konsensusaluke ASO-aluke konsensus TaqMan-koetin
ALL:n jäännöstaudin tason muuttuminen eri tapauksissa JJM van Dongen et al. Hematology 2002 (1): 177
ALL:n jäännöstaudin tason muuttuminen eri tapauksissa JJM van Dongen et al. Hematology 2002 (1): 177
Myelooman jäännöstaudin tason muuttuminen eri tapauksissa Leukemia 2013:e1 7
Molekulaarinen jäännöstautianalytiikka manttelisolulymfoomassa ja follikulaarisessa lymfoomassa - referenssinäytteeksi mieluiten imusolmukenäyte, mutta luuydin/veri käy myös, mikäli korkea infiltraatioaste - ilman referenssinäytettä molekulaarinen analytiikka ei ole mielekästä - riittävän herkällä menetelmällä (ASO-PCR) follikulaarisen lymfooman tautisoluja on diagnoosivaiheessa lähes aina osoitettavissa sekä verestä että luuytimestä riippumatta siitä, onko luuytimessä histologisesti tauti-infiltraatiota - EuroMRD -konsortiossa toimii lymfoomaryhmä, jonka toimesta analytiikka standardoitu, laaduntarkkailukierrokset kahdesti vuodessa - analytiikan mahdollinen indikaatio jäännöstautituloksen perusteella ohjautuva ylläpitohoito
NGS:llä todettujen mutaatioiden hyödyntäminen RQ-PCR -kohteina seuraavan sukupolven (syväsekvensointi, massiivinen rinnakkaissekvensointi) sekvensoinnilla voidaan tutkia sekä DNA:ta että RNA:ta nukleiinihappojen huomattavakaan pilkkoutuminen, kuten formaliinifiksoiduissa paraffiniblokeissa (FFPE) ei merkittävästi heikennä analytiikan laatua Tykslabissa toistaiseksi kokemusta 54 geenin myeloisten veritautien DNA-paneelista sekä laajasti syöpädiagnostiikkaan suuntautuvasta 1385 geenin RNA-paneelista (Illumina)
Pan-cancer RNA-panel (Illumina)
NGS Pan-Cancer RNA Hematologisen validointisarjan fuusiogeenipositiiviset näytteet
NGS Pan-Cancer RNA Pehmytkudostuumori validointisarjan fuusiogeenipositiiviset näytteet
NGS Pan-Cancer RNA Pehmytkudostuumori validointisarjan fuusiogeenipositiiviset näytteet
Potilastapaus (2014) Nuori aikuinen, jolla sattumalöydöksenä mahan limakalvoon kiinnittyvä kookas tuumori 2016, tri Katri Kivinen
GIST vai joku muu? Immunohistokemiallisesti: Positiivisia CD117, CD56, CD99, pan-ck Negatiivisia CD34, CD45, CD79, kromograniinia, CK20, CK7, desmiini, DOG-1, EMA, melanosyytti-pan, Myf-4, S-100, SMA, synaptofysiini,ttf-1 GIST-mutaatiotesti: KIT-eksonit 9, 11, 13 ja 17 sekä PDGFRA eksonit 12, 14 ja 18 sekvensoitu eikä mutaatiota todettu FISH: EWSR1-FISH positiivinen 2016, tri Katri Kivinen
EWSR1-translokaation omaavia tauteja Myxoid/round cell liposarcoma (EWSR1-DDIT3) Angiomatoid fibrous histiocytoma (EWSR1-CREB1/ATF1) Myoepithelioma/myoepithelial carcinoma/mixed tumor (EWSR1-PBX1/POU5F1/ZNF444) Clear cell sarcoma of soft tissue (EWSR1-ATF1/CREB1) Extra-skeletal myxoid chondrosarcoma (EWSR1-NR4A3) Extra-skeletal Ewing Sarcoma (EWSR1-FLI1/ERG/ETV1/EIAF/FEV) Desmoplastic small round cell tumor (EWSR1-WT1) DG: Malignant neoplasm (High grade small roundcell tumour of Ewing family) 2016, tri Katri Kivinen
Potilastapauksemme (Pan-Cancer RNA fusion call) DG: Extra-skeletal Ewing Sarcoma (EWSR1- FLI1/ERG/ETV1/EIAF/FEV) -Ewing-perheen kasvaimet: PNET, periferinen neuroepiteliooma, Askinin tuumori, aikuisten neuroblastooma, periferinen neuroblastooma, primitiivinen neuroektodermaalinen tuumori, Ewingin sarkooma -Erotusdg: neuroblastooma, rabdomyosarkooma, pienisoluinen osteosarkooma, lymfooma 2016, tri Katri Kivinen
RQ-PCR:n sovelluksia Ewingin sarkoomassa Sarcoma 2012: ID 780129
KIITOS Kiitos!