Virtaussytometrian perusteet 11.2.2016 Sorella Ilveskero LT, erikoislääkäri
Virtaussytometrian perusteet ja käyttö kliinisessä laboratoriossa virtaussytometrian periaate virtaussytometrinen immunofenotyypitys akuuteissa leukemioissa kroonisissa lymfoproliferatiivisissa taudeissa plasmasolutaudeissa jäännöstautianalytiikka
VIRTAUSSYTOMETRIA Menetelmä, jossa fluoresoivalla aineella merkittyihin soluihin (tai muihin partikkeleihin) kohdistetaan lasersäde ja mitataan solujen siroamaa valoa ja virittyneen merkkiaineen lähettämää valoa. Solupopulaatiot voidaan erottaa toisistaan solujen koon, rakenteen ja merkkiaineiden tunnistamien pinta- tai intrasytoplasmisten antigeenien perusteella.
Virtaussytometrinen immunofenotyypitys (valkosolut ja verta muodostavat solut) Solujen ilmentämien antigeenien perusteella määritetään solujen erilaistumislinja ja erilaistumisen aste Solujen rakenteet tunnistetaan monoklonaalisten vasta-aineiden avulla (CD-luokitus, cluster of differentiation) Vasta-aineet on leimattu fluoresoivilla aineilla (esim. PE, FITC, PerCP, APC, PE-Cy7, APC-Cy7) menetelmän etuina mahdollisuus analysoida useita ominaisuuksia yhtä aikaa, nopeus ja suurten solumäärien analysointi diagnostiikassa esim. 50 000 solua jäännöstautianalytiikassa 500 000 1 000 000 solua ongelmina mm. malignien solujen huono aspiroituvuus ja näytteen mahdollinen verikontaminaatio harvoin yksinään diagnostinen
Solususpensio: veri, luuydinaspiraatti, likvor, pleura-/askitesneste, lasiaisneste, suspendoitu kudosnäyte
Solut analysoidaan valon sirontaominaisuuksien ja merkkiaineiden fluoresenssin perusteella. Valon sirontaa mitataan kahdesta eri suunnasta: pienen kulman sironta (Forward Scatter, FSC) kuvaa solun kokoa sivusironta (Side Scatter, SSC) kuvaa solun granulaarisuutta
Valonsirontaa mitataan kahdesta eri suunnasta: pienen kulman sironta (Forward Scatter, FSC) kuvaa solun kokoa sivusironta (Side Scatter, SSC) kuvaa solun granulaarisuutta Granulosyytit Monosyytit Lymfosyytit
Solut analysoidaan valon sirontaominaisuuksien ja merkkiaineiden fluoresenssin perusteella. Solujen ilmentämien antigeenien perusteella määritetään solujen erilaistumislinja ja erilaistumisen aste Solujen rakenteet tunnistetaan monoklonaalisten vasta-aineiden avulla (CD-luokitus, cluster of differentiation) Vasta-aineet on leimattu fluoresoivilla aineilla (esim. PE, FITC, PerCP, APC, PE-Cy7, APC-Cy7)
Fluorokromeja
Värikompensaatio Eri fluorokromien emissiospektrejä
Analysointiohjelma
Solupopulaatiot erotellaan CD45-ilmentymän ja valon sivusironnan (SSC) perusteella: Lymfosyytit Monosyytit Granulopoieesi Erytropoieesi
Lymfosyyttien alaluokat 6% CD19+ B-soluja 26% CD3neg,CD16/56+ NK-soluja 68% CD3+ T-soluja
Akuutin leukemian diagnostiikka Auerin sauva Akuutti promyelosyyttileukemia (APL)
Akuutin leukemian diagnostiikka?
Akuutin leukemian luokittelu immunofenotyypin perusteella (WHO 2008) Akuutti myelooinen leukemia (AML) myelooisia antigeeneja: cympo, CD13, CD33, CD117, CD65 monosyyttilinjan antigeeneja: CD4, CD11b, CD11c, CD14, CD36, CD64, cycd68 erytrooisia antigeeneja: GPA, CD71, CD105, CD36 megakaryoblastien antigeeneja: CD41, CD42, CD61 Akuutti lymfaattinen leukemia (ALL) B-soluinen: CD19 + CD10, CD22, cycd79a T-soluinen: cycd3
Akuutin leukemian luokittelu immunofenotyypin perusteella (WHO 2008) Sekalinjainen akuutti leukemia (MPAL) Myel + B, Myel + T, B + T, Myel + B + T Myel = cympo+ tai monosyyttilinjan antigeenit T = cycd3+ B = CD19+ ja CD10+/CD22+/CD79a+ TAI CD19dim+ ja kaksi em. B-soluantigeeneistä positiivisia Erilaistumaton akuutti leukemia (AUL) Ei ilmennä linjaspesifisisiä antigeenejä: cympo-, cycd3-, CD19-/dim, cycd22-, cycd79a- Ilmentää yleensä varhaisia ei-linjaspesifisiä antigeeneja, esim. CD34, CD38, HLA-DR, ntdt ja mahd. CD45
Akuutin leukemian virtaussytometrinen diagnostiikka erilaistumislinja jäännöstaudin seurantaan sopivat poikkeavuudet ennuste esim. assosiaatio genetiikan poikkeavuuksiin, mm. NG2, CRLF2 hoito
B-solulinjan akuutti lymfoblastileukemia T-solulinjan akuutti lymfoblastileukemia
Akuutti myelooinen leukemia (AML)
Seurantaan sopivat antigeeni-ilmentymät B-ALL CD10++, CD38dim CD123+, CD66c+/- CD45neg/dim T-ALL CD34+ CD1a+ osin ntdt+
Seurantaan sopivat antigeeni-ilmentymät AML CD7+, CD96dim CD38neg/dim CD133neg
ETP-ALL = CD1a-,CD8-,CD5dim + kantasolu tai myelooinen antigeeni positiivisuus Overall survival Lancet Oncology 2009; 10: 147-156
Akuutti B-lymfoblastileukemia: neuroleukemia Li-Leuk 3 x 10E6/l Li-Leuk 92 x 10E6/l Li-Leuk 1 x 10E6/l 85% 15%
Immunofenotyypitys lymfoomissa / kroonisissa lymfoproliferatiivisissa taudeissa Diagnostiikka perustuu pääsääntöisesti histologiseen ja/tai sytologiseen morfologiaan ja immunofenotyyppiin Mikään yksittäinen antigeeni ei ole tautispesifinen Useimmilla B-solutaudeilla on tyypillinen immunofenotyyppi, joka auttaa erotusidagnostiikassa / luokituksessa B-solujen klonaalinen kevytketjuilmentymä pienen luuydininfiltraation toteaminen T- ja NK-solutautien luokituksessa immunofenotyypitys ei ole ollut niin hyödyllinen
B-solulinjan kroonisten lymfoproliferatiivien tautien diagnostiikassa käytettäviä antigeeneja European LeukemiaNet suositus, Leukemia 2011; 25: 567-574 KLL MCL Manttelisolulymfooma FL Follikulaarinen lymfooma DLBCL Suurisoluinen lymfooma Burkitt HCL Karvasolulymfooma HCLv Karvasolulymf. variantti SMZL/SLVL Pernan marginaalivyöhykkeen/ Villoosi lymfooma CD19 + + + +/- + + + + CD22 /- + + + + + + + CD20 + / + + +/(-) + + + +/(-) CD23 + - - -/(+) - - - - CD79b /- + /- + + + + CD5 + + - -/(+) - - - -/(+) CD10 - - + +/- + ± - - CD103 - - - - - + ± -/(+) CD11c -/(+) - - - - + ± ± CD25 -/(+) - - -/(+) - + - ±
B-solujen kevytketjuilmentymä Normaalit kypsät B-solut Lambdaklonaalinen B-solulymfooma
T-solujen klonaliteetti IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit T-solujen TCR Vβ-ketjujen jakauman virtaussytometrinen määritys tarkoitettu verinäytteille tunnistaa 24 eri Vβ-ketjuja (noin 70% kaikista Vβ-ketjuista) 8 putkea (jokaisessa 3 eri Vβ-ketjua) > 1 yhdistetty seulontaputki Normaali, kaikki vasta-aineet samassa putkessa
Klonaalinen T-solupopulaatio CD3+CD5neg T-solut CD3+CD5+ T-solut
Immunofenotyypitys plasmasolutaudeissa Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders Haematologica 2008;93:401
Immunofenotyypitys plasmasolutaudeissa Normaali ja klonaalinen CD38+CD138+ plasmasolupopulaatio
Jäännöstautianalytiikka Menetelmä Herkkyys Morfologia 1/20 Sytogenetiikka, metafaasi 1/20 FISH 1/100-1000 Monivärivirtaussytometria 1/1000-10 000 PCR pohjaiset menetelmät 1/10 000-1000 000
Normaalista poikkeavat antigeeni-ilmentymät, leukemia-associated (immuno)phenotypes, LA(I)Ps Ristilinjainen / asynkroninen /ektooppinen antigeeniilmentymä Antigeenin normaalia voimakkaampi tai heikompi / puuttuva ilmentyminen Tietyn antigeeni-ilmentymän omaavan solupopulaation poikkeava valosirontaominaisuus Seurantaan sopiva poikkeavuus löytyy: >95%:ssa ALL-tapauksista 50-95%:ssa AML:sta
Normaalit varhaiset, kypsyvät ja kypsät B-solut Precursor-B-ALL
B-ALL 50% Dg 0,3% d15 0,02% d79
Virtaussytometrinen jäännöstautianalytiikka: haasteita Blastipopulaation heterogeenisyys, subpopulaatioiden esiintyminen (>70% AML; <25% ALL) Fenotyypin muuntuminen / muuttuminen Yleistä (20-70%) Vaatii kokemusta (mm. normaaleiden ja regeneratiivisten luuytimien tuntemusta) Standardoinnin puute Näytteeseen ja näytteenottoon liittyvät ongelmat
Virtaussytometrian kehitysnäkymiä Laitteet > 8-10-väri Lajitteleva virtaussytometri Uudet fluorokromit ja vasta-aineet Uudet analysointiohjelmat Uudet tutkimusindikaatiot myelodysplasia immunologia HbF fetomaternaalivuodossa trombosyytit ja mikropartikkelit
Yhteenveto virtaussytometrinen immunofenotyypitys Immunofenotyypitys on keskeinen osa akuutin leukemian diagnostiikkaa: kroonisissa lymfoproliferatiivisssa taudeissa immunfenotyypityksestä on apua erityisesti B-solutautien osoittamisessa, luokituksessa ja levinneisyysselvittelyssä menetelmän etuina mahdollisuus analysoida useita ominaisuuksia yhtä aikaa, suurten solumäärien analysointi ja nopeus (vastaus tarvittaessa näytteenottopäivänä) harvoin yksinään diagnostinen, täydentää morfologisia ja sytomolekyyligeneettisiä tutkimuksia