Komplementtitutkimukset

Transkriptio

1 Komplementtitutkimukset Hanna Jarva HUSLAB ja Haartman-instituutti Bakteriologian ja immunologian osasto

2 Komplementti osa luontaista immuunijärjestelmää koostuu yli 30 proteiinista aktivoituu kaskadimaisesti

3 KLASSINEN TIE OIKOTIE C1 C1-INH MBL LEKTIINITIE C4 C2 DAF C4b2a C4bp C6, C7, C8, C9 C3 C5 C5b P klusteriini CR1 DAF Bb I I H MCP CR1 D B CD59 vitronektiini C5b-9 MAC SC5b-9

4 Komplementin tehtävät komplementtia tarvitaan immuunipuolustuksessa erityisesti bakteeri-infektioita vastaan komplementti pystyy suoraan tappamaan bakteereita ja tehostamaan muita puolustusmekanismeja komplementtia tarvitaan kehon puhtaanapitoon esim. kuolleiden solujen ja debriksen poiskuljetukseen

5 Milloin komplementtitutkimuksia tarvitaan? autoimmuunisairaudet komplementtipuutos? infektioalttius komplementtipuutos? perinnöllinen angioödeema = HAE (aikaisemmin HANE) C1-inhibiittorin puutos munuaissairaudet komplementtipuutos? komplementin liiallinen aktivaatio? hemolyyttinen anemia PNH?

6 Mitä mitataan? komplementtipuutokset C3, C4 proteiinimääritys seeruminäytteestä KLASSINEN TIE OIKOTIE nefelo- tai turbidometria komplementin kokonaishemolyyttinen aktiivisuus (CH100/CH50) seeruminäyte punasolujen hemolyysi tai ELISA C1 MBL LEKTIINITIE C4 C2 C4b2a C6, C7, C8, C9 C3 C5 C5b P Bb D B oikotien hemolyyttinen aktiivisuus (AH100) C5b-9 MAC SC5b-9 seeruminäyte punasolujen hemolyysi tai ELISA

7 Komplementin aktiivisuusmääritykset komplementti aktivoituu ollessaan tekemisissä keinopinnan kanssa jos komplementti pääsee aktivoitumaan jo näyteputkessa, komplementti kuluu ja varsinaisessa mittauksessa saadaan liian matala tulos kun halutaan mitata komplementtiaktiivisuutta: seeruminäyte (EDTA estää komplementtiaktivaation) seerumi on eroteltava nopeasti (alle 30 min näytteenotosta) näyte on säilytettävä ja kuljetettava kylmässä alle vuorokauden säilytys +4 C yli vuorokauden säilytys (ja kuljetus) -20 C toistuva sulatus/pakastus tuhoaa komplementtiaktiivisuuden

8 Perinnöllinen angioödeema eli HAE KLASSINEN TIE OIKOTIE toimivan C1-inhibiittorin puutos synnynnäinen, mutta oireet alkavat C1 C1-inh C4 C2 C4b2a C3 C5 P Bb D B yleensä vasta teini-iässä oireena ajoittaiset turvotukset iholla tai limakalvoilla MBL LEKTIINITIE C6, C7, C8, C9 C5b potilaita Suomessa noin C5b-9 MAC SC5b-9 turvotusoireet kuitenkin varsin yleisiä diagnostiikka: C1-inhibiittorin määritys C1-inhibiittorin aktiivisuuden määritys C4, C3

9 C1-inhibiittori (C1Inh) pitoisuusmääritys seeruminäytteestä (nefelo- tai turbidometria) (S-C1Inh) biokemiallisen aktiivisuuden määritys plasmanäytteestä (sitraattiplasma)(p-c1inhbk) alle vuorokauden säilytys +4 C pitempiaikainen säilytys -20 C HAE tyyppi I (85% HAE-potilaista) sekä C1-inhibiittoripitoisuus että biokemiallinen aktiivisuus alentuneet HAE tyyppi II (15% potilaista) C1-inhibiittorin pitoisuus normaali mutta biokemiallinen aktiivisuus alentunut

10 C3-nefriittitekijä (C3Nef) C3-nefriittitekijä on autovasta-aine Bb-komplementtikompleksia vastaan tekijän läsnäollessa komplementti aktivoituu niin, että kehittyy sekundaarinen puutos C3-nefriittitekijä liittyy eräisiin munuaistulehduksiin diagnostiikka: seeruminäyte nopea seerumin erottelu KLASSINEN TIE OIKOTIE alle vuorokauden säilytys +4 C yli vuorokauden säilytys (ja kuljetus) -20 C C1 C4 C2 C4b2a C3 C5 P Bb D B toistuva sulatus/pakastus pilaa näytteen menetelmänä immunofiksaatio MBL LEKTIINITIE C6, C7, C8, C9 C5b C5b-9 MAC SC5b-9

11 C3-nefriittitekijä

12 C4-fenotyypitys (S-C4Ty) yleensä ihmisillä 4 C4-alleelia, kaksi koodaamassa C4A:ta kaksi koodaamassa C4B:ta yhden tai kahden alleelin puutos yleisiä normaaliväestössäkin kahden alleelin puutoksia tavataan kuitenkin keskimääräistä enemmän eräissä autoimmuunitaudeissa, erityisesti SLE:ssä (C4A) tai infektioherkillä potilailla (C4B) tutkimuksessa tunnistetaan potilaan seerumista C4-proteiinityypit elektroforeesi-immunofiksaatiomenetelmällä näyte seerumia ja koska C4-proteiinit voivat pilkkoutua säilytyksen aikana, näyte säilytetään max 24 h +4, sen jälkeen pakastettuna toistuva pakastus/sulatus pilaa näytteen

13 C4-fenotyypitys

14 PNH-tutkimus (B-PNH) PNH = kohtauksittainen yöllinen hemoglobinuria harvinainen hemolyyttisen anemian syy syynä mutaatio luuytimen kantasolussa, jonka seurauksena kantasolun jälkeläisistä, esim. punasoluista, puuttuvat komplementinestäjät CD59 ja CD55 tämän takia punasolut hajoavat verenkierrossa tavallista helpommin diagnostinen tutkimus: CD59-määritys punasolujen pinnalta virtaussytometrialla (FACS) näytteeksi EDTA-verta, joka säilytetään kylmänä (+4 ) näytettä ei saa pakastaa! vanhentunut näyte (yli 3 vrk) voi johtaa väärään poikkeavaan tulokseen näytteen käsittely vie kokonaisen työpäivän perjantaiaamun jälkeen tulleet näytteet odottavat maanantaihin ja vanhenevat näyte tulisi toimittaa tutkivaan laboratorioon viimeistään torstai-iltapäivänä

15 Lopuksi komplementtitutkimuksissa (lukuunottamatta proteiinimäärityksiä) näytteen oikea käsittely on ensiarvoisen tärkeää aktiivisuusmäärityksissä ja C3-nefriittitekijä- ja C4-tyypitystutkimuksessa nopea seerumin erottelu säilytys ja kuljetus kylmänä, tarvittaessa pakastettuna pakastamisen jälkeen sulatetaan vasta määritystä tehdessä PNH-näyte: säilytys kylmänä (ei pakastettuna) näyte tutkivaan laboratorioon vuorokauden sisällä näytteenotosta näyte mielellään alkuviikosta