KUULUTUSJULKAISU. C Pntnntti 11 i')77 (45) t e n. (51) Kv.lk.a/Int.C1.* C 12 K 7/00. (41) Tullut julkiseksi Nyk offendlg

Transkriptio

1 KUULUTUSJULKAISU ( B) UTLÄGGNINGSSKRIFT C Pntnntti 11 i')77 (45) t e n (51) Kv.lk.a/Int.C1.* C 12 K 7/00 SUOMI FINLAND (SF) Patentti- ja rekisterihallitus Patent- och registerstyrelsen (21) Patenttihakemus PatentandSknIng 3344/73 (22) Hakendspilvi AnsöknIngadag (23) Alkupillvil--GlkIghetadag (41) Tullut julkiseksi Nyk offendlg (44) NihtivIlicslpanon js kuullulkalsun pvm. Ansekan udagd och utl.skriften publictrad (32) (33) (31) Pyydetty etuoikeus-810rd prioritet usa(us) (11) The Magenta of the University of Nebraska, Lincoln, Nebraska' 68502, USA(US) (72) Charles Albert Mebus, 1740 South 77th Street, Lincoln, Nebraska, USA(US) (74) Berggren Oy Ab (54) Menetelmä vasikan ripulia aiheuttavan koronavirukeen heikentämiseksi - nrfarande ftir attenuering at/1 ooronavirus oom alstrar diarr6 hoa kalvar Tämän keksinnön kohteena on menetelmä vasikan ripulia aiheuttavan koronaviruksen heikentämiseksi. Vastasyntyneiden vasikoiden ripulia (NCD) aiheuttavat tekijät ovat moninaiset. Useitten organismien on todettu aiheuttavan tätä tautia, mm. bakteerien, sienien, mykopiasman, klamydian ja virusten. Erikoisesti nimettyjä viruksia ovat olleet naudanripulivirus, tarttuvaa naudan henkitorventulehdusta aiheuttava virus, rauhasvirus, sekä suolivirus. Muita viruksia, joiden on mainittu aiheuttavan NCD-tautia, ovat vasikoiden keuhkokuumetta aiheuttava suolitulehdisvirus sekä reoviruksen tapainen aine, jota nimitetään NCD-virukseksi. Kenttäkokeissa, jotka suoritettiin Länsi-Nebraskassa käyttäen reoviruksen tapaisesta aineesta valmistettua rokotetta, todettiin tietyissä karjoissa vasikkasairauden riittämätön torjunta. /Vet.Med./ Small Anim. Clin., 67 (2), 173 (1972)7. Ilmeni, että vasikat olivat saaneet rokotteen elämänsä ensmmäisen 24 tunnin aikana, mutta kuitenkin ripuleja esiintyi useissa karjoissa, kun vasikat olivat 5-20 vuorokauden vanhoja. Näiden vasikoiden ripuliulosteet tutkittiin

2 52740 reoviruksen tapaisen viruksen suhteen käyttämällä fluorisoivaa vasta-ainetekniikkaa, ja saadut arvot osoittautuivat negatiivisiksi. Ripuliulosteita eräästä rokotetusta karjasta, jossa 90 % vasikoista oli saanut ripulin niiden ollessa 7-12 vuorokauden vanhoja, istutettiin pohjukaissuoli-injektiota käyttäen keisarileikkauksella synnytettyyn vasikkaan, joka ei ollut saanut ternimaitoa. Tässä vasikassa kehittyi ripuli, josta valmistettiin bakteerittomia ulostesuodoksia, ja niitä istutettiin suun kautta gnotobioottisiin vasikoihin. Näissä vasikoissa kehittyi ripuli, jonka aiheuttajaksi osoittautui toinen viruslaji. Koevasikoitten ripuliulosteiden elektronimikroskooppisessa tutkimuksessa ilmeni koronaviruksen tapainen viruslaji. Samanlaisia virushiukkasia löydettiin ripuliulosteista, jotka olivat p,eräii,jaq sekä kenttäkokeissa mukana olleista rokotetuista karjoista että rokottamattomista karjoista. Tämä uusi koronaviruksen tapainen virusaine on nyt puhdistettu ja identifioitu yksityiskohtaisemmin. Keksinnön mukaan on osoittautunut, että tämä koronavirus voidaan saada lisääntymään soluviljelmissä ja muuntaa tehokkaaksi rokotteeksi. On myös saatu selville, että tehokasta rokotetta voidaan valmistaa inaktivoimalla virus soluviljelmissä kasvattamisen jälkeen. Niinpä keksintö kohdistuu menetelmään tämän koronaviruksen heikentämiseksi ja keksinnön pääasialliset tunnusmerkit ilmenevät oheisesta patenttivaatimuksesta 1. Tämän aineen puhdistus ja tunnusmerkit on selostettu kirjoituksessa Am. J. Vet. Res. 33, (1972). Koronaviruksen tapaisen aineen puhdistus Ulosteainenäytteitä kerättiin 19 tilan karjojen ripulia sairastavista vasikoista Länsi-Nebraskassa. Näistä 12 karjan vasikoihin oli aikaisemmin istutettu suun kautta NCD-reoviruksen tapaista virusrokotetta, kun taas muiden karjojen vasikat olivat rokottamattomia. Ripulisairaista vasikoista otettuja ulostepreparaatteja värjättiin immuunifluoresoivalla konjugaatilla NCD-viruksen koettamiseksi (Univ. of Nebraska, Agri. Exper. Sta, Res. Bull. 233, 1969), ja käytettiin vain näytteitä, jotka antoivat negatiivisen tuloksen NCD-viruksen suhteen. Ripuliulosteaineet, jotka oli kerätty sekä kentältä luonnollisen tartunnan saaneista vasikoista että kokeellisesti tartutetuista vasikoista, jäähdytettiin välittömästi ja säilytettiin lämpötilassa C, kunnes viruksen puhdistaminen aloitettiin. Sakkaroositiheysgradientteja valmistettiin, ja niiden annettiin

3 seistä yön yli lämpötilassa 4 C lineaarisen gradientin muodostamiseksi ennen käyttöä. Gradientit käsittivät kukin 8 ml liuosta, jossa oli tislattuun deionisoituun veteen liuotettuna 400, 300, 200 ja 100 mg sakkaroosia millilitraa kohti. Pienenevän pitoisuuden omaavat liuokset asetettiin kerroksittain selluloosanitraattia sisältäviin sentrifugiputkiin, joiden koko oli 2,5 x 8,9 cm. Kaikki viruksen puhdistusta valmistelevat toimenpiteet suoritettiin lämpötilassa 4 C. Käytettiin kliinistä sentrifugia ja ultrasentrifugia. Ripuliulosteaines sekoitettiin kolminkertaiseen tilavuuteen deionisoitua vettä, ja seosta lingottiin 30 minuuttia g-arvon ollessa Eronnutta liuosta lingottiin sen jälkeen kolme tuntia nopeudella kierrosta minuutissa Beckman'in tyyppiä 30 olevassa ultrasentrifugissa. Saatu pallo dispergoitiin ultraäänikäsittelyllä 30 sekunnin ajan 5 %:isessa (paino/tilavuus) sakkaroosiliuoksessa. Tätä suspensiota nimitetään raakavirussuspensioksi. 5 ml raakavirussuspensiota asetettiin kerroksena putkissa olevien gradienttien päälle ja lingottiin nopeudella kierrosta minuutissa kanden tunnin ajan Beckman'in SW 27-ultrasentrifugissa. Linkoamisen jälkeen vyöhykkeet paikallistettiin valonhajoituksen avulla. Kunkin vyöhykkeen ainetta kerättiin sentrifugiputken yläpäästä käyttämällä propipetillä varustettua Pasteur-pipettiä. Näytteet dialysoitiin ammoniumasetaatin 1 %:ista liuosta vastaan ennen elektronimikroskooppitutkimusta. Virusta sisältävä jae (puoliksi puhdistettu virus vyöhykkeestä, joka sijaitsi 6 cm:n päässä meniskuksesta) saa- - tettiin lisäpuhdistuksen alaiseksi käyttämällä sakkaroositiheysgradienttisentrifugointia tai keesiumklorid5(csc1) gradienttisentrifugointia. Puoliksi puhdistettu virusvalmiste puhdistettiin edelleen toistamalla edellä kuvattu sakkaroositiheysgradienttisentrifugointi. Jälleen vyöhykkeet paikallistettiin, ja 6 cm:n päässä meniskuksesta sijaitseva vyöhyke kerättiin ja dialysoitiin 1 %:ista ammoniumasetaattiliuosta vastaan puhdistetun viruksen tuottamiseksi. Puoliksi puhdistetun virusvalmisteen isopykniset gradienttisentrifugoinnit keesiumkloridin kanssa suoritettiin käyttämällä aluksi 30 %:ista liuosta (15 g CsCl 35 ml:ssa deionisoitua vettä). 4 ml tätä liuosta asetettiin selluloosanitraattisentrifugiputkiin, ja kuhunkin putkeen asetettiin päälle 1,4 ml virussuspensiota. Käytettiin Beckman'in SW 65-ultrasentrifugia kierrosnopeudella

4 52740 kierrosta minuutissa 18 tunnin ajan, jona aikana saavutettiin näennäinen tasapaino. Kesiumkloridin taitekerroin vyöhykkeessä, jossa virus oli paikallistettu, määritettiin käyttäen nesteen proteiinisisällön määrittämiseksi tarkoitettua optista TS-mittaria (American Optical). 2,9 cm:n etäisyydellä meniskuksesta sijaitseva vyöhyke kerättiin ja dialysoitiin 1 %:ista ammoniumasetaattiliuosta vastaan puhdistetun viruksen muodostamiseksi. Edellä mainittua raakavirussuspensiota (15 ml) jakotislattiin myös käyttäen weelisuodatusta kooltaan 4,2 x 42 cm olevassa geelikolonnissa (Sepharose, 2B, agaroosip:eeli, jonka fraktiointialue on proteiineille x 106 molekyylipainoyksikköä, Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscatawav, N.J.). Kolonni oli etukäteen saatettu tasapainoon 0,9 %:isella NaCl-liuoksella ja kehitettiin tätä suolaliuosta käyttäen. Käytettiin virtausnopeutta 6,0 ml/tunti. 5 ml:n suuruisia jakeita kerättiin ja absorbtio määritettiin aallonpituudella 260 / um spektrofotometrin avulla. Kutakin eri huippua vastaavat aineet yhdistettiin ja väkevöitiin erikseen ultrasuodatusta käyttäen. Myös yksinkertaistettua menettelyä käytettiin viruksen valmistamiseksi koevasikoista saaduista ripuliulosteaineista. Ulosteainesta lingottiin sellaisenaan 30 minuutin ajan g-arvolla Osa.eronnutta ainetta uutettiin kaksi kertaa diklooridifluorimetaanilla. 5 ml vesifaasia ja 5 ml käsittelemätöntä eronnuta ainetta saatettiin sakkaroositiheysgradienttisentrifugoinnin alaiseksi, kuten edellä on selostettu. Tiheysgradienttisentrifugoinnilla väkevöityä virusta käytettiin elektronimikroskooppitutkimuksiin sekä myös antigeenina kaniinien immunisointiin konjugaatin valmistamiseksi immuunifluoresenssianalyysiä varten. Noin 6 kuukauden ikäisten valkoisten kotikaniinien sydämestä otettiin 14 ml verta, ja sen jälkeen niihin ruiskutettiin lihaksensisäisesti neljään paikkaan kuhunkin 0,25 ml seosta, joka sisälsi 0,4 ml antigeenia ja 0,6 ml Freund'in perusapuainetta. Viisi viikkoa istutuksen jälkeen otettiin 70 ml verta sydänpistoa käyttäen. Fluoreseiinilla merkittyä gammaglobuliinia valmistettiin istutuksen jälkeisestä seerumista tunnetuilla menetelmillä (Proc. U.S. Livestock San.Assn., Oct. 1968, ). Koronaviruksen tapaisen aineen läsnäolo voidaan todeta tartunnansaaneesta suolesta immuunifluoresenssitekniikalla käyttäen edellä valmistettua konjugaattia. Tämän konjugaatin sopivuus koronaviruksen tapaisen aineen määritykseen osoitettiin selvästi seuraavassa koesarjassa. Koronaviruksen tapaisella aineella tartutetuista ripulisairaista otetut suolileikkeet värjättiin, ja suolinukkasolu-

5 , jen fluoresenssi todettiin. Samasta vasikasta otetussa suolessa ei esiintynyt mitään fluoresenssia, kun se oli värjätty edellä mainitun reoviruksen tapaisen aineen konjugaatilla. Reoviruksen tapaisella viruksella tartutetuista ripulisairaista vasikoista otetut suolileikkeet olivat positiiviset, kun ne värjättiin reoviruksen tapaisen aineen konjugaatilla, ja negatiiviset, kun ne värjättiin koronaviruksen tapaisen aineen konjugaatilla. Normaalin gnotobioottisen vasikansuolen leikkeissä ei esiintynyt fluoresenssia, kun ne värjättiin koronaviruksen tapaisen aineen konjugaatilla. Viruksen morfologia Gradienttitiheysultrasentrifugointipuhdistuksessa saatua viruspitoista vyöhykettä tutkittiin elektronimikroskoopilla. Pisaroita vyöhykkeistä vietiin 200 mesh'in kupariverkolle, joka oli etukäteen päällystetty kollodiumilla ja vahvistettu höyrystetyllä hiilellä. Pisaroitten annettiin pysyä verkolla 3-25 minuuttia riippuen tutkittavan vyöhykkeen valonhajoitusasteesta. Liikaneste imeytettiin suodatinpaperiin, ja sen jälkeen verkkoon vietiin pisara vanadaatf timolybdaattifosforivolframihappoliuosta. Aineen annettiin pysyä verkolla 1-1,5 minuuttia ennen kuin liikamäärä poistettiin käyttäen suodatuspaperia imuvälineenä. Näytteet tutkittiin elektronimikroskoopilla suurennuksen ollessa tai suurempi. Kokomääritykset tehtiin analysoimalla näytteiden elektronimikrograafien mitat ja difraktiohilakuvat, jotka vm. otettiin välittömästi elektronimikrograafien jälkeen muuttamatta laitteen asetuksia. Ehjien virushiukkasten koko oli välillä / um samassa mikrograafissa, ja niiden pinnassa oli samanlaisia ulokkeita kuin on havaittu koronaviruksissa. Keskimääräinen hiukkaskoko, pintaulokkeet mukaan lukien, oli 126 / um elektronimikroskoopilla mitattuna. Nukleokapsidi oli polymorfinen sekä vaihteli kooltaan ja muodoltaan pyöreästä pitkulaiseksi. Nukleokapsidien kuoret olivat erittäin selvästi nähtävissä, kun ripsureuna oli poissa. Reunan leveys vaihteli maksimin ollessa 23 / um. Hyvin säilyneiden hiukkasten pintaulokkeet olivat kukan terälehden muotoisia, ja kiinni hiukkasessa kapean varren välityksellä ja ne olivat keskimäärin 11 / um:n pituisia. Edellä kuvattu keksinnön mukainen koronaviruksen tapainen aine on helposti erotettavissa koon ja morfologisten piirteiden perusteella muista sellaisista viruksista, joiden on osoitettu olevan etiologisena tekijänä vastasyntyneiden vasikoiden ripulissa tai

6 52740 joita on oletettu sellaisiksi. Tässä kuvatulla keksinnön mukaisella koronaviruksen tapaisella aineella on erilaisia morfologisia piirteitä, ja se on suurempi kuin enterovirukset, vasikan keuhkokuumesuolitulehdusvirus, naudanripulivirus sekä vastasyntyneiden vasikoiden ripulivirus (reo-muoto). Tämä uusi virus on pienikokoisempi kuin tartuttava naudan henkitorventulehdusvirus (rhinotracheitisvirus), ja siitä puuttuvat viimeksimainitun tyypilliset piirteet. Puhdistetun koronaviruksen tapaisen aineen tiheys (buoyant density) oli 1,24 yhdisteessä CsCl, kun sen sijaan reoviruksen tapaisen aineen tiheys oli 1,359 J. Comp. Med., 35 (1971)7. Koronaviruksen tapaisen aineen fysiologiset vaikutukset eroavat myös reo-muotoa olevan viruksen vaikutuksista. Taudin itämisaika, joka seuraa gnotobioottisiin vasikoihin suun kautta reoviruksen tapaisella aineella suoritettua istutusta, voi olla niin lyhyt kuin 13,5-14 tuntia, kun sen sijaan koronaviruksen tapaista ainetta käytettäessä lyhin taudin itämisaika oli 18 tuntia. Lisäksi reoviruksella tartutetuilla gnotobioottisilla vasikoilla on ripuli 5-8 tunnin ajan, ja ne osoittautuvat normaaleiksi 24 tuntia ripulin alkamisen jälkeen. Toisaalta koronaviruksen tapaisella aineella tartutetuissa gnotobioottisissa vasikoissa kehittyy ripuli, joka voi jatkua 5 tai useampia vuorokausia, tai vasikat voivat kuolla 2-3 vuorokautta ripulin alkamisen jälkeen. Rokotteen valmistus ja käyttö Seuraavassa selityksessä selostetaan menetelmiä, jotka soveltuvat keksinnön toteuttamiseen. Tartutetuista vasikoista saatua edellä kuvattua koronaviruksen tapaista ainetta kasvatettiin naudansikiön munuaissoluissa. Yksikerroksiset soluviljelmät valmistetaan käyttäen tunnettuja menetelmiä, ja niihin istutetaan koronaviruksen tapaista ainetta. Yksikerroksiset viljelmät pestään yleensä Hanks'in tasapainoitetulla suolaliuoksella, ja sen jälkeen virusistutusaine lisätään antaen sen absorboitua useita tunteja, yleensä 2 tuntia, lämpötilassa 37. Viljelmään lisätään Earle'n tasapainoitetun suolaliuoksen käsittävä viljelmäväliaine, joka sisältää 0,5 % laktalbumiinihydrolysaattia (LAH), 0,1 % hiivauutetta, 100 yksikköä penisilliiniä ja 200,ug streptomysiiniä millilitraa kohti, ja viljelmää haudotaan lämpötilassa C, sopivimmin 37 C:ssa 2-10 vuorokautta. Virus otetaan talteen esim. kaatamalla pois solujen päällä oleva neste. Virusymppi voi olla

7 52740 ulosteita, jotka on kerätty koronaviruksella tartutetuista vasikoista, tai viljelmänesteitä koronaviruksen tapaisen viruksen viljelmistä. Ulosteita voidaan käyttää sellaisenaan tai niitä voidaan laimentaa fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (ph 7,2), lingota niitä 20 minuutin ajan g-arvolla 1000, sekä käyttää sakasta eronnutta nestettä istutusaineena. Myös muita säilytysaineita voidaan käyttää, esimerkiksi muunnettua Eagle'n väliainetta, joka sisältää laktalbumiinihydrolysaattia. Säilytysaineen valinnan voi asiantuntija normaalisti suorittaa. Tehokkaasti heikennettyä koronaviruksen tapaista virusrokotetta saadaan idättämällä puhdistettua virusta nautasikiön munuaissoluissa riittävän monta kertaa, kunnes ei synny enää sairautta, kun rokotettu vasikka tartutetaan elinvoimaisella viruksella. Yleensä on tarpeen idättää virus 5-60 kertaa, idätysten tapahtuessa primäärisissä tai sekundäärisissä (primääriset solut, joissa on kerran idätetty) soluissa tahi useammin idätykseen käytetyissä soluissa tai kestosolulinjoissa. Useammin kuin 10 kertaa idätykseen käytettyjen solujen voidaan katsoa muodostavan solulinjoja. Eräs edullinen menetelmä käsittää yhdistelmän idätyksistä primäärisissä tai sekundäärisissä soluissa ja useammin idätykseen käytetyissä soluissa tai solulinjoissa. Viruksen tiitterit määritetään vakiomenetelmiä käyttäen. Esimerkiksi viruslaimennuksilla istutettuja soluja haudotaan 5 vuorokauden ajan pukissa, jotka sisältävät naudansikiön munuaissoluja. Viruksen läsnäolo määritetään esimerkiksi sytopatologisten vaikutusten, immuunifluoresenssin tai hemadsorption avulla. Tehokkaasti heikennetty rokote valmistettiin tarkemmin selostettuna seuraavasti: Naudansikiöstä valmistettiin suuri määrä primäärisiä munuaissoluja. Useita pullo- ja peiteviljelmiä valmistettiin primäärisistä soluista, ja primääristen solujen jäännös jäädytettiin käyttäen Earle'n tasapainoitettua suolaliuosta, joka sisälsi 0,5 % LAH, 10 % täysikasvuisen naudan seerumia ja 10 % dimetyylisulfoksidia. Pullo- ja peiteviljelmiin istutettiin virusta sisältävää liuosta kuten edellä on selostettu, ja niitä haudottiin lämpötilassa 37 C. Kun joitakin fluoresoivia soluja havaittiin peiteviljelmissä, tietty määrä samasta sikiöstä lähtöisin olevia jäädytettyjä soluja sulatettiin ja kasvatettiin yksikerroksisissa viljelmissä vakiomenetelmiä käyttäen. Tartutetusta primäärisoluviljelmästä vietiin nestettä näihin sekundäärisoluviljelmiin. 6-7 vuorokautta kestäneen haudonnan jälkeen sekundäärisoluviljelmästä saatua nestettä istutet-

8 52740 tiin edelleen muihin sekundääris.iin soluviljelmiin. Ensimmäisestä idätyksestä 15:nteen idätykseen saakka käytettiin 2 ml nestettä 240 ml vetävän pullon istutukseen, kuten edellä on selostettu. 15: nnestä idätyksestä 25:nteen idätykseen 2 ml nestettä lisättiin pullossa olevaan säilytysväliaineeseen. 25:nnen idätyksen jälkeen 1 ml istutusainetta lisättiin jokaisessa pullossa olevaan viljelmäväliaineeseen. Kun koronaviruksen tapainen aine oli saavuttanut 5:nnen - 20:nnen kudosviljelmäidätyksen, aloitettiin sarja peräkkäisiä idätyksiä sekundäärisissä soluissa. Kussakin virusidätyksessä vain osa soluista tuli tartutetuksi, ja muut tartuttamattomat solut viljeltiin edelleen, niin että niistä tuli seuraava attenuointiviljelyn idätystaso. Tätä tyyppiä olevaa soluviljelmää nimitetään attenuoiduksi soluviljelmäksi. Jatkamalla viruksen peräkkäisiä viljelmäidätyksiä idätykseen käytetyissä soluviljelmissä, kehitettiin yhteensoveltuva soluvirusjärjestelmä. Kun virusta oli idätetty 5-20 kertaa sekundäärisissä soluviljelmissä, virusta idätettiin 5-40 kertaa tai useampia kertoja idätykseen käytetyissä soluviljelmissä, jolloin saatiin tehokkaasti heikennetty koronaviruksen tapainen virusrokote. Viruksen idätysten haudontajakso lyhenee idätysten luvun kasvaessa, ja se voi olla 2-7 vuorokautta idätyksissä, jotka suoritetaan useammin idätyksiin käytetyissä soluissa tai solulinjoissa. Kutakin idätystä jatketaan kunnes saavutetaan sytopatogeeninen vaikutus. Rokotetta voidaan valmistaa naudansikiön munuaissolulinjassa tahi naudan tai muuta alkuperää olevista muista kudoksista tai solulinjoista, esimerkiksi naudan keuhkosta, naudan kuorikkosolulinjasta tahi sianmunuaissoluista tai -solulinjoista kasvattamalla rokotetta kudosviljelmässä likimain lämpötilassa 37 kunnes sopiva virustiitteri on saavutettu, ja sen jälkeen ottamalla virus talteen. Tiitteriarvoja välillä ,5, sopivimmin välillä , saavutetaan. Rokotetta voidaan käyttää nestemäisenä tai lyofilisoituna. Se voidaan rekonstruoida steriilin laimennusaineen kuten tislatun veden avulla myöhemmin käytettäessä. Sopivan tuotteen muodostaa heikennetty virus, jota on idätetty 12 kertaa sekundäärisissä soluissa ja 15 kertaa soluissa, joita on käytetty idätykseen 9-27 kertaa. Kokonaisidätystaso on siis 27. On valmistettu myös rokotteita, joita oli idätetty jopa 35 kertaa. Tehokas inaktivoitu rokote valmistetaan tunnetulla tavalla inaktivoimalla koronaviruksen tapaista ainetta. Tätä valmistetaan yleensä ensin kasvattamalla ainetta naudansikiön munuaissoluissa

9 kuten edellä on selostettu, kunnes riittävä tiitteri on saavutettu. Tiitterin pitäisi olla niin suuri kuin mandollista edellä mainitulla alueella. Mitä tahansa viruksen, vieläpä heikentämättömän viruksen, soluidätystasoa voidaan käyttää. Sen jälkeen virus inaktivoidaan käsittelemällä sitä lämpötilassa jollakin tunnetulla inaktivointitavalla, kuten käyttäen formaliinia, (3-propiolaktonia, ultraviolettisäteilyä tai kuumennusta niin pitkään aikaa ja sellaisessa määrässä, että virus tulee tehokkaasti inaktivoiduksi. Nämä yksityiskohdat ovat hyvin tunnettuja ammattimiehille. Apuainetta voidaan lisätä antigeenisyyden lisäämiseksi. Apuaine voi olla mikä tahansa yleisesti tunnetuista, mm. alumiinihydroksidigeeli, kaliauna, alginaatti tai öljyaine tahi muu apuaine kuten kivennäisöljy tai muu orgaaninen öljy. Tyypillinen menetelmä inaktivoidun rokotteen valmistamiseksi on seuraava. Käytetään koronaviruksen tapaista ainetta 27:nnestä idätystasosta, kuten edellä on selostettu. Formaliinia lisätään virusta sisältäviin viljelmänesteisiin kunnes pitoisuus 0,2 % on saavutettu. Näiden nesteiden annetaan sen jälkeen seistä 1-2 vuorokautta lämpötilassa 37. Inaktivoituun virukseen lisätään alumiinihydroksidigeeliä pitoisuuteen 10 %. ph säädetään arvoon n. 7,2 alumiinihydroksidilla. Heikennettyä rokotetta voidaan antaa suun kautta 1-5 ml suuruisina annoksina, jotka sisältävät ' 5 TCID/ml, vasikoille, sopivimmin vastasyntyneille, immuunisuuden aikaansaamiseksi elinvoimaista virusta vastaan. Inaktivoitua rokotetta annetaan ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti 1-5 ml suuruisina annoksina kantaville lehmille vuorokautta ennen vasikointia tai vasikoille niin pian kuin mandollista niiden syntymän jälkeen suojauksen aikaansaamiseksi koronaviruksen tapaista ainetta vastaan. Heikennetyn virusrokotteen tehokkuutta kokeiltiin antamalla eri asteiseksi attenuoitua rokotetta noin 7 tunnin ikäisille gnotobioottisille vasikoille. Myöhemmin vasikat tartutettiin istuttamalla niihin elinvoimaista virusta. Näiden kokeitten tulokset on koottu taulukkoon 1. Vasikassa 1, johon oli istutettu 10 ml soluviljelmänestettä viruksen 14:nnestä idätyksestä sekundäärisissä naudansikiömunuaissoluissa, kehittyi ripuli, ja se toipui. 9 vuorokauden iässä vasikkaan istutettiin suun kautta 10 ml ripuliulostetta (elinvoimaista virusta) 20 ml:ssa fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (ph 7,2), ja se pysyi normaalina. Vasikassa 2, johon oli istutettu 10 ml vi-

10 ruksen 15:nnettä idätystä sekundäärisessä naudansikiömunuaisessa, ei kehittynyt ripulia, ja se pysyi normaalina, kun se oli tartutettu istuttamalla siihen elinvoimaista virusta. Vasikoissa 3 ja 4, joihin oli istutettu 10 ml sekundäärisissä naudansikiömunuaissoluissa kasvatettua 16:nnen idätyksen virusta, kehittyi lievä ripuli. Vasikka 3 teurastettiin välittömästi ripulin puhkeamisen jälkeen; ohutsuolen ja paksusuolen leikkeissä, jotka värjättiin koronaviruksen tapaisen aineen konjugaatilla, esiintyi immuunifluoresenssia suolinukan ja paksusuolen epiteelissä. Vasikka 4, johon istutettiin 6 vuorokauden ikäisenä elinvoimaista virusta ripuoliulosteessa, pysyi normaalina. Vasikassa 6, johon oli istutettu suun kautta 5 ml sekundäärisissä naudansikiömunuaissoluissa kasvatettua 19:nnen idätyksen virusta, kehittyi ripuli. Kandessatoista vasikassa (n:ot 7-13 ja 15-19), joihin oli istutettu suun kautta 5 ml 13:nnen - 25:nnen idätyksen virusta, ainakin 5 idätyksen ollessa naudansikiösoluissa suoritettuja korkeampia idätyksiä, ei kehittynyt ripulia, ja ne pysyivät vasikkaa 18 lukuunottamatta normaaleina, kun niihin oli istutettu suun kautta elinvoimaista virusta sisältävää ulostetta.

11 Vasikka n:o 1 2 Virusidätysten luku- määräb Taulukko 1 a Virusistutuksen tulos Tartuntaistutuksen tulos teurastettu N 5 Tartuntaviruksen - D vertauskoe D ei tartutettu D N d d N N N N 3 N N Vasikan ikä (vuorokautta) N N N N N N N N N N 5 14 Tartuntaviruksen - D 3 vertauskoe 1S N N N N N N N d N N 4 a D=ripuli; N = normaali b idätykset primäärisissä ja sekundäärisissä soluissa ja idätykset idätykseen käytetyissä soluissa

12 Karjatila n:o 1 Taulukko 2 Lehmien lukumäärä Ripulin suhteen käsiteltyjen % vasikoiden lukumäärä 242 kaksi kertaa rokotettua 3 85 rokottamatonta 77 käsitelty 1 % 91 % Karjatila n:o 2 (a) 600 kaksi kertaa rokotettua (400 synnyttänyt navetassa, jossa bakteeritartuntaa todettu 200 synnyttänyt navetan ulkopuolella) % 10 5 % (b ) 350 kerran rokotettua 17 5 % 1300 rokottamatonta % (c ) 750 kaksi kertaa rokotettua 7 1 % (d) 250 kaksi kertaa rokotettua 3 1 % 250 rokottamatonta %

13 13 Patenttivaatimukset Menetelmä koronaviruksen heikentämiseksi, joka aiheuttaa vasikanripulia, t u n n e t t u siitä, että virusta idätetään 5-60 kertaa nautasikiön munuaissolujen muodostamassa kudosviljelmässä lämpötilassa C, kunnes virus vastasyntyneisiin vasikoihin istutettaessa estää taudin kehittymisen myöhemmin elinvoimaisella viruksella suoritetun tartuttamisen jälkeen. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n n e t t u siitä, että idätyksiä suoritetaan yhteensä kertaa, joista 5-10 idä- - tystä suoritetaan primäärisissä tai sekundäärisissä naudansikiön munuaissoluviljelmissä ja muut idätykset naudan munuaissoluviljelmissä, joita on idätetty lukuisampia kertoja. Patentkrav 1. Förfarande för attenuering av coronavirus som förorsakar kalvdiarrg, k ä n n e t e c k n a t av att viruset passageympas 5-60 gånger i en vävnadskultur av nötkreatursfosternjurceller vid en temperatur av C tills viruset, då det ympas i nyfödda kalvar, förhindrar utveckling av sjukdom vid påföljande smittning med virulent virus. 2. Förfarande enligt patentkravet,l, k ä n n e t e c k n a t av att sammanlagt passageympningar utföres, av vilka 5-10 utföres i primära eller sekundära nötkreatursfosternjurcellkulturer och resten i nötkreatursnjurcellkulturer av högre passage. Viitejulkaiewia-Anförda publikationer P ate ntti j ulkai suj az -Patentskri f ter : Suomi -1Pi n1 and( SF) ( C 12 k 5/00 Muita julkaisuja:-anctra publikationer: Veter. Med./3nall Anim. Clin. 6/ (1972) Am. J. Vet. Rea. (1972),