Kylvetysimmunisoinnilla vasta-aineita, mutta ei vastustuskykyä columnaris-taudille?

Transkriptio

1 Kylvetysimmunisoinnilla vasta-aineita, mutta ei ä columnaris-taudille? Heidi Kunttu Bio- ja ympäristötieteiden laitos Jyväskylän yliopisto

2 Flavobacterium columnare ja columnaris-tauti Fc esiintyy luonnonvesissä vapaassa vedessä sekä biofilmeissä (Kunttu ym. 2012) Leviää tätä reittiä pintavesilaitoksille Fc pystyy elämään kalaisännän ulkopuolella ja kuolleissa kaloissa (Kunttu ym. 2009) Säilyy ja leviää tehokkaasti kalanviljelylaitoksilla Välttelee näin antibioottilääkitystä, joka ainoa tehokas hoitomuoto Suomessa/EU:ssa ei saatavilla ennaltaehkäiseviä menetelmiä Lohikalojen immunisaatiota tutkittu erittäin vähän Fujihara & Nakatani 1971 makea vesi Ransom 1975 Becker & Fujihara 1978 Rokotetilanne 0-1+ poikaset EU:ssa ei saatavilla FryVac 1 ja 2 Tuhottu rokote lohikaloille lämmin vesi Chile, USA Ei tieteellisiä tutkimusjulkaisuja Ei saatu testattavaksi AQUAVAC-COL Heikennetty, elävä, pilkkupiikkimonni, isobassi USA Ei saa tuoda EU:hun stressi muut infektiot

3 IMMUCOL-projekti Immunisointimenetelmän kehittäminen columnaris-tautia vastaan lohikalojen poikastuotannon turvaamiseksi Suomessa Kylvetys-/immersioimmunisointi Keski-Suomen ELY-keskus, hankenumero Myöntöpäätös , muutospäätökset ja Päätös numero 2312/3561/2011 Toteutus kaksivaiheisena Vastuullinen johtaja: FT Heidi Kunttu Varajohtaja: prof. Jouni Taskinen Yhteistyössä Hanka-Taimen Oy Omarahoitus Voimalohi Oy Suomen Kalankasvattajaliitto Ry FT, dos., Lotta-Riina Sundberg

4 IMMUCOL-projekti: aikaisemmat tulokset Vuosi 2012 alussa Fc 2010, siika KVL 2012 Kalanviljelylaitos 1-2 g 60 C:ssa tuhottu JY I Laboratorio 1,5 g 60 C:ssa tuhottu JY II Laboratorio 1,86 g Formaldehydillä tuhottu JY III Laboratorio 3,29 g Sonikoimalla ja pakastamalla tuhottu Vastaainevaste Vastustuskyky 6,5 x 10 6 CFU/ml 1 min? 6,5 x 10 6 CFU/ml 1 min 8,17 x 10 6 CFU/ml 1 min 8,0 x 10 6 CFU/ml 1 min CFU = colony forming units = bakteerisolujen lukumäärä

5 IMMUCOL-projekti: Immunogeeni Columnaris-tautia sairastavasta kirjolohesta eristetty F. columnare -bakteeri Kokeissa käytettiin edellisenä kesänä eristettyä kantaa Taudinaiheutuskyky testattu laboratorio-olosuhteissa Tuhottu pakastamalla ja sulattamalla useita kertoja Kokeet KVL 2013 ja 2014 (kalanviljelylaitoksella) JY IV-VII (laboratoriossa) Immunisointi Tehoste 2-4 vko immunisoinnin jälkeen (KVL 2013: 8 vko immunisoinnin jälkeen) Seurattiin: Fc-vasta-aineiden tuotto plasmaan ja iholimaan Sairastuminen luonnolliseen (KVL) ja kokeelliseen Fc-infektioon (JY)

6 KVL 2013 Toimiiko kylvetys suuremmalla immunogeeniannoksella kuin 2012 kalanviljelyolosuhteissa, kun ensimmäinen immunisointi tehdään mädille? KVL 2013 Kalanviljelylaitos mäti 0,69-0,8 g 2,076 x 10 7 CFU/ml 15 min 1,0 x 10 8 CFU/ml 1 min? Kolme taudinpurkausta Lääkintä II ja III yhteydessä Ei tta Varjokylvetysimmunisoitujen kokonaiskuolleisuus (14,3 %) immunisoitujen (11,7 %) kuolleisuutta korkeampi (tilastollisesti merkitsevä tulos: Survival analysis) Mutta: Johtui ensimmäisen taudinpurkauksen kuolleisuudesta, jolloin altaita vain yksi/käsittely

7 KVL 2014 Toimiiko kylvetys suuremmalla annoksella, pidemmällä immunogeenille altistusajalla ja suuremmilla kaloilla kuin 2013 kalanviljelyolosuhteissa? KVL 2014 Kalanviljelylaitos 2,3 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 15 min

8 KVL 2014 KVL 2014 Kalanviljelylaitos 2,3 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 15 min? Kuolleisus % Kokonaiskuolleisuus (% ± SE) taudinpurkausaikana ,37 Kylv.imm. 61,53 Varjokylv.imm. Kumul. mort % 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 Kumulatiivinen mortaliteetti (%) taudinpurkauskautena Varjokylv.imm. Kylv.imm Lämpötila ,0 28,0 26,0 24,0 22,0 20,0 18,0 16,0 14,0 12,0 10,0 8,0 6,0 4,0 2,0 0,0 Lämpötila ( C) Käsittely Päivä nro Antibioottikuurin aloitus Taudinpurkaus alkoi myöhään Lääkintä kokeen lopussa Ei tta Varjokylvetysimmunisoitujen kokonaiskuolleisuus immunisoitujen kuolleisuutta korkeampi tilastollisesti merkitsevä tulos (Survival analysis) Mutta: Altaiden välillä suurta vaihtelua käsittelyjen sisällä Korkea kuolleisuus molemmissa käsittelyissä

9 JY IV Toimiiko kylvetys isoilla kaloilla ja pitkällä immunogeenille altistusajalla? JY IV Laboratorio 19,26 g 1,0 x 10 6 CFU/ml 2 h Ei tta Immunisoitujen ja varjo-immunisoitujen kuolleisuus yhtä suuri (ei tilastollisesti merkitsevää eroa käsittelyjen välillä: Survival analysis)

10 JY V Toimiiko kylvetys, ruokinta tai immunisointi ruumiinonteloon (IP) 4-8 g kaloilla ja suurella immunogeeniannoksella? JY V Laboratorio 3,8 g 3,8 g 3,8 g 7,4 g K: 5,0 x 10 8 CFU/ml R: CFU/g/pvä K+R: ks. Yllä IP: 1,0 x 10 8 CFU/kala 5 min

11 JY V JY V Laboratorio 3,8 g 3,8 g 3,8 g 7,4 g K: 5,0 x 10 8 CFU/ml R: CFU/g/pvä K+R: ks. Yllä IP: 1,0 x 10 8 CFU/kala 5 min Huomattava en nousu IP-immunisoiduilla Vähäinen en nousu plasmassa kylvetys-, kylvetys+ruokinta- ja varjo-ip-immunisoiduilla (vain Freundin täydellinen adjuvantti, ei immunogeeniä) Tilastollisesti merkitsevä tulos (Oneway ANOVA): kylvetys ja kylv+ruok vs. ruokinta ja varjokylv+varjoruok Kylvetysimmunisoitujen kuolleisuus alhaisempi kuin muiden käsittelyjen (tilastollisesti merkitsevä tulos: Survival analysis) Merkitseviä eroja myös muiden käsittelyjen välillä Abs (405 nm) 2,200 2,000 1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 Vasta-ainevaste, 1/20 laimennus a a b b Kumul. mort. (%) 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 Kylvetys-, ruokinta-, kylvetys+ruokinta- ja IP-immunisointi + bakteeriinfektio Kylv+inf Ruok+inf Kylv+ruok+inf Varjokylv+varjoruok+inf IP+inf Varjo-IP+inf e d e c d b c b a 0, Käsittely Aika: h infektion jälkeen

12 JY VI-VII Toimiiko kylvetys rautaköyhällä kasvatusalustalla tuotetulla immunogeenillä ja suurella immunogeeniannoksella? Kylvetys rautaköyhällä kasvatusalustalla kasvatetulla, heikennetyllä (elävä) Flavobacterium psychrophilum -bakteerilla alentaa kuolleisuutta hopealohella (Oncorhynchus kisutch) kokeellisessa F. psychrophilum -infektiossa (Long et al. 2013: Enhanced efficacy of an attenuated Flavobacterium psychrophilum strain cultured under iron-limited conditions, FSI 35: ) Fc tehostaa ulkokuoren rautaa sitovien proteiinien tuotantoa rautaköyhällä kasvualustalla kasvatettaessa voivat toimia immunogeeneinä (Guan et al. 2013: Identification of iron acquisition machinery in Flavobacterium columnare, DAO 106: ) JY VI Laboratorio 0,45 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 15 min JY VII Laboratorio 4,88 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 30 min Infektio JY VII Immunisointi JY VI Infektio JY VI

13 JY VI JY VI Laboratorio 0,45 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 15 min Erittäin vähäinen en nousu plasmassa sekä normaalissa että rautaköyhässä kasvatusliemessä tuotetulla immunogeenillä immunisoiduilla kaloilla Tilastollinen ero varjo- ja/tai kontrollikäsittelyihin (Oneway ANOVA) Kuolleisuudet yhtä suuret infektiossa (100 %) Normaalissa kasvatusliemessä tuotetulla immunogeenillä immunisoiduilla kuolleisuus eteni hitaimmin Tilastollisesti merkitsevä tulos (Survival analysis) Vasta-ainevaste Fc-bakteerille, 1/20 laimennus Immunisointi normaalissa vs. rautaköyhässä kasvatusliemessä tuotetulla immunogeenillä + infektio 2, ,00 Abs (405 nm) 2,000 1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 Kumul. mort. (%) 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 Kylvetys + inf Kylvetys-Fe + inf Varjokylv + inf Kontrolli a b c 0,600 0,400 0,200 0,000 a b a b c Kylvetys Kylvetys-Fe Varjokylv Kontrolli c 30,00 20,00 10,00 0, d Käsittely Aika: h infektion jälkeen

14 JY VII JY VI Laboratorio 4,88 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 30 min Vähäinen en nousu plasmassa sekä normaalissa että rautaköyhässä kasvatusliemessä tuotetulla immunogeenillä immunisoiduilla kaloilla Tilastollinen ero varjo- ja kontrollikäsittelyihin (Kruskal-Wallis) Kuolleisuudet yhtä suuret infektiossa (100 %) Taudinkulussa ei eroja käsittelyjen välillä (Survival analysis) Vasta-ainevaste Fc-bakteerille, 1/20 laimennus Immunisointi normaalissa vs. rautaköyhässä kasvatusliemessä tuotetulla immunogeenillä + infektio 2, ,00 Abs (405 nm) 2,000 1,800 1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 a a Kumul. mort. (%) 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 Kylvetys + inf Kylvetys-Fe + inf Varjo-kylv + inf Kontrolli 0,400 20,00 0,200 b b 10,00 0,000 Kylvetys Kylvetys-Fe Varjokylv Kontrolli 0, Käsittely Aika: h infektion jälkeen

15 Yhteenveto tuloksista Kalanviljelylaitoksen kokeet Ei Fc-spesifistä tta suurellakaan immunogeeniannoksella ja pitkällä immunogeenille altistusajalla Kaikissa projektin aikana tehdyissä kokeissa immunisoiduilla hiukan alhaisempi kokonaiskuolleisuus kuin kontrolleilla Immunisointi vaikutti jollain tasolla vaikka en nousua ei pystytty todentamaan? Syy: laitokselle veden mukana tulevat muut elimistölle vieraat tekijät (loiset, muut bakteerit, ym.), joiden aikaansaamat immuunipuolustuksen reaktiot peittävät alleen kylvetysimmunisoinnin aikaan saaman, laboratoriokokeissa havaitun en vähäisen nousun? MUTTA Suuri kokonaiskuolleisuus molemmissa ryhmissä Ei vältytty lääkitykseltä Ei käytännön hyötyä kalanviljelijöille! KVL 2012 Kalanviljelylaitos 1-2 g 6,5 x 10 6 CFU/ml 1 min? KVL 2013 Kalanviljelylaitos mäti 0,69-0,8 g 2,076 x 10 7 CFU/ml 15 min 1,0 x 10 8 CFU/ml 1 min? KVL 2014 Kalanviljelylaitos 2,3 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 15 min?

16 Yhteenveto tuloksista Laboratoriokokeet Vasta-ainevasteen lievä nousu plasmassa suurella immunogeeniannoksella Altistusajan oltava 5 min tai enemmän Kokeesta riippuen alensi kuolleisuutta suojavaikutus infektiossa epävarma Ei tarpeeksi voimakas Immunogeenin tuottotavalla ei vaikutusta? Selvitys kesken! Immunisointikäsittelyt rankkoja pienille kaloille! Kuolleisuus joissakin kokeissa korkeampi kuin varjoimmunisoiduilla JY I Laboratorio 1,5 g 6,5 x 10 6 CFU/ml 1 min JY II Laboratorio 1,86 g 8,17 x 10 6 CFU/ml 1 min JY III Laboratorio 3,29 g 8,0 x 10 6 CFU/ml 1 min JY IV Laboratorio 19,26 g 1,0 x 10 6 CFU/ml 2 h JY V Laboratorio 3,8 g 3,8 g 3,8 g 7,4 g K: 5,0 x 10 8 CFU/ml R: CFU/g/pvä K+R: ks. Yllä IP: 1,0 x 10 8 CFU/kala 5 min JY VI Laboratorio 0,45 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 15 min JY VII Laboratorio 4,88 g 5,0 x 10 8 CFU/ml 30 min

17 IMMUCOL-projekti Ei kalanviljelijöitä hyödyttävää suojavaikutusta kylvetysimmunisoinnilla vaikka viitteitä suojavaikutuksesta on Vasta-ainevasteen lievä nousu lupaava tulevaisuuden tutkimusten kannalta, koska yleisesti kylvetysimmunisointi tehottomampi kuin IP-immunisointi vaste saatiin pienille kaloille Projektin loppuaika Immunogeenin tuottotavan ja saannon optimointi normaalissa ja rautaköyhässä kasvatusalustassa

18 Kiitos Seurantaryhmä Yrjö Lankinen, Savon Taimen Oy Mari Nykänen, Keski-Suomen ELY-keskus Pia Vennerström, Evira Risto Kannel, Luke Jyväskylän yliopisto Prof. Jouni Taskinen FT, dos., Lotta-Riina Sundberg FT, dos., Katja Pulkkinen FT Nina Pekkala FM Sari Aaltonen FM Marjo Aaltonen LuK Liisa Alaoutinen LuK Johanna Kantanen Laboratoriomestari Nina Honkanen Harjoittelija Hanna Suonia