Komplementtidiagnostiikka. Markku Viander Turun yliopisto Lääketieteellinen mikrobiologia

Transkriptio

1 Komplementtidiagnostiikka Markku Viander Turun yliopisto Lääketieteellinen mikrobiologia

2 AbAg, CRP MBL Vieraat solut, mikrobit, aktivaattoripinta Klassinen ja lektiinitie Vaihtoehtoinen tie C aktivaatio MAC lysis kemotaksis, fagosytoosi opsonisaatio CIC-liuotus ja poisto verestä Apoptoottisten solujen poisto

3

4 C4a C4d Ba Bb C3a C3d (mannoosi) C5a SC5b-9

5 Komplementtimääritysten indikaatiot 1. Komplementin (faktorien) puutosten selvittäminen 2. Säätelijäpuutosten osoittaminen 3. Komplementin aktivoitumisen selvittäminen Immunovajavuuksien diagnostiikka HAE hereditaarinen angioödeema PNH kohtauksittainen öinen hemoglobinuria HUS hereditaarinen ureeminen syndrooma Autoimmuunisairaudet (Immuunikompleksitaudit) Glomerulonefriitit Vaskuliitit, endokardiitti Pleuriittien erotusdiagnostiikka

6 Komplementin puutosten esiintyvyys Klassinen tie C1q >40 95% SLE C1r, s >20 55% SLE, GN C4 >20 75% SLE C4A 1-3% SLE C4B 1-3% Neisseriainfektiot C2 >100 (5/100000) N. 30% SLE (ANA neg), GN C3 >20 Infektioherkkyys Oikotie Tekijä B 1 Infektioherkkyys Tekijä D 3 Infektioherkkyys Properdiini Kymmeniä Vakavat meningokokki-infektiot Lektiinitie MBL 5-15% Infektioherkkyys lapsuudessa MASP2 15/ Infektioherkkyys lapsuudessa Lopputie C5 >20 Neisseriainfektiot C6, 7, Neisseriainfektiot C9 tuhansia Neisseriainfektiot

7 Komplementin puutoksiin liittyvät oireet Lisääntynyt infektioherkkyys C3, H, I Neisseriainfektiot (meningiitti) C5, C6, C7, C8, C9 properdiini, C3, H, I Glomerulonefriitit (MPGN II) Tekijät H, I, C3Nef Hemolyyttis-ureeminen syndr. Tekijä H SLE:n oireet, HUVS C1q, r, s, C2, C4 (C4A) anti-c1q-vasta-aineet Angioödeema (HAE) C1INH tai anti-c1inh-ab PNH (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), hemolyytt. GPI-molek (CD59), CD55 anemia, tromboosi (DAF)

8 Komplementtipuutosten selvittely: Komplementti, kokonaisaktiivisuus: CH100 (kl. 4941), sisältää S-CH100Cl (3856), S-CH100Al (1569), S-CH100L (3857) Klassinen tie: S-CH100Cl Vaihtoehtoinen tie: S-CH100Al (AH 100) Lektiinitie: S-CH100L C3 ja C4 pitoisuudet C4 allotyypit Matala C3 (sekund.): C3Nef, Fakt H tai Fakt I puutos Säätelijamolekyylien toiminta Mikäli CH100Cl tai CH100Al ovat matalat, tutkitaan klassisen tai vaihtoehtoisen tien komponenttien pitoisuudet

9 Komplementin seulontatutkimukset Wielisa-kit (COMPL 300) Usein seulontatutkimukseen liitetään C3, C4, Faktori B ja properdiini määritykset CH100Cl, CH100Al N, CH100MBL N klassisen tien puutos: C1q, C1r, C1s CH100Cl, CH100Al N, CH100L klassisen tien puutos: C4A, C4B, C2 CH100Cl N, CH100Al, CH100L N oikotien puutos: tekijät B, D, properdiini CH100Cl N, CH100Al N, CH100L lektiinitien puutos: mannaania sitova lektiini (MBL), MASP2, (MASP1) CH100Cl, CH100Al, CH100L C3 tai lopputien puutos: C3, C5, C6, C7, C8, C9, tekijät I ja H

10 S-C-Def Komplementin puutos -tutkimus Tutkimus aloitetaan tutkimalla S- komplementti, aktiivisuus (CH100; kl. 4941), properdiini ja Faktori-B Mikäli CH100Cl on matala tutkitaan lisäksi C1q, C1r, C1s, C2, C4, C3, C5, C6, C7, C8 ja C9 Tutkimuksesta annetaan lausunto Mikäli C4 matala, jatkotutkimuksena C4 allotyypit (geenit ja proteiinit)

11 Potilas 1, 14 v poika, tutk. epäselvän kuumeilun takia appendix leikattu s nyt kuumeilua, CRP noussut (liev), infektiofokusta ei löydetty SLE serologia negatiivinen duprot koholla, krea ajoittain >200 C g/l (matala), C g/l (norm) maksabiopsia suunnitteilla CH100Cl 14% (norm. >60%) CH100Al 0% (norm. >50%) CH100L 26% (norm. >40%, puutos <10%) Kommentti: CH100-löydös sopii matalaan C3-arvoon. Munuaisvurio? Mahd. C3-Nefriittitekijä tai faktori H:n / faktori I:n toiminnan puutos -> voimakas C3- aktivaatio ja sekundaarinen C3-puutos Jatkotutkimukset: C3Nef, Komplementin aktivaatiotutkimus S-C-Akkt (C3 + C3d, FakB + Bb, C4 + C4d), C-Def (komplementin tekijät C3, C5-C9)

12 Potilas 2, 43 v mies, tutk. vartaloturvotuksien ja epäselvän infektion takia. Todettu perikardiitti. Hepatiitti C positiivinen. CRP >200 bakteeriviljelyt (veri, tbc) negatiiviset C g/l (norm) C g/l toistetusti (matala) CCP >1600 U/ml RF 105 IU/ml ANA negat p-anca 160 (matala posit) CH100Cl 11 (norm. >60%) CH100Al 66% (norm. >50%) CH100L 0% (norm. >40%, puutos <10%) Kommentti: CH100-löydös sopii C4-puutokseen. Matala C4 geneettisistä syistä tai sekundaarisesti laskenut C4 voimakkan klassisen tien aktivaation takia. Matala C4 sopii autoimmuunitautiin (RA). Jatkotutkimukset: C4 allotyypit (geeni ja proteiini), komplementin aktivaatiotutkimus S-C- Akkt (C4 + C4d, C3 + C3d, FakB + Bb)

13 Komplementti immuunitaudeissa Aktivoitumisen (aktivaatiotuotteiden) tutkiminen - Klassisen tie aktivaatio: immuunikompleksit, CRP, MBL - Oikotien aktivaatio: bakteerit, virukset, solut 1. Klassinen tie: SLE, reuma ja muut systeemiset autoimmuunitaudit, vaskuliitit, glomerulonefriitit, endokardiitit, pleuriitit, krooniset infektiot 2. Oikotie: Gram-neg. bakteerien aiheuttama bakteremia, palovammat, pankreatiitti, pneumonia, traumat, SLE, glomerulonefriitit

14 Komplementin aktivaatiotuotteiden määritys - C4d, C3d ja Bb nousevat vain komplementin aktivaatiossa CH100Cl C4d C3d Bb CP N N SLE, kryo, vaskul, HBV AP N N Gram-neg bacteremia CP + AP PSGN, pankreatiitti CP / fluid N N SLE, MPGN, (HANE) AP / fluid N N MPGNII (C3Nef), lipodystr. H tai I puutos

15 Complement split products in relation to flare of SLE (n= 64, flares =22) Elevated Ba Sensitivity 0.73 Specificity 0.60 PPV 0.48 Bb SC5b C4d Decreased C C CH Arthr Rheum 1992; 35, No. 9

16 Komplementin aktivaatiotuotteet (P-C-Akkt) 1. Klassinen tie: C4+C4d, C3+C3d 2. Oikotie: B+Bb, C3+C3d Molemmat tiet: C4+C4d, C3+C3d, B+Bb Loppuosa: SC5b-C9 (liukoinen kompleksi, pysyy verenkierrossa jopa viikon) Aktivaatiotuotteet voidaan määrittää myös kudosnesteistä (likvor, pleuraneste, nivelneste)

17 Komplementin laboratoriodiagnostiikka Näytteenotto 1 S-CH100 (4941), [sis. S-CH100Cl (3856), S-CH100Al (1569), S-CH100L (3857)]; S-C-def o C aktivoituu helposti in vitro (plasmiini) 1. Tuore seerumi : oneula hyvin -> 3-4 ml pois onäyte 2-4 ml verta oseerumi erotetaan välittömästi (n. 1 h) (60-65 min RT, sitten sentrifugointi +4 o C) opakastetaan 2-4 osassa (a ml) -70 C:een

18 Komplementin laboratoriodiagnostiikka Näytteenotto 2 P-C-Aktt, P-C3Aktt, P-C4Aktt, P-FakBAktt 2. Plasma (C komponentit ja akt.tuotteet) o3-4 ml verta pois o2 EDTA (0.01M) -putkea verta (saostaa Ca 2+ ja hajottaa C1qrs-kompleksin) oplasma erotetaan heti (miel. jäähauteella kunnes erotettu!) onäyte pakastetaan (2-4 x ml) -20 o C / -70 o C olähetetään pakastettuna (hiilihappojää) tai +4 o C jos näyte laboratorioon 24 tunnissa

19 C aktivaatio: yhteenveto o Vanhat testit (C3/C4, CH50) - > vain voimakas aktivaatio esiin (GN) - > C4 nolla-alleelit: matala C4 ei aina osoitus aktivaatiosta obb, C3d, C4d - > herkkiä, spesifisiä, oikotie / klassinen - > SLE, RA, GN, kryoglobulinemiat osc5b-9 o- > verenkierrossa jopa viikon - > glomerulonefriiteissä virtsassa okudosnesteet / biopsiat onäytteenotto: EDTA-plasma, in vitro aktivaatio! olähetetään pakastettuna, ellei labraan <24h!