Autoimmuunitutkimusten validointi. Markku Viander Turun yliopisto Lääketieteellinen mikrobiologia

Transkriptio

1 Autoimmuunitutkimusten validointi Markku Viander Turun yliopisto Lääketieteellinen mikrobiologia

2 Validointia tarvitaan Uuden menetelmän kehittelyssä Kun vanha menetelmä korvataan uudella Menetelmän kliinisen merkityksen selvittämiseksi

3 Toimiiko menetelmä? Herkkyys analyyttinen funktionaalinen (CV% 10-20) Toistettavuus (precision) intra-assay/ assay/ interassay laadunvalvonta (mittausepävarmuus) Täsmäävyys (accuracy) kalibrointi, referenssiseerumit (WHO, IUIS, CDC) laadunvalvonta

4 Toimiiko menetelmä 2? Spesifisyys antigeenin puhtaus / rekombinantti vs. natiivi kliininen spesif.: autovasta-aineiden aineiden kliininen merkitys (specificity) Interferoivat tekijät ristireaktiot, vasta-aineiden aineiden laatu heterofiiliset vasta-aineet aineet hemolyysi, lipemia, hyperbilirubinemia, RF..

5 Toimiiko menetelmä 3? Lineaarisuus tulostusalue hook-ilmiö Drift Recovery

6 Toimiiko menetelmä 4? Vertailu referenssimenetelmään tai muihin saatavilla oleviin hyväksyttyihin testeihin Viitearvot (reference limits/interval) terveet verenluovuttajat (reference sample group) ikäryhmät Potilastulokset kliinisesti diagnosoidut potilaat muita tauteja sairastavat (diseased controls)

7 ELISA-menetelmän validointi 1 Antigeeni: puhdistaminen, kaupallinen (natiivi, rekobinantti) Antigeenin konsentraatio, kiinnitys ELISA-levy Entsyymileimatut vasta-aineet aineet Puskurit: kouttaus-,, blokkaus-,, näyte- ja pesupuskurit (tausta!) Levyn tasaisuus

8 Levyn tasaisuus (CV 9.76%) 3 2,5 2 2, ,5 1,5 1, ,5 0,5 0, S1 S5 0-0,5

9 ELISA-menetelmän validointi 2 Määritysolosuhteiden testaus: pesukertojen vaikutus Kinetiikka Drift, carry over Häiritsevät tekijät ja ristireaktiot: reumafaktori, hemolyysi, lipeeminen näyte Toistuvuus: intra- ja inter-assay CV%

10 Drift Näytteet lopussa (abs) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 1,0271x R 2 = 0,9919 Drift 2 Linear (Drift 2) 0 0,5 1 1,5 Näytteet alussa (abs)

11 rttg-vert 2 1,8 1,6 y = 0,9454x R 2 = 0,9044 1,4 1,2 Eija 1 0,8 0,6 0,4 0, ,5 1 1,5 2 Liisi

12 10,300 10,300 11,200 11,200 23,600 23,600 47,100 47,100 CV% CV% 0,103 0,103 0,066 0,066 0,072 0,072 0,016 0,016 SD SD 1,001 1,001 0,590 0,590 0,305 0,305 0,034 0,034 Mean Mean 1,099 1,099 0,590 0,590 0,332 0,332 0,057 0, ,242 1,242 0,638 0,638 0,429 0,429 0,021 0, ,942 0,942 0,546 0,546 0,296 0,296 0,029 0, ,946 0,946 0,505 0,505 0,317 0,317 0,043 0, ,935 0,935 0,715 0,715 0,398 0,398 0,057 0, ,982 0,982 0,649 0,649 0,289 0,289 0,049 0, ,960 0,960 0,529 0,529 0,241 0,241 0,024 0, ,992 0,992 0,619 0,619 0,323 0,323 0,027 0, ,881 0,881 0,523 0,523 0,200 0,200 0,014 0, ,027 1,027 0,587 0,587 0,226 0,226 0,017 0, K4 K4 K3 K3 K2 K2 K1 K1 rttg rttg Interassay Interassay CV CV

13 ELISA-menetelmän validointi 3 Kalibraattori: international standard? humaani seerumi? apinan seerumi? Cut-off raja: kontrolliaineisto, viitealue Vertailu toiseen menetelmään tai kaupalliseen kittiin Kliininen validointi: sensitiivisyys ja spesifisyys ROC (Receiver Operating Characteristic) kuvaajat

14 Referenssiseerumit WHO International Reference /batch (1( 1 IU RF / 0,171 mg) WHO Preparation for Antinuclear Factor 66/233 (ANA( homog., ndna, U/ml) IUIS-ANA subcommittee / AF- CDC: 10 erilaista ANA/ENA kontrolliseerumia Juvenile Diabetes Foundation (JDF reference serum for ICA JDF-U/ml)

15 ELISA-menetelmän validointi 3 Kalibraattori: international standard? humaani seerumi? apinan seerumi? Cut-off raja: kontrolliaineisto, viitealue Vertailu toiseen menetelmään tai kaupalliseen kittiin Kliininen validointi: sensitiivisyys ja spesifisyys ROC (Receiver Operating Characteristic) kuvaajat

16 Clinical decision limit operating point (Lusted, 1968) cut-off value (McNeil et al., 1975) referent value (Galen & Gambino, 1975) diagnostic treshold (Paukee & Kassirer, 1987) decision level (Statland, 1987) critical value (NCCLS, 1992) decision limit (Solberg & Gräsbäck 1989; NCCLS 1992; Solberg 1994)

17 The basic requirements for the evaluation of clinical decision limits (Sunderman, 1975) Clear-cut definitions for the disease Demarcation of the stage in the pathogenesis of the disease Knowledge of the degree of overlap of the health and illness related data Knowledge of the prevalence of the disease Knowledge of the clinical costs, i.e. the clinical consequences of negative or positive misdiagnoses

18 ELISA-menetelmän validointi 3 Kalibraattori: international standard? humaani seerumi? apinan seerumi? Cut-off raja: kontrolliaineisto, viitealue Vertailu toiseen menetelmään tai kaupalliseen kittiin Kliininen validointi: sensitiivisyys, spesifisyys, PPV, NPV ROC (Receiver Operating Characteristic) kuvaajat

19 ttg IgA ROC 0,6 µg/ml 0,8 µg/ml 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 S e n s itiv ity 0,3 0,2 0,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 Specificity

20 rttg (EU/ml) n > <0.10 True positive Endo+ (titteri >5) Endo +/- (titteri 1) True negative Endo rttg-testin cut off >0,15 Sensitivity 74/89 = 83,10 % PPV 100 % Specificity 105/105 = 100,00 % NPV 87,50 %

21 rttg (EU/ml) n > <0.10 True positive Endo+ (titteri >5) Endo +/- (titteri 1) True negative Endo rttg-testin cut off = 0,10 Sensitivity 83/89 = 93,30 % PPV 98,80 % Specificity 104/105 = 99 % NPV 94,50 %

22 Systeemiset autoimmuunitaudit: prevalenssi SLE (ARA 1982, 1997) 11 kriteeriä; tuma- va; DNA-va, Sm-va, LE-solu, väärä positiivinen syfilisserologia [prevalenssi 0.4-1:1000] SjS (ACR, San Diego Criteria, 1998) sicca, kserostomia, ja biopsia tai SS-A [prevalenssi 2-6:1000] 2 SjS (ACR, EEC Criteria,1998) sicca, kserostomia, ei biopsiaa tai SS-A [prevalenssi 20-30:1000]

23 1000 RA (RF) Test Population Diseased Non Diseas ed Sum Prev 1 Positive Sens 80 Negat Spec 85 Sum PPV 5 % NPV 99.8 %

24 RF (CC) Population 1000 Test Diseased Non Diseas ed Sum Prev 1 Positive Sens 70 Negat Spec 95 Sum PPV 12 % NPV 99.7 %

25 RA (RF) GP 1000 Test Diseased Non Diseas ed Sum Prev 30 Positive Sens 80 Negat Spec 85 Sum PPV 70 % NPV 91 %

26 RF (CC) GP 1000 Test Diseased Non Diseas ed Sum Prev 30 Positive Sens 70 Negat Spec 95 Sum PPV 86 % NPV 88 %

27 Systeemiset autoimmuunitaudit: oireista diagnoosiin Oireet usein lieviä, epäspesifisiä ja vaihtelevia Ensioireet: usein vuosia ennen diagnoosia SLE: 2 v Sjögrenin syndr.: v Raynaud -> > perustauti selville 2 v:ssa Merkkivasta-aineet aineet vuosia ennen tautia ANA, RF, CCP, ICA, ttg, EMA, AMA

28 Testin diagnostinen sensitiivisyys ja spesifisyys Uusi kaupallinen testi usein hyvin herkkä, täten diagnostinen spesifisyys laskee Vertailu verenluovuttajiin tai muuhun terveeseen populaatioon ei riitä Testit on validoitava käyttäen vertailuaineistona muihin tauteihin sairastuneita (disease controls) Mahdollista käyttää 2 eri cut-off arvoa diagnostinen (spesifinen) taudin aktiviteetin seuranta (herkkä)

29 Wiik et al. Arthritis & Rheumatism Vol.51, 2 Pages: Copyright 2004 by the American College of Rheumatology Figure 1. Example of cut-offs for diagnostic and follow-up purposes.