Historia 1. Solubiologian juuret. Historia 3. Historia 2. Historia 5. Historia 4. Solubiologia (eläintieteen osuus) Seppo Saarela

Transkriptio

1 Historia 1 Solubiologian juuret Soluoppi eli sytologia (kreik. kytos = kotelo) Robert Hooke (1665): cellula (= solu, suom. Lönnrot) 1674 van Leeuwenhoek - kuvasi useita solutyyppejä Historia luku Schleiden ja Schwann (1838): Kaikki eläimet ja kasvit rakentuvat soluista Hertwig: Uusi yksilö syntyy kahden solun yhteensulautumisesta Mendel (1865) Historia luku Sumner (1926): Entsyymit ovat valkuaisaineita Beadle ja Tatum (1940): Mutaatiokäsite Averly (1944): DNA sisältää geneettisen informaation Watson ja Crick (1953): DNA:n rakenne kaksoishelix Historia luku elektronimikroskopia kehittyi (tosin keksittiin jo 1931) soluorganellit (Palade, Claude, de Duve 1974) 1980-luku yhdistelmä-dna, DNA:n emäsjärjestys (Berg, Gilbert, Sauger) Historia 5 Konfokaali- ja scanningelektronimikroskooppi yleiseen käyttöön 1990-luku videotekniikka mikroskopoinnissa (Allen ja Inoue) transgeenisten eläinten tuottaminen TUTKIMUSMENTELMIÄ 1

2 Solubiologisia tutkimusmenetelmiä Skaalaus Mikroskoopit 10m 1m 0.1 m 1 cm 1 mm 100 µm 10 µm 1 µm 100 nm Ihmisen pituus Eräiden hermo ja lihassolujen pituus Kananmuna Sammakon muna Kasvi- ja eläinsolut Tuma, bakteerit, mitokondrio Mykoplasma, virukset Mikroaallot (radioaallot) Infrapuna (IR) Näkyvä valo UV-valo Suurennus ja erotuskyky valomikroskooppi max 1000 x elektronimikroskooppi jopa x tärkeämpi on resoluutio eli erotuskyky 10 nm 1 nm Ribosomit, pallomaiset proteiinit, lipidit Pienet molekyylit Röntgensäteet γ-säteet Valomikroskoopin periaate Valomikroskooppi Hooke, van Leeuwenhoek 1600-luku objektiivi yl x okulaari 4-16 x kondensori kohdistaa valon, useita osalinssejä suurennus = obj x okul. TUTKIMUSMENTELMIÄ 2

3 Resoluutio eli erotuskyky Resoluutio 2 Resoluutio paranee, kun aallonpituus lyhenee tai objektiivin numeerinen apertuuri kasvaa Objektiivin numeerinen apertuuri kasvaa, kun objektiivin avautumiskulma kasvaa Objektiiveja, joiden NA jopa 0.95 Resoluutio 3 Immersioöljyä (taitekerroin sama kuin objektiivilla) käyttämällä objektiivin ja kohteen välissä taitekerroin paranee. NA voi olla jopa 1.4 Näin mikroskoopin erotuskyvyn max 1/3 käytetyn valon aallonpituudesta r 0.2 µm mitokondriot voi erottaa pistemäisinä Resoluutio 4 Elektronivuon aallonpituus 10 pm erinomainen erotuskyky Fluoresenssimikroskooppi Valonsäde valolähteestä kulkee ekskitaatiosuotimen kautta (musta viiva) Näytteen valaiseminen tämän valonsäteen avulla saa aikaan molekyylien fluoresenssin (elektronien virittyminen), emittoituu ja lähettää valoa pitemmällä aallonpituudella (sininen) Fluoresenssimikroskooppi Näytteeseen kohdistetaan UV-valoa ( nm) objektiivin jälkeen UV leikataan pois suotimella fluorisoiva aine näkyy vihreänä (fluorisoivat värit) TUTKIMUSMENTELMIÄ 3

4 Fluoresenssimikroskopia 1 Fluoresenssimikrograafi osoittaa pitkien aktiinisyiden jakautumisen fibriblastisoluviljelmässä Ihmisenihonfibroblasteja käsiteltiin ensin detergentillä ja sitten värjättiin antiaktiini antibodylla Fluoresenssimikroskopia 2 Hiiren lisäkives: suurennus 1.25x40 (Ahti Pyörnilä) Fluoresenssimikroskopia 3 Fluoresenssimikroskopia 4 Osoittaa sympaattisten hermopäätteiden (noradrenergisten) esiintymisen Metsäsopuli (Myopus schisticolor), ruskea rasvakudos (BAT), suurennus 10x100x1.25 (Ahti Pyörnilä ja ) Helmipöllön sydän: Noradrenaliinin fluoresenssi, 10x40x1.25 (Ahti Pyörnilä) Fluoresenssimikroskopia 5 Heat shock proteiinin ekspressoituminen C. elegans mutantissa. Fluoresenssiajastin Proteiini, joka vaihtaa väriä ajan funktiona Pimeäkenttämikroskooppi Vain kohteen rajapinnoista siroava valo päästetään ohjektiiviin Tumma tausta voidaan erottaa pienempiä kohteita Terskikh et al. (2000) Science 24 Nov TUTKIMUSMENTELMIÄ 4

5 Faasikontrastimikroskooppi Vaihevastakohtamikroskooppi Näytteen läpi kulkeneeseen valoon aiheutetaan 1/4- aallon vaihe-ero yhdistetään sironneeseen valoon vaihe-erot muuttuvat amplitudieroiksi kontrasti kuvan osien välille Faasikontrastimikroskooppi Optiikka Suora valo mustalla Näytteestä lähtenyt hajavalo punaisella Interferenssimikroskooppi Kaksi sädettä: näytteeseen ja näytteestä ohi Säteiden yhdistäminen vaihe-ero amplitudiero Muistuttaa faasikontrastia, mutta antaa 3D-vaikutelman Mikrograafeja Fibroblasti kudosviljelmässä: Valomikroskopia ilman värjäystä Faasikontrastimikroskopia Interferenssikontrastimikroskopia Pimeäkenttämikroskopia KONFOKAALIMIKROSKOPIA Biologian laitoksen konfokaalimikroskooppi Konfokaalimikroskoopilla saadaan laservalo keskitetyksi hyvin tarkkaan yhdelle optiselle tasolle, jolloin sen pyyhkäisy antaa kuvan kyseisestä solutasosta. Ottamalla kuvia peräkkäisistä leiketasoista voidaan tiettyjen matemaattisten algoritmien avulla suodattaa kuvista pois kuvia vääristävä informaatio. Näin optimoitujen tasokuvien avulla voidaan seuraavaksi tehdä kohteesta kolmi-ulotteinen mallinnos, jota voidaan vapaasti pyörittää kaikissa suunnissa. Katja Anttila, 2004 Zeiss LSM5 Pascal Photo: Joose Kankare TUTKIMUSMENTELMIÄ 5

6 Vesikanava Vesikanava kaksoisvärjäyksellä Rotan jalkapohjan poikkijuovainen lihassolu Vesikanava näkyy vihreänä Z-levyn prot. näkyy punaisena Mika Kaakinen, 2004 Mika Kaakinen, 2004 Elektronimikroskooppi Valolähteenä elektronisuihku (katodisädeputki), jännite kv vaikuttaa aallonpituuteen ja erotuskykyyn Linsseinä magneetit Kuva syntyy fluorisoivalle kalvolle (vrt. TV) TEM eli transmissio-em, läpivalaisuelektronimikroskooppi - leikkeet - elektronien absorptio Pyyhkäisy-EM (SEM) Scanning-EM Soveltuu pintojen kuvaamiseen Ei linssejä Kuva muodostuu piste pisteeltä suihkun pyyhkiesssä ( scanning ) näytteen pintaa Syntyy sekundaarielektroneja Scanning electron microscope Pyyhkäisyeletronimikroskooppi Kuva syntyy sekundaarielektronien avulla, jotka emittoituvat näytteeseen Vahvistetaan tuikekiteen ja vahvistimen avulla monitorille Näytteen pinta päällystetään esim. kullalla Valo- ja elektronimikroskoopin optiset järjestelmät Valomikroskooppi käyttää näkyvää valoa ja linssejä kuvanmuodostukseen Kuva silmän verkkokalvolle, filmille tai videokuvaksi sähköiseen muotoon EM käyttää elektronisuihkua, joka emittoituu fluorisoivalle kalvolle tai filmille TUTKIMUSMENTELMIÄ 6

7 Elektronimikroskoopit (TEM, SEM) SEM-kuva Vasemmalla TEM:N periaate ja oikealla SEM:n periaate TEM:n periaate muistuttaa valomikroskooppia SEM:ssä näytettä pommitetaan elektroneilla ja sen jälkeen mitataan niiden sirontaa näytteen pinnasta Kesykyyhkyn väive Näytettä on rutisteltu pinseteillä! Riitta Harjula SEM-kuva SEM-kuva Potnapekan pää Ampiaisen jalan karvoja Riitta Harjula SEM-kuva Paramecium eri mikroskoopeilla kuvattuna Kirva Valomikroskoopissa SEM TUTKIMUSMENTELMIÄ 7

8 Paramecium Analyyttinen-EM Elektronimikroskooppikuva (TEM) Alkuaineiden pitoisuudet näytteistä High Performance Liquid Chromatography Photo: Joose Kankare TUTKIMUSMENTELMIÄ 8