Mikroskopiatekniikat

Transkriptio

1 Matti Airaksinen 2013 Mikroskopiatekniikat mikros kr pieni nanos kr kääpiö Valon taittuminen ja linssin numeerinen aukko (NA) valon taittumislaki (Snell) -> NA = n*sin n= c/v= (väli)aineen taittokerroin (refractive index) Ilma n~1.0, vesi n~1.3, öljy n~1.5 1

2 Valon siroaminen (diffraktio) rajottaa mikroskoopin erottelukykyä Pistemäinen objekti muodostaa kuvatasoon ns. Airy disc point spread function (PSF) Erottelukyky (r = kahden eroteltavissa olevan pisteen välinen lyhin etäisyys): r ~ /2*NA aallonpituus NA = numeerinen aukko lyhyt aallonpituus + objektiivin suuri NA -> paras erottelukyky 1 Airy unit Mikroskoopin erottelukyky Shortest resolvable distance (r) between two points: Resolution r ~ /2*NA Valomikroskooppi r ~0.2 m (sininen valo, NA1.4, öljy) Bright-field, dark-field, phase contrast Fluorescence Confocal and 2-photon (->optical sections) Superresolutio-fluoresenssimikroskooppi STORM, structured illumination, etc. r jopa <10 nm Elektronimikroskooppi electron ~5 pm, E=100 kv) r ~2 nm (jopa alle 0.1 nm) Superresolution 2

3 Optinen läpivalomikroskooppi Rakenne ja valotien reitti Valolähde 1 Kenttähimmennin 2 Kondensori 3 Ristisiirtopöytä 4 Objektiivit 5 Tubus 6 Okulaarit 7 Kamera Valotien säätö eli Köhleröinti: 2 Valotien keskitys tasaiseksi kattamaan koko näkökentän 1 Tärkeä kuvan laadun suhteen Optinen läpivalomikroskooppi Pystymikroskooppi Kudosleikkeet valotie alhaalta ylös Käänteismikroskooppi Soluviljelmät valotie ylhäältä alas 3

4 Yleisesti käytetyt kontrastimenetelmät Kudokset ja solut ovat transparentteja tarvitaan kontrastia Histokemialliset värjäykset esim. hematoksyliini ja eosiini ABC Immunohistokemia: immunoperoksidaasi (ABC) ja immunofluoresenssi (IFL) spesifisten proteiinien detektio vasta-aineilla Optisiin kontrastimenetelmiin perustuvat esim. faasi- ja interferenssikontrasti ja pimeäkenttä IFL Faasikontrasti Interferenssi (DIC) IFL Fluoresenssin muodostus ja ominaisuudet UV VIS IR Fluoresenssi on molekyylin ominaisuus absorboida valoa tietyllä aallonpituudella ja emittoida valoa toisella (yleensä pidemmällä) aallonpituudella Fluoresoiva aine = fluorokromi/fluorofori 4

5 Fluorokromin eksitaatio- ja emissiospektri ja aallonpituuksien suodatus Stokesin siirtymä (stokes shift) on fluoresoivan aineen eksitaatio- ja emissiomaksimien erotus. Mitä suurempi siirtymä, sitä parempi. Edesauttaa useiden fluorokromien samanaikaista detektiota Detektiota varten tarvitaan suodatusta: Tyypillisen fluoresenssimikroskoopin filtteriblokissa on: eksitaatiosuodin, dikromaattinen peili ja emissiosuodin Fluorokromin intensiteetin väheneminen Huomioitava intensiteettiin perustuvissa mittauksissa Photobleaching Fluoresoivan molekyylin palautumaton dekompositio Käytetään esim. FRAP tekniikassa 0 min 2 min 4 min 6 min 8 min 10 min Quenching Emittoivien fotonien vähyys tai puute interaktoivien molekyylien resonanssin seurauksena Käytetään esim. FRET tekniikassa Bleaching fluorokromi eksitoituu ja emittoi fotoneita keskimäärin 50,000 x ennen dekompositiota. Sininen: DAPI tuman DNA, Vihreä: Phalloidin aktiinisäikeet, Punainen: MitoTracker - mitokondriot 5

6 Fluorokromit solujen kuvantamisessa Konjugoidut vasta-aineet Mikä tahansa vasta-aine (Ig) voidaan konjugoida Tyypillisesti sekundaarivasta-aine (esim. anti-rabbit-fitc) Immunosytokemia Synteettiset fluoresoivat tagged yhdisteet monille tukirakenteille ja organelleille esim. fluoresiova-phalloidin, DAPI Green fluorescent protein (GFP) variantit Solujen transfektio geeniekspression analysointi, dynaamisten solutapahtumien mittaus, jne. Yleensä ei merkittävää toksisuutta soluille Konfokaalimikroskooppi Fluoresenssimikroskooppi, jossa neulanreikä (pinhole) detektorin edessä -> vain fokuksessa oleva emissio pääsee läpi skannaus: valaistaan (eksitaatio) ja detektoidaan vain yhtä pistettä kerrallaan Laser-valonlähde(=riittävä pistemäinen valo) mahdollistaaoptiset leikkeet ja 3D-kuvantamisen 6

7 Konfokaalimikroskoopin resoluutio Konfokaalimikroskopin lateraalinen (xy) resoluutio ( ex /NA) on ~1.6 x parempi kuin tavallisen mikroskoopin ( em /NA) Aksiaalinen (z) resoluutio on 3-4x huonompi! Esim. ex. 488 nm ja 1.4 NA objektiivi: xy-resoluutio = 140 nm. Optimaalinen xy-sampling frequency 1/2r => 70 nm (pikselikoko) Optimaalinen z-sampling frequency on 265 nm (vokselikoko) Optimal Suboptimal z-sampling 3D kolokalisaatio Esim. kollageenin tuotannon säätely mesenkymaalisissa kantasoluissa Procollagen I Hsp47 Colocalization channel Miten kolokalisaatio mitataan? Optinen leike (x-z) solun endoplasmisesta retikulumista -> Pearsonin korrelaatiokerroin on 0.70 Mika Hukkanen/BIU 7

8 Erilaisia 3D fluoresenssi mikroskooppeja Confocal 2-photon Structured illumination Spinning disc Light sheet Fischer et al 2011 TICB Multifotonimikroskopia Sisäkorva F-aktiini/DAPI (THEP) Erityisesti elävien organismien solutason rakenteiden ja toiminnan kuvantaminen Mahdollistaa kuvantamisen myös ilman fluoresoivia leimoja Perustuu lyhytpulssisilla lasereilla saavutettavaan korkeaan intensiteettiin, joka aiheuttaa epälineaarisia ilmiöitä valon vuorovaikuttaessa kohteena olevan materiaalin kanssa (yhtäaikaiset matalaenergiset fotonit eksitoivat) Signaali syntyy vain fokuspisteessä korkea syvyystarkkuus Hyödyt verrattuna normaaliin konfokaalimikroskopiaan Kuvantaminen syvemmälle kudokseen (infrapunavalon alhaisempi absorptio) Elävän kudoksen pidempiaikainen kuvantaminen fluoresenssi heikkenee hitaammin (bleaching) vähemmän fototoksuutta Sydänläpän kollageeni (SHG) Menetelmä Englanninkielinen nimi Leiman käyttö Sovellusesimerkkejä Kaksifotonifluoresenssi Taajuuden kahdennus Taajuuden kolmennus Koherentti Raman Mika Hukkanen/BIU Two-photon excited fluorescence (TPEF) Second harmonic generation (SHG) Third harmonic generation (THG) Coherent anti-stokes Raman scattering (CARS) Kyllä (myös autofluoresenssi) Ei Ei Ei (myös Ramanaktiiviset leimat) Fluoresoivat proteiinit ja merkkiaineet, autofluoresenssi Lihassäikeet ja kollageeni Lipidi-vesirajapinnat solukalvojen ja sytoplasman välillä Molekyylispesifinen kuvantaminen, erityisesti lipidit Rasvasolun lipidipisarat (CARS) 8

9 Light-sheet mikroskopia Fluoresenssiin perustuva tomografinen tekniikka Ohuen optisen leikkeen eksitaatio laserilla Emissio kerätään herkällä kameralla Hyödyt verrattuna normaaliin fluoresenssikuvantamiseen Pienten organismien (embryot) 4D analysointi Minimaalisen fototoksinen, voidaan kuvantaa yhtäjaksoisesti jopa useita päiviä OpenSPIM light-sheet mikroskooppi Sovellusesimerkkejä Morfogeneesi ja organogeneesi Solujen dynaamiset vuorovaikutukset ja solumigraatio Malliorganismit ja biomateriaalikonstruktit Molekyylispesifinen kuvantaminen, transfektiot ja fluoresoivat proteiinit Hybridimenetelmät Voidaan yhdistää multifotonieksitaation kanssa, parantaa valon penetraatiota syviin kudoksiin Voidaan yhdistää superresoluutiotekniikoiden kanssa, parantaa spatiaalista resoluutiota Voidaan yhdistää fluoresenssikorrelaatiospektroskopian kanssa, konsentraatio- ja fluoresoivien partikkelien diffuusion mittaus Voidaan yhdistää fluoresenssin lifetime mittausten kanssa, antaa tietoa proteiinien vuorovaikutuksista Drosophila melanogaster embryon kehitys (Tomer et al., Nature Methods 2012;9: ) Superresoluutio mikroskopia Valomikroskoopin resoluutio voi parhaimmillaan olla vain noin puolet käytetyn valon aallonpituudesta, näkyvän valon alueella siis noin 200 nm Vaikka tätä rajaa ei voi rikkoa se voidaan kiertää Menetelmät perustuvat fluoresenssileimatun näytteen valaisemiseen, kuvaamiseen ja/tai kuvan käsittelyyn eri keinoin Menetelmästä riippuen voidaan saavuttaa 2-20 resoluution parannus Menetelmä Structured Illumination Microscopy (SIM) Structured Emission Depletion (STED) Stochastical Optical Reconstruction Microscopy (STORM) Ominaisuudet Valaistuksen ja Moirén kuvioihin perustuva menetelmä. Nopea ja soveltuu hyvin elävien solujen kuvantamiseen mutta resoluutio vain noin 100 nm. Konfokaalimikroskopiaan perustuva menetelmä. Kuvausnopeus ja käyttömukavuus kuten konfokaalimikroskopiassa. X-Y resoluutio noin nm mutta Z resoluutio ei juuri parane. Yksittäisten fluoroforien lokalisaatioon perustuva menetelmä. Lopullinen kuva syntyy tuhansien tai kymmenien tuhansien kuvien analyysin summana. Erittäin hidas mutta lopullinen resoluutio voi olla jopa 10 nm 9

10 Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) Vain pieni osa fluoroforeista aktivoidaan kerrallaan ja niiden paikka kuvataan Fluoroforit saatetaan fluoresoimattomiksi suuritehoisella pidemmän aallonpituuden laserilla ja aktivoidaan heikolla lyhyemmän aallonpituuden laserpulssilla Jokaisen yksittäisen fluoroforin tarkka lokalisaatio approksimoidaan normaalijakautumalta Lopullinen kuva kootaan tuhansien kuvien analyysien summana Fischer et al 2011 TICB Solun tukiranka Mikrofilamentti mikrotubulus välikokoinen säie 10

11 Superresolution fluorescence microscopy Aktiinin säännöllinen järjestyminen hermosäikeessä (STORM) Xu et al. (2013) Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science Cultured hippocampal neurons fixed with glutaraldehyde, permeabilized and blocked with Triton X normal serum, stained with MAP2 antibody and Alexa647- conjugated phalloidin (=actin binding protein) Elektronimikroskopia Läpäisy-EM (transmission, TEM) elektronisuihku kohdistetaan ohuen näytteen pintaan, läpimenneet elektronit muodostavat kuvan fluoresoivalle levylle Näyte värjätään raskasmetalleilla Immuno-EM (kultaleimattu vasta-aine) Pyyhkäisy-EM (scanning, SEM) näytteen pintaa skannataan elektronisuihkulla, takaisinsironneet elektronit muodostavat kuvan Näyte päällystetään raskasmetallilla 11

12 GE Palade RER

13 Sisäkorvan stereosilioita skoopilla pyyhkäisy-elektronimikroskoopilla Normarskitekniikalla läpivalaisu- elektronimikro- Sukkulamadon 302 hermosolun välisten yhteyksien piirikaavio (koottu peräkkäisistä EM-leikkeistä) 1 mm 13

14 Ihmisen aivojen rakenne on mutkikas ~10 11 hermosolua >10 14 synapsia Piirikaavio? Lichtman & Denk 2011 Science Aivojen piirikaavio Automatisoitu pyyhkäisy-elektronimikroskopia Ennen Nyt Denk & Horstmann 2004 PLOS Biol; Gatan/Zeiss Inc 14

15 Hermosolujen geneettinen värimerkintä eläinmallissa Hiiren hippokampus Seeprakalan aivot Lichtman, Sanes et al Nature Rev Neurosci, Pan et al 2011 CSH Protoc 15

16 Mikroskopia demot Mika Hukkanen&Mikko Liljeström/BIU Max 6 hloä/ryhmä (ilmottautumislista opintotoimistossa) x7 Tapaaminen 1 krs päähissien edessä Biologisten ilmiöiden ajallinen resoluutio elävien solujen toimintojen kuvantaminen Kuvantamisnopeus täytyy suhteuttaa tutkittaviin ilmiöiden nopeuteen Esimerkki Ca2+ transientit Proteiinien diffuusio Vesikkelien liike Mitoosi Apoptoosi Haavan paraneminen Aikaskaala Millisekunnit Millisekunnit-sekunnit Sekunnit Minuutit Tunnit Kymmenet tunnit Korkea kuvantamisnopeus vaatii menetelmän yksinkertaistamista Vähän kontrolloitavia mikroskoopin mekaanisia osia sekä datasiirron optimointi Uudet nopeat resonanssiskannerit jopa 250 kuvaa/ s > 512x32 formaatti Erikoiskameroilla jopa monta tuhatta kuvaa/ s 16

17 Solumigraatio ja organellien liikkeet Liikeratojen geometria ja fluoresenssin lifetime 1) Perustuu ratojen geometriaan 3D x-y-t solumigraatio - DIC 3D x-y-t intrasellulaariset partikkelit 4D x-y-z-t perinukleaariset mitokondriat Mitattavat parametrit: Aika (sekunnit minuutit), kuljettu matka (um), nopeus (nm/s), kiihtyvyys (nm/s2), suuntaisuus (tukirankavälittenen kuljetus; ratio) ja näihin perustuvat diffuusioparametrit 2) Perustuu fluoresenssin lifetime mittauksiin Parametrit: Tapahtumien määrä ja fokustasossa pysymisen aika (ms - s), fluoresenssin intensiteetin muutokset, käytetään diffuusiodynamiikan ja suhteellisten konsentraatioiden mittauksiin Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) Esim. Proteiinin diffuusion ja kiertoajan (turnover) nopeus FRAP perustuu prebleach-postbleach kuvantamiseen Ctrl ROIs Pre-bleach Bleach - zoom Post-bleach Post-bleach Plateu - recovery t 1/2 - half-time recovery Nonlineaarinen regressioanalyysi 17

18 Objektiivin merkinnät Taittovirheen korjaus (aberraatiot) Numeerinen apertuuri (resoluutio) Mahdollinen kontrastimenetelmä Peitinlasin paksuus Työskentelyetäisyys (mm) Mahdollinen immersioneste - öljy 18