Jlkais J1/001
MITTATEKNIIKAN KESKUS Jlkais J1/001 MIKROBIOLOGIAN KVANTITATIIVISTEN VILJELYMÄÄRITYSTEN MITTAUSEPÄVARMUUS Seppo I. Niemelä KEMIAN JAOSTO Mikrobiologian työryhmä Helsinki 001
ALKUSANAT Mikrobiologisten mittasten epävarmstekijöistä ja virhelähteistä on rnsaasti havaintoja ja analyyseistä vastssa olevat mikrobiologian asiantntijat pyrkivätkin ottamaan epävarmden homioon tlosten tlkinnassa. Tämä on kitenkin yleensä sormitntmaan perstvaa, koska täsmällisiä virhe-estimaatteja ei ole ollt riittävästi käytettävissä. Metrologian nevottelknnan kemian jaoston mikrobiologian työryhmä laati selvityksen mikrobiologisen metrologian tilanteesta ja esitti kehittämissnnitelman (Mittatekniikan keskksen jlkais J5/1999). Tässä raportissa tärkeänä kehittämiskohteena esitettiin oppaan laatimista mikrobiologisten menetelmien mittasepävarmdesta. Professori emerits Seppo Niemelä, jolla on kymmenien vosien kokems kvantitatiivisista mikrobiologisista mittaksista ja niitä koskevasta mittasepävarmdesta, on laatint yhteistyössä mikrobiologian työryhmän kanssa tämän oppaan. Oppaan ohjeiden avlla on mahdollista laskea nmeeriset arvot mikrobiologisten viljelymenetelmien näytekohtaisille mittasepävarmksille. Lisäksi on mahdollista korjaskertoimien avlla laskea tlokset siten, että systemaattiset virheet on otett homioon. Eri virhelähteiden keskinäisen merkityksen esiin saaminen antaa viitteitä siitä, miten mittasten lotettavtta tlisi parantaa. Mikrobiologian työryhmä toivoo oppaan tlevan laajaan käyttöön ja osaltaan edistävän mikrobiologista analytiikkaa. Helsingissä 5.10.000 Maarit Niemi Mikrobiologian työryhmän polesta Jlkais J1/001
ESIPUHE Tämä opas palvelee ensisijaisesti ns. rtiinimäärityksiä, missä ttkimksen tilaaja yleensä saa laboratoriolta yhden mittastloksen näytettä kohti. Tlokseen haltaan liittää epävarmden arvio. Tarkoitksena on tarjota persteet epävarmden arvojen laskemiseksi ja ilmaisemiseksi. Jotta kirjoits ei paisisi liikaa, oli tietoinen valinta jättää vaille persteellista käsittelyä tilastomenettelyt, joita soveltaen laajoista koemateriaaleista voidaan eristää erilaisia epävarmskomponentteja. Mikrobien tnnists on monien mikrobiologisten laboratorioiden keskeinen analyysityyppi ja siihen liittyy homattavaa epävarmtta. Tnnists ei kitenkaan ole rinnastettavissa varsinaisiin mittaksiin ja on jätetty tämän oppaan lkopolelle. Sen epävarms on ilmaistavissa vain tnnistksen ja erotteln todennäköisyyksinä. Tnnistksen ja miden kompleksisten 'mittasten' epävarms ansaitsee oman monografiansa. Tässä kirjoitksessa käsitellään ainoastaan lkmääriin perstvia mittastloksia. Metrologian nevottelknta on valtionevoston asettama asiantntijaelin, joka toimii kappaja teollissministeriön, trvatekniikan keskksen ja Mittatekniikan keskksen apna metrologisten asioiden käsittelyssä. Sen alaisdessa toimii kemian jaosto, joka on perstant mikrobiologian työryhmän. Tämän oppaan laatimisessa on avstant mikrobiologian työryhmän perstama mittasepävarmstyöryhmä, johon klivat prof. Seppo Niemelä pheenjohtaja, Svi Bühler (HYKS Diagnostiikka), Sari Hemminki (Trvatekniikan kesks), Seija Kalso (Helsingin ympäristökesks) ja Antti Nissinen (Keski-Somen keskssairaala) jäseninä sekä Maarit Niemi sihteerinä. Kommentteja oppaan lonnokseen on antant myös mittasepävarmspaja, johon osallistivat epävarmstyöryhmän pheenjohtaja ja sihteerin lisäksi Seija Kalso, Kirsti Lahti (Somen ympäristökesks), Tla Pirhonen (Eläinlääkintä- ja elintarvikelaitos) ja Pirjo Rajamäki (Helsingin yliopisto, soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos). Jlkais J1/001
SISÄLLYSLUETTELO ALKUSANAT ESIPUHE 1 MITTAUSEPÄVARMUUS, MITTAUSTULOS JA MITTAUS 11 1.1 Kirjainsymboliikka 11 1. Mittasepävarmden ilmaiseminen 11 1..1 Sret mittastlos- ja epävarmsarvot mikrobiologiassa 1 1.. Merkitsevät nmerot 13 MITTAUSEPÄVARMUUDEN MÄÄRITYSPERIAATTEET 14.1 Perstyyppi A 14. Perstyyppi B 14.3 Yhdistetty epävarms 15.4 Epävarmskomponenttien tietolähteet 15.4.1 Tasainen jakama 16.4. Kolmiojakama 16 3 MIKROBIOLOGISET KVANTITATIIVISET VILJELYMENETELMÄT METROLOGISELTA KANNALTA 18 3.1 Viljelymääritysten yhteinen perskaava 18 3. Metrologiset tyypit 18 3..1 Yhden maljan instrmentti 18 3.. Monen maljan instrmentti 19 3..3 Yhden ptkisarjan MPN-instrmentti 0 3..4 Usean laimennstason MPN-instrmentti 0 3.3 Varmistett mittastlokset 0 3.4 Eri metrologisten tyyppien yhdistetty epävarms. Periaatteet. 1 3.4.1 Lkemaepävarms 4 YHDISTETYN EPÄVARMUUDEN MATEMAATTINEN KOOSTAMINEN 3 4.1 Riippmattomien mttjien yhdistelykaavat 3 4.1.1 Smmamttjan (A+B) standardiepävarms 3 4.1. Erotsmttjan (A-B) standardiepävarms 4 4.1.3 Tlomttjan (AB) standardiepävarms 4 4.1.4 Osamäärämttjan (A/B) standardiepävarms 4 4. Keskihajonta, shteellinen keskihajonta ja logaritmit 5 4..1 Asteikkomnnokset 5 4.. Shteellinen ja prosentaalinen ilmais 5 4..3 Esimerkki asteikkomnnoksista 5 5 MIKROBIOLOGISTEN VILJELYMÄÄRITYSTEN LASKUKAAVAT JA MATEMAATTISET EPÄVARMUUSMALLIT 7 5.1 Laimennskerroin ja sen epävarms 7 5.1.1 Kvitteelliset laimennskertoimet f ja F 7 5.1. Kvitteellisten laimennskertoimien f ja F epävarms 8 5.1.3 Laimennskertoimen (F) systemaattinen harha ja sen korjas. Todellinen laimennskerroin F' ja sen epävarms 9 5. Varmistvden (p) epävarms 9 5.3 Kvantitatiiviset mikrobipitoissestimaatit ja niiden epävarms 31 Jlkais J1/001
5.3.1 Yhden maljan instrmentti 31 5.3. Monen maljan instrmentti 3 5.3.3 Yhden laimennstason MPN-instrmentti 33 5.3.4 Usean laimennstason MPN-instrmentti 35 6 OIKOTIE MONIMALJAISEN MITTALAITTEEN EPÄVARMUUTEEN 37 7 YKSITTÄISTEN EPÄVARMUUSKOMPONENTTIEN ARVIOIMINEN 39 7.1 Lkemaepävarms 39 7.1.1 Monen maljan yhdistetty lkemaepävarms Z 39 7. Yhden pesäkelkmäärän c hikkastilastollinen hajonta 39 7.3 Pesäkesmman C hikkastilastollinen hajonta 40 7.4 Siirrostilavden (v) volmetrinen epävarms 40 7.5 Siirrostilavksien smman (V) volmetrinen epävarms 41 8 SYSTEMAATTISET KORJAUKSET JA NIIDEN EPÄVARMUUS "TÄYDELLISET" MALLIT 4 8.1 Korjasten lonne 4 8. Todellinen laimennskerroin F' 43 8.3 Varmistvs p 43 8.4 Henkilökohtainen saaliskerroin K H 43 8.4.1 Vertailna erehtymätön ekspertti 43 8.4. Vertailna keskiarvotlos 44 8.5 Laboratorion yhteinen lkemaepävarms 44 8.6 Näytteen säilytyksestä johtva pitoissmtos. Stabiilisskerroin K S ja sen epävarms 45 8.7 Kasvalstan saaliskerroin K A 45 8.7.1 Ulkoiset vertailnäytteet 45 8.7. Valikoimaton/valikoiva-kerroin 46 8.8 Kohteen (materiaalin) epätasaiss. Korjaskerroin K M 46 8.9 Peittokorjaskerroin 47 8.10 Lkemakorjaskerroin 48 9 ESIMERKKEJÄ. YKSITTÄISTEN EPÄVARMUUSKOMPONENTTIEN ARVOT 49 9.1 Yhden pesäkelkmäärän hikkastilastollinen hajonta 49 9. Maljasarjan pesäkelksmman hikkastilastollinen hajonta 49 9.3 Henkilökohtainen lkemaepävarms 49 9.4 Laboratoriokohtainen lkemaepävarms 51 9.5 Henkilökohtainen saaliskerroin ja sen epävarms 5 9.5.1 Vertailna erehtymätön ekspertti 5 9.5. Vertailna keskiarvotlos 53 9.6 Siirrostilavksien smman epävarms 53 9.6.1 Ilman lisälaimennsta 53 9.6. Lisälaimenns mkana 54 10 ESIMERKKEJÄ. MITTAUSTULOKSEN YHDISTETYN EPÄVARMUUDEN LASKEMINEN 55 10.1 Yksi malja, laimentamaton näyte 55 10. Yksi malja, laimennett näyte 55 Jlkais J1/001
10.3 Monta maljaa, laimennett näyte 57 10.4 Monta maljaa, oikotie epävarmteen 58 10.5 Monta maljaa, "täydellisesti" korjatt mittastlos 60 10.6 Yhden ptkisarjan MPN 6 10.7 Monen ptkisarjan MPN 63 11 KIRJALLISUUTTA 64 LIITE A. Talkko eri lähteistä kootista epävarmstekijöiden arvoista 65 LIITE B. Erilaisten materiaalien ja lonnon kohteiden hajonta-arvoja 66 LIITE C. BASIC-kielinen ohjelma yhteensopivsindeksin G laskemiseksi 67 LIITE D. Tloslomake 69 Jlkais J1/001
11 1 MITTAUSEPÄVARMUUS, MITTAUSTULOS JA MITTAUS Mittasepävarms on metrologian pers- ja yleistermien sanaston mkaan (SFS 3700:1998) mittastlokseen liittyvä parametri, joka kvaa mittassreen arvojen oletetta vaihtela. Se on keskihajonnan tyyppinen sre, jonka määrittämiseksi on kaksi päämenetelmää. Niistä käytetään nimityksiä A ja B (ks. ). Termi mittastlos varataan tässä kirjoitksessa tarkoittamaan lopllista lkarvoa, joka analyysiprosessin päätteeksi ilmoitetaan ttkimksen tilaajalle. Mittastlos ja sen epävarms ovat yhdistelmä seista mittaksista tai havainnoista ja niiden epävarmdesta. Termiä mittas käytetään tarkemmin määrittelemättä eri tasoilla. 1.1 Kirjainsymboliikka Mittasepävarmtta koskevissa oppaissa (ISO 1995, Erachem 1995) on valitt kirjainsymboli (standard ncertainty) kvaamaan yllä esitettyä parametria silloin kn se srdeltaan vastaa jakaman keskihajontaa. Siitä käytetään nimitystä standardiepävarms. saattaa kitenkin yhtä hyvin tarkoittaa shteellista keskihajontaa (vaihtelkerrointa). Tässä kirjoitksessa on tehty se poikkeava ratkais, että shteellisen keskihajonnan tavalliset akronyymit (RSD tai CV) korvataan johdonmkaisesti symbolilla, kn taas kokeellisesti todetlle, mittastloksen kanssa samaa laata olevalle standardiepävarmdelle (otoskeskihajonnalle) käytetään sen perinteistä symbolia s. Kn mittastloksen epävarms saadaan yhdistelemällä monen osatekijän mittasepävarmdesta, phtaan yhdistetystä standardi epävarmdesta. ISO (1995) ja Erachem (1995) ilmaisevat sen alaindeksillä c (combined standard ncertainty, c ). Tässä oppaassa alaindeksi c varataan mihin tarkoitksiin ja korvataan y:llä mittastloksen yhdistettyä epävarmtta ilmoitettaessa. Syynä on se, että jatkossa lopllista mittastlosta kaikkien laimenns- ym. korjasten jälkeen merkitään y:llä. Erityisesti silloin, kn mittastlosta käytetään terveyteen tai trvallisteen liittyvässä päätöksenteossa, on aiheellista antaa epävarmden arvo, joka kattaa homattavan osan koko odotettavissa olevasta havaintojokosta. Silloin käytetään ns. laajennetn epävarmden (expanded ncertainty) käsitettä. Laajennetta epävarmtta merkitään yleensä isolla kirjaimella U. Se tarkoittaa epävarmtta, joka saadaan kertomalla yhdistetty standardiepävarms c kattavskertoimella k. Käsite on ska lottamsväliajattellle. Noin 95 % odotettavissa olevasta vaihtelsta sisältyy laajennetn epävarmden piiriin silloin, kn kattavskertoimelle valitaan arvo. Tässä oppaassa laajennett epävarms merkitään kirjaimella S ja sen shteellinen arvo kirjaimella U. 1. Mittasepävarmden ilmaiseminen ISO (1995) esittää neljä tapaa ilmaista mittastloksen mittasepävarms. Näistä ainoastaan kolmea ensimmäistä sositellaan käytettäväksi standardiepävarmden yhteydessä. Jlkais J1/001
1 Olkoon mitatt esimerkiksi bakteeripitoisden arvoksi y ja sen yhdistetyksi standardiepävarmdeksi s y. Vaihtoehtoiset tavat ovat (slkeissa olevat sanat voi jättää pois): 1) y 150 ml -1 (yhdistetyllä standardiepävarmdella) s y 500 ml -1. ) y 150(500) ml -1, missä slkeisiin merkitty lk tarkoittaa mittaksen yhdistettyä standardiepävarmtta s y kohdistettna ilmoitetn tloksen kolmelle viimeiselle nmerolle. 3) y 150(500) ml -1, missä slkeisiin merkitty lkarvo on (yhdistetty standardiepävarms) s y ilmaistna mittastloksen yksiköissä. Edellä esitettyjä lontevampaa mikrobiologisten tlosten yhteydessä olisi epävarmden ilmaiseminen shteellisena y tai prosentaalisesti 100 y %. Esimerkiksi y 150 ml -1 ( y 40 %) on sositeltava tapa. Jos mittasarvoon haltaan liittää laajennett epävarmden arvo U, voi olla tarpeellista hyvinkin seikkaperäisesti selostaa mistä epävarmden arvo on peräisin. Esimerkiksi seraavaa tapaa sositellaan: y (6400±160) ml -1, missä ± merkin jälkeinen lkarvo on (laajennett epävarms) S ks y arvioitna pesäkelkmäärään 64 liittyvästä Poisson-jakaman standardiepävarmdesta s 8 ml -1 ( 0,15), siirrostilavden shteellisesta standardiepävarmdesta 0,0 ja kattavskertoimesta k. Yhdistetty epävarms saattaa koosta yli kymmenestäkin tnnistettavissa olevasta osasta. Niiden kaikkien letteleminen edellä osoitettn tapaan käy ajan oloon hankalaksi. Siinä tapaksessa, että yhdistetty epävarms rakennetaan osistaan on parasta esittää eri komponenttien arvot lettelomaisesti tloslomakkeessa, esimerkiksi liitteessä D ehdotettn tapaan. 1..1 Sret tlos- ja epävarmsarvot mikrobiologiassa Näytteen mikrobipitoisdet saattavat olla miljoonia tai satoja miljoonia grammaa kohti. Mittastlokset ilmoitetaan mieliten tyyliin y x 10 k, missä x on sein desimaalilk. Tlos y 1300000 g -1, jonka mittasepävarms on ±15 % esitettäisiin sositeltja ilmaisja nodattaen (nmerot ja 3 yllä) esimerkiksi seraavasti: y 1,3(0,0) 10 6 g -1. Sositsta 1 nodatettaessa arvot ilmoitetaan selkeästi erikseen y 1,3 10 6 g -1 ja s y 0,0 10 6 g -1 tai y 15 %. Perinteisiä MPN-menetelmiä käytettäessä shteellinen mittasepävarms on säännöllisesti srempi kin 0,5 (50 %). Missakin tapaksissa yhdistetty epävarms voi nosta näin sreksi. Tällöin laajennett epävarms U>1 (>100 %), joten sen arvo on srempi kin mittastloksen arvo ja lottamsvälin alaraja tlee miinsmerkkiseksi. Niin kaan kin ei ole määritelty mihin tarkoitkseen ja miten epävarmsarvoja käytetään, niihin voi shtata raportoitavina irrallisina lisämäärityksinä, eikä negatiivisesta alarajasta ole haittaa. Jlkais J1/001
13 1.. Merkitsevät nmerot Mikrobiologiassa on harvoin edellytyksiä ilmoittaa lopllista mittastlosta paremmalla kin kahden merkitsevän nmeron tarkkdella. Myös epävarms on syytä ilmoittaa kahden nmeron tarkkdella, vaikka se merkitsisi seampaa desimaalia kin itse mittastloksessa (ks. nmeroarvoja kohdassa 1..1). Pyöristys kahden merkitsevän nmeron tarkkteen tehdään vasta lopllista mittastlosta ilmoitettaessa; ei milloinkaan pershavaintoon eli havaittn pesäkelkmäärään. Jlkais J1/001
14 MITTAUSEPÄVARMUUDEN MÄÄRITYSPERIAATTEET Mittastloksen epävarms joht yleensä monista tekijöistä; mikrobiologiassa aina vähintään kolmesta, siirrostilavden epävarmdesta, pesäkelkmäärän hikkastilastollisesta hajonnasta ja tloksen lkemisen epävarmdesta. Joidenkin epävarmskomponenttien srs voidaan arvioida tilastollisin menetelmin sarjasta rinnakkaisia mittaksia, jolloin niitä kvataan havaintojen otoskeskihajonnalla. Toiset komponentit, joita myöskin kvataan keskihajonnalla, arvioidaan oletetista todennäköisyysjakamista tai kokemksen tai mn tiedon persteella. ISO (1995) käyttää näistä kahdesta periaatteellisesti erilaisesta arviointityypistä nimityksiä tyyppi A ja tyyppi B. A-tyyppinen evalointi voi koskea koko analyysiprosessin lopptlosta tai jotakin osamittasta (esim. pipetointia). B-tyypin evalointi koskee lähinnä vain yksittäisiä epävarmskomponentteja..1 Perstyyppi A A-tyyppinen keskihajonta (standardiepävarms) saadaan n:n riippmattoman rinnakkaismittaksen x 1, x,...,x n kokeellisen keskihajonnan (otoskeskihajonnan) kaavasta, missä x tarkoittaa keskiarvoa s x n i n ( x x) i 1 1 (1) A-tyypin epävarmden laskemiseksi mittas pitää toistaa niin monta kertaa, että tloksen otoshajonnasta saadaan lotettava arvio. Pääasiallinen ongelma on siinä, että aivan pieni otos ei tahdo riittää knnollisen epävarmsestimaatin saamiseksi. Jopa 30 rinnakkaismittaksen keskiarvon otoskeskihajonnan shteellinen epävarms on normaalijakamaa nodattavissa mittaksissa vielä noin 13 %; kahteen rinnakkaiseen perstvan keskihajonnan epävarms peräti 76 % (ISO 1995). Mittasepävarmden arvon haltaan yleensä edstavan materiaalia eikä vain yhtä näytettä. Rinnakkaishavainnot eivät edsta materiaalia riippmattomasti, jos ne ovat peräisin samasta näytteestä. On tärkeä selvästi tiedostaa minne saakka mittastloksen jret lottvat, ja snnitella toistot sieltä alkaviksi.. Perstyyppi B ISO:n (1995) mkaan B-tyyppinen epävarmden arvo saadaan milla keinoin kin rinnakkaishavaintojen tilastollisilla analyyseillä. Epävarmsvarianssi tai standardiepävarms pohjataan koko siihen tieteelliseen tietoon (paitsi rinnakkaismittaksiin), joka on olemassa mittassreen mahdollisesta vaihtelsta. Tieto voi olla peräisin tilastollisesta teoriasta, aikaisemmista vastaavanlaisista mittaksista, kokemksesta tai yleisistä käsityksistä mittalaitteiden ja materiaalien ominaisksista, valmistajan spesifikaatioista, kalibrointi- ja sertifiointiraporteissa jlkaistista vertailarvoista tai käsikirjojen antamista epävarmsarvioista. Jlkais J1/001
15 B-tyyppinen epävarmsarvio saattaa olla jopa lotettavampi kin vähäiseen rinnakkaisten määrään perstva A-tyyppinen epävarms..3 Yhdistetty epävarms Ei yleensä ole käytännössä mahdollista tehdä jokaisessa mittastilanteessa riittäviä toistoja tapaskohtaisen A-tyyppisen epävarmden määrittämiseksi. Silloin joko skotaan jonkin aikaisemmin tehdyn epävarmsmäärityksen pätevän yleisesti (esim. sko toistettavs- ja sittavs-parametreihin) tai koostetaan yhdistetty epävarms analyysiprosessiin liittyvien osamittasten eri tavoin määritetyistä mittasepävarmden arvoista. Yhdistetty epävarms koostetaan osista siten, että tnnistetaan ja letteloidaan kaikki tai ainakin tärkeimmät analyysin eri vaiheissa vaikttavat epävarmstekijät. A- tai B-tyypin menettelyllä arvioidaan knkin srs ja eri epävarmskomponenttien arvot yhdistetään matemaattisesti. Yhdistetty epävarmden matemaattista mallia yhtä hyvin kin sen A-tyyppistä toistomääritystä snniteltaessa on päätettävä mitkä kaikki epävarmstekijät otetaan mkaan. Tärkein valinta koskee sitä sisällytetäänkö näytekohteessa (materiaalissa) esiintyvä mikrobipitoisden otosvaihtel epävarmsestimaattiin vai tarkoitetaanko epävarmdella ainoastaan yhden näytteen laboratorioanalyysin hajontaa. Kn kaikki merkittävästi vaikttavat epävarmstekijät on oikein tnnistett ja arvioit, niin matemaattisesti koostetn yhdistetyn epävarmden estimaatin ja rinnakkaishavaintoihin perstvan A-tyypin estimaatin pitäisi olla saman srisia. Mikäli niin ei ole, niin rinnakkaishavaintoihin ilmeisesti vaikttaa yksi tai seampi tnnistamaton epävarmstekijä, jota ei ole ymmärretty sisällyttää matemaattiseen epävarmsmalliin. Mikrobiologiassa kaikkein tavallisin hajontaa lisäävä syy on jokin 'vahinko' (kontaminaatio, värinmtos tai pesäkkeiden leviäminen), jolle ei ole mitään ennstettavissa olevaa todennäköisyyttä eikä matemaattista mallia. Komponenttien arviointi erikseen attaa tnnistamaan srimmat epävarmstekijät, joihin pttminen vaikttaa eniten yhdistettyyn epävarmteen. Yhdistetyn epävarmden arvio olisi mikrobiologisissa analyyseissä aihetta tehdä tapaskohtaisesti, koska tapaskohtaisesti vaihteleva pesäkelkmäärä, jota ei voida etkäteen ennstaa, sein dominoi epävarmden arvoa..4 Epävarmskomponenttien tietolähteet Mittasepävarmden komponentteja voidaan saada paitsi omista toistomittaksista myös tieteellisestä kirjallisdesta sekä vanhojen, mita tarkoitksia varten koottjen aineistojen varianssianalyyseistä. Tarvittaessa käytetään mitakin arviointikeinoja kten matemaattista teoriaa (Poisson- tai binomijakama) tai eräitä erikoisia approksimaatioita kten tasaista tai kolmiojakamaa (.4.1,.4.). Phdas kokemkseen perstva arvaskin on hyväksyttävien keinojen jokossa, knhan epävarmsarvoja raportoitaessa selvästi osoitetaan mistä arvot on saat. Jlkais J1/001
16.4.1 Tasainen jakama On tapaksia, missä lähtösreen arvojen tiedetään voivan vaihdella joissakin rajoissa (esim. -a...+a), mtta ei ole käsitystä arvojen todennäköisyysjakamasta. Tyypillisiä esimerkkejä ovat pipetin valmistajan ilmoittamat spesifikaatiot ja näytteiden säilytyksen aikaiset pitoissmtokset. Yksi mahdolliss on pitää jokaista arvoa välillä -a...+a yhtä mahdollisena. Silloin "todennäköisyysjakama" on ns. tasainen jakama (Kva 1). -a 0 +a Kva 1. Tasainen jakama. Jokaista arvoa välillä -a...+a pidetään yhtä mahdollisena (yhtä todennäköisenä). Tasaisen jakaman standardiepävarmden arvo on (ISO 1995) s a 3 () Koska mikrobiologiassa on lontevinta esittää mtokset shteellisina (esimerkiksi a %), niin silloin laskett keskihajonnan arvo saadaan soraan shdeyksiköissä eli shteellisena keskihajontana..4. Kolmiojakama Tntematonta todennäköisyysjakamaa voidaan ajatella toisinkin. Pidetään lltavimpana, että arvo on lähellä ilmoitetta tai että pitoiss ei mt, mtta toisaalta hyväksytään mahdolliseksi enintään srdeltaan ±a oleva ero. "Todennäköisyysjakamaa" kvataan tasakylkisellä kolmiolla, jonka hipp on kohdassa 0 (tai arvaamalla valitssa kohdassa w) ja kannan päätepisteet arvoissa -a ja +a (tai a + w ja a + w) (Kva ). Jlkais J1/001
17 -a 0 +a Kva. Kolmiojakama. Kaikki arvot välillä -a...+a katsotaan mahdollisiksi, mtta nollan lähellä olevia arvoja pidetään lltavimpina. Kolmiojakaman standardiepävarms on snnilleen (ISO 1995) s a 6 (3) Se kelpaa sellaisenaan korjaskertoimen shteellisen keskihajonnan arvoksi, kn a on ilmoitett shteellisena (esim. %). Jlkais J1/001
18 3 MIKROBIOLOGISET KVANTITATIIVISET VILJELYMENETELMÄT METROLOGISELTA KANNALTA Kvantitatiivisten viljelymenetelmien analyysiprosessi etenee siten, että näyte homogenoidaan ensin holellisesti ja laimennetaan tarvittaessa "mittalaitteen" toiminta-aleelle. Sen jälkeen menetelmään sopivat tilavdet siirrostetaan kyseiseen mittalaitteeseen. Sitä laimennssarjan sspensiota, josta saadaan ensimmäiset käyttökelpoiset tlokset nimitetään jatkossa päätesspensioksi. Mittalaite eli "detektioinstrmentti" koost sein monesta yksittäisestä detektorista, joita on kahta tyyppiä: pesäkelk- ja liosdetektorit (petrimalja, liosptki). 3.1 Viljelymääritysten yhteinen perskaava Kvantitatiivisten viljelymääritysten kaikille yhteinen matemaattinen perskaava on y Fx (4) missä x päätesspension mikrobipitoiss ja F päätesspension laimennskerroin. (Kn laimennsta ei tarvita, F 1.) 3. Metrologiset tyypit Päätesspension tiheyden määrittämiseksi on käytössä neljä instrmenttityyppiä. (Harvinainen 'spiral plate' on viides tyyppi mtta jätetään käsittelyn lkopolelle.) 3..1 Yhden maljan instrmentti Mikrobipitoisden arvio perst yhden maljan pesäkelkmäärään c, joka on havaitt päätesspension siirrostilavdesta v (Kva 3). x c v (5) Jlkais J1/001
19 Kva 3. Yhden maljan instrmentti. Sotk kvaa ttkittavaa materiaalia, kolmiot sspensioplloja (laimennssarjaa), ympyrät petrimaljoja, nolet pipetointeja. Monista valmistetista maljoista holimatta tlokset lasketaan vain yhdestä maljasta (varjostett). Päätesspensio (lihavoit) on se laimennos, josta tlos letaan. Varjostamattomat maljat on karsitt mahdottomina tai jonkin maljakohtaisia pesäkemääriä rajoittavan sopimksen takia. 3.. Monen maljan instrmentti Mikrobipitoisden arvio perst pesäkelkmääriin, jotka ovat peräisin saman sspension eri tilavksista (laimennoksista) ja/tai samojen laimennosten rinnakkaismaljoista (Kva 4). Kva 4. Monimaljainen instrmentti. Useasta laimennoksesta viljeltyjen maljojen jokosta on valitt osa (varjostett) laskettaviksi. Niistä modost detektioinstrmentti, jonka päätesspensioksi määräytyy ensimmäinen laimennos, josta saadaan laskettavia maljoja (lihavoit). On tarkoitksenmkaista ajatella eri laimennoksista mitattja siirroksia päätesspension erisrina tilavksina (katkoviivanoli). Päätesspension mikrobipitoisden ns. painotett keskiarvo on x Σ ci Σ v i C V (6) c i v i i:nnen maljan pesäkelk, i:nnen mittasannoksen tilavs päätesspension tilavsyksikköinä. Jlkais J1/001
0 Kaavassa pienillä kirjaimilla (c, v) on osoitett yhden maljan pesäkelkmääriä ja siirrostilavksia ja isoilla kirjaimilla (C, V) niiden smmia. 3..3 Yhden ptkisarjan MPN-instrmentti Sarja (n) yhtäsria tilavksia (v) ttkittavasta (pääte)sspensiosta siirrostetaan kkin omaan steriiliin kasvkennoonsa kehittymään. Kvantitatiivisen tloksen saannin edellytyksenä on se, että osa kasvkennoista jää steriileiksi. Päätesspension mikrobipitoiss arvioidaan kaavasta x v n s 1 v n ln s (7) yhden mittasannoksen tilavs, kasvkennojen kokonaislkmäärä, steriileiksi jääneiden kasvkennojen lkmäärä. 3..4 Usean laimennstason MPN-instrmentti Usean laimennstason MPN-arvo lasketaan iteratiivisen lasktoimitksen avlla (esim. Halvorson ja Ziegler, 1933), jota ei voida esittää eksplisiittisen laskkaavan modossa. Näinollen tiheysarvio on x MPN f ( n p k), (8) i i, missä MPN-tlos saadaan talkoista tai tietokoneohjelmista laimennsten lkmäärän (k), ptkisarjojen pitden (n i ) ja eri sarjojen positiivisten ptkien lkmäärän (p i ) fnktiona. Vastaa monen maljan instrmenttia (3..). 3.3 Varmistett mittastlokset Monissa selektiivisissä menetelmissä edellytetään lopllisen mittastloksen olevan ns. varmistett tlos. On pesäkemenetelmiä, joissa varmists tapaht reagenssilisäyksellä koko maljaan tai membraanisodattimen siirrolla reagenssialstalle. Tällöin kaikkiin (myös alstavasti negatiivisiin) pesäkkeisiin tlee tehdyksi varmistava mittas. Lopptlos lasketaan pelkästään tietyllä tavalla reagoivien pesäkkeiden lkmäärän persteella. Metrologisessa shteessa tällaiset kokonaisvarmistett ('in sit'-varmistett) pesäkelvt ovat rinnastettavissa kokonaispesäkelkihin. Kysymys on ainoastaan -vaiheisesta prosessista, missä kaikki tietyllä tavalla reagoivat pesäkkeet katsotaan varmistetiksi ja lasketaan. Jlkais J1/001
1 Myös silloin, kn kaikki viljelmän alstavat pesäkkeet varmistetaan yksitellen, on kysymys kokonaisvarmistetsta lkmäärästä. Kokonaisvarmistksessa saadaan tapaskohtainen korjas, jossa ei kertoimia tarvita. Otosvarmistetissa menetelmissä trvadtaan osittaiseen varmistkseen. Näissä tapaksissa selvitetään ensin alstava (varmistamattomien) positiivisten pesäkkeiden lkmäärä. Ainoastaan alstavat positiiviset pesäkkeet tai satnnainen otos niistä testataan. Varmistetn mittastloksen laskemiseksi alstava tlos kerrotaan varmistvdella eli tosipositiivisten shteellisella osdella. Varmistvtta merkitään jatkossa p:llä. Otosvarmistettjen tlosten korjas voidaan tehdä missä lopptloksen laskemisen vaiheessa tahansa. Joko pesäkelk c (tai C), tiheysarvio x tai lopllinen tlos y kerrotaan p:llä. Varmistvs on tavallaan yksi systemaattisten "virheiden" korjaskertoimista, joista mt esitetään lvssa 8. MPN-menetelmien yhteydessä on periaatteessa kolme varmistamisen tasoa. Jos kaikki kasva osoittavat (myös vailla positiivista reaktiota olevat) ptket siirrostetaan varmistkseen, tilanne vastaa kokonaisvarmistetta pesäkelka. Jos vain alstavasti positiiviset viljelmät siirrostetaan varmistkseen, kysymyksessä on otosvarmistett tyyppi, joka vastaa pesäkemenetelmissä sitä, että maljan kaikki alstavasti positiiviset pesäkkeet varmistetaan. On myös mahdollista, että vain osa positiivisista viljelmistä varmistetaan. Tällöin MPNmenetelmissäkin lopptlos korjataan jälkikäteen positiivisten otoksesta lasketlla varmistvdella. Kahdessa edellisessä tapaksessa tlosten varmists on menetelmän sisäistä siinä mielessä, että varmistett mittastlos lasketaan tai haetaan varmistneiden ptkien lkmäärän persteella. 3.4 Eri metrologisten tyyppien yhdistetyt epävarmdet. Periaatteet. Mittastloksen yleiset laskkaavat sisältävät kaksi tai kolme tlon tekijää. Kokonaispesäkelk- ja kokonaisvarmiststyyppien tlos lasketaan kaavalla y Fx (9) ja otosvarmiststyypin kaavalla y Fpx (10) F x p laimennskerroin, päätesspension mikrobipitoiss, varmistvs. Kokonaisepävarms koostetaan tekijöiden epävarmksista, joten kokonaispesäkelk- ja MPN-estimaattien epävarms on fnktio laimennskertoimen (F) ja tiheysestimaatin (x) epävarmksista ja otosvarmistettjen estimaattien epävarms on fnktio tiheysestimaatin (x), laimennskertoimen (F) ja varmistmisosden (p) epävarmksista. Tiheysestimaatteja on neljä metrologisesti erilaista tyyppiä (ks. 3.), joten Jlkais J1/001
mittasepävarmden käsittely hajoaa moneen osaan. 3.4.1 Lkemaepävarms Kvantitatiivisten viljelymenetelmien mittastloksen tastalla on positiivisten pesäkkeiden tai ptkien lkmäärä. Kokonaan riippmatta siitä onko lkema lähellä tosiarvoa tai kakana siitä, itse lkeman otto on jossakin määrin epävarmaa. Jos henkilö laskisi pesäkkeet tai ptket toistamiseen, tlos ei välttämättä olisi täsmälleen sama kin ensimmäisellä kerralla. Toistettavden ptteesta käytetään seraavassa nimitystä lkemaepävarms. Merkintänä käytetään yhden maljan tapaksessa z (pieni z) ja sean maljan pesäkesmman tapaksessa Z (iso Z). Lkemaepävarms on eri asia kin se epävarms, mikä liittyy eri henkilöiden systemaattisiin lkemaeroihin samassa tehtävässä. Henkilö pystyy yleensä toistamaan oman lkemansa parin prosenttiyksikön sisällä ( z 0,01...0,03). Vaikeissa näytetyypeissä ja hankalia menetelmiä käytettäessä lkemaepävarms voi olla paljon srempikin. Niissä tapaksissa se on varteenotettava epävarmskomponentti. Jlkais J1/001
3 4 YHDISTETYN EPÄVARMUUDEN MATEMAATTINEN KOOSTAMINEN Yhdistetty epävarms koostetaan osistaan vektorismman periaatteella; tekijöiden matemaattisista yhteyksistä riippen joko shde- (log-) tai välimatka-asteikossa. Sitä tarkoitsta varten lopllisen mittastloksen shde lähtösreisiin on pystyttävä ilmaisemaan matemaattisen kaavan modossa. Kaavan pitäisi sisältää kaikki tarvittavat välitlokset sekä korjakset ja korjaskertoimet, jotka saattavat vaikttaa merkittävästi mittastlokseen ja sen epävarmteen. Jos kaikki epävarmskomponentit ovat toisistaan riippmattomia (korreloitmattomia, ortogonaalisia), niin vektorismman arvo on sama kin ns. eklidinen etäisyys eli geometrinen smma (neliöjri varianssien smmasta). Jos jonkin epävarmskomponentin arvo riipp jonkin toisen epävarmskomponentin arvosta, niin nämä epävarmstekijät ovat korreloitneita. Niiden yhteisvaiktsta arvioitaessa on otettava homioon myös niiden välinen korrelaatio (kovarianssi). (Ks. lähemmin ISO 1995 ja Erachem 1995.) Onneksi mikrobiologisen määrityksen epävarmskomponentit ovat srimmaksi osaksi riippmattomia. Eklidisen smman periaatetta voidaan soveltaa ilman mainittavia epäilyksiä. Smman ja erotksen riippmattomat epävarmskomponentit yhdistetään absolttisina (välimatka-asteikossa) ja tlon ja osamäärän epävarmskomponentit shteellisina (shde- tai log-asteikossa). Mikrobiologisissa määrityksissä matemaattinen epävarmden arviointi edellyttää sein liikkmista mitta-asteikosta toiseen. Siitä mahdollisesti seraavien epäselvyyksien vähentämiseksi on tässä oppaassa valitt eri symbolit mittasreen välimatka-asteikossa mitatlle standardiepävarmdelle (keskihajonnalle) ja shde- tai logaritmiasteikossa mitatlle standardiepävarmdelle (shteelliselle keskihajonnalle) (ks. 1.1). 4.1 Riippmattomien mttjien yhdistelykaavat Olkoon mitatt kahden riippmattoman lähtösreen A ja B arvot sekä arvioit niiden keskihajonnat s A ja s B tai shteelliset keskihajonnat A ja B. Absolttisen (s) ja shteellisen epävarmden () välinen riippvs on: s X X X, missä X on sreen keskiarvo. A:sta ja B:stä laskettjen yhdistettyjen mttjien (A + B), (A - B), AB ja A/B kokonaisepävarmdet vektorismman periaatteella laskien ovat: 4.1.1 Smmamttjan (A + B) standardiepävarms s (A + B) s A + s B (11) Jlkais J1/001
4 Smmamttjan shteellinen standardiepävarms ( A + B) s ( A + B) A + B (1) 4.1. Erotsmttjan (A-B) standardiepävarms s (A - B) s A + s B (13) Erotsmttjan shteellinen standardiepävarms s(a - B) (A - B) A - B (14) 4.1.3 Tlomttjan (AB) standardiepävarms s AB AB s A sb + A B AB A + B ) (15) Tlomttjan shteellinen standardiepävarms AB A + B (16) 4.1.4 Osamäärämttjan (A/B) standardiepävarms s AB A B s A sb + A B A B A + B ) (17) Osamäärämttjan shteellinen standardiepävarms AB A + B (18) Mikrobiologisten mittastlosten yhdistetyt epävarmdet saadaan lasketiksi edellä esitettyjä kaavoja soveltaen. Logaritmit vaativat kitenkin oman käsittelynsä. Jlkais J1/001
5 4. Keskihajonta, shteellinen keskihajonta ja logaritmit On tavallista, että mikrobiologisia mittastloksia käsitellään, josks tarpeettomastikin, logaritmoitina. Homattava osa kirjallisdesta löytyvästä mikrobiologisten mittastlosten hajontaa koskevasta tlosmateriaalista on logaritmiasteikossa eli käytännössä shdeasteikossa. 4..1 Asteikkomnnokset Asteikkomnnosten avain on matemaattinen periaate, jonka Myrberg (195) on ilmaisst seraavasti: "Sreen shteellinen virhe on likimäärin yhtä sri kin sen logaritmin absolttinen virhe". Laseessa tarkoitett logaritmi on Neperin järjestelmän (ns. lonnollinen) logaritmi ja virheellä tarkoitetaan sitä, mistä nykyisin mielmmin käytetään nimitystä epävarms. Siis mntamalla missä tahansa logaritmiasteikossa ilmaist keskihajonta lonnolliseen logaritmijärjestelmään, saadaan shteellisen keskihajonnan arvo likimäärin arvioidksi. Mnnos tapaht kertomalla järjestelmien välisellä modlilla. Lonnollisen järjestelmän modli kymmenkantaisen (Briggs'in) järjestelmän shteen on,3059, eli käytännössä,3 tai,303. 4.. Shteellinen ja prosentaalinen ilmais Shteellisen keskihajonnan arvo esitetään yleisesti prosenttilkna. Koska symbolin % merkitys on "sadasosa" niin abstraktilla tasolla ei tarvitse tehdä eroa prosenttien ja sadasosien välillä (5 % 0,05). Laskkaavoissa on johdonmkaisesti pitäydyttävä jommassa kmmassa lktyypissä. Tässä kirjoitksessa on valitt ilmaisksi sadasosat. 4..3 Esimerkki asteikkomnnoksista Seraava esimerkki ei ole todists 4..1:ssä esitetylle väittämälle, mtta osoittaa käytännön tasolla sen toimivden. Esimerkki 4.1. Erään verrattain epähomogeenisen kohteen kymmenessä riippmattomassa näytteessä on havaitt pesäkelkmäärät: 30, 30, 31, 34, 48, 53, 97, 164, 166, 13. Havainnoista on laskett: aritmeettinen keskiarvo 86,6, (aritm.) otoskeskihajonta 69,3337, ln-mnnetn aineiston otoskeskihajonta 0,7889, log 10 -mnnetn aineiston otoskeskihajonta 0,346. Jlkais J1/001
6 Kohdissa 4..1 ja 4.. esitettyjä periaatteita soveltaen saadaan shteellisen keskihajonnan estimaatti kolmella tavalla: välimatka-asteikko: 69,3337/86,6 0,8006 0,80 ln-asteikko: 0,7889 0,79 log 10 -asteikko:,3059 0,346 0,7889 0,79 Arvot eivät poikkea merkittävästi toisistaan. Jlkais J1/001
7 5 MIKROBIOLOGISTEN VILJELYMÄÄRITYSTEN LASKUKAAVAT JA MATEMAATTISET EPÄVARMUUSMALLIT Tässä jaksossa esitettävät epävarmsmallit ovat pelkistettyjä. Niissä ei ole otett homioon mista systemaattisista korjaksista kin laimenns- ja varmistvskorjaksesta johtvat epävarmdet. Täydellisempiä malleja käsitellään lvssa 8 ja esimerkissä 10.5. Mittastloksen kokonaisepävarmteen vaikttavien komponenttien perslettelo selviää kirjoittamalla näkyviin mittastloksen laskkaava. Esimerkiksi kvan 4 esittämässä tapaksessa mittastlos y perst seraaviin mittaksiin ja niiden välisiin matemaattisiin shteisiin: (a1 + b1 ) (a + b ) (a3 + b3 ) (c1 + c + c3 + c4 ) y (19) a b b (v + v + v + v ) 1 3 a i i:nnen laimennsvaiheen siirrostilavs (ml), b i i:nnen laimennsvaiheen laimennsvesitilavs (ml), c j j:nnen laskettavaksi valitn maljan pesäkelkmäärä, v j j:nnen laskettavaksi valitn maljan siirrostilavs päätesspension tilavsyksikköinä, i 1...3, j 1...4. Mittaksia, joista mittastlos koost on 14 (3 kpl a, 3 kpl b, 4 kpl c ja 4 kpl v). Jokaiseen niistä liittyy epävarmtta. Mittastloksen kokonaisepävarms on niiden yhdistelmä. Laskkaavojen yksinkertaistamiseksi on tarkoitksenmkaista käsittää koko laimennsmittasten sarja yhdeksi prosessiksi, jonka seraksena on laimennskerroin F. Laimennskertoimen F epävarms esitetään kohdassa 5.1, otosvarmistettjen tlosten varmistvden p epävarms kohdassa 5. ja eri metrologisten tyyppien sspensiotiheyden estimaattien epävarmdet kohdissa 5.3.1-5.3.4. Lisäksi lopptloksen epävarmteen vaikttaa tloksen lkijan henkilökohtainen lkemaepävarms z (3.4.1). 1 3 4 5.1 Laimennskerroin ja sen epävarms 5.1.1 Kvitteelliset laimennskertoimet f ja F Yksittäinen laimennsvaihe saadaan aikaan pipetoimalla mikrobisspensiosta tilavs a steriilin laimennslioksen tilavteen b. Laimentmisen monikerta, laimennskerroin f, saadaan kaavasta f a + b a (0) Jlkais J1/001
8 k:sta perättäisestä laimennsvaiheesta koostva laimennskerroin lasketaan kaavalla: F k a1 + b1 a + b a a 1 a... k + b a k k f Useimmissa tapaksissa laimennssarja on säännöllinen, niin että tilavdet a ja b ovat kaikissa vaiheissa samoja. Silloin k:n vaiheen kokonaiskerroin on 1 f K f k (1) F f k k a+b a k () Laimennskertoimet f ja F ovat siinä mielessä "kvitteellisia", että mitattjen tilavksien a ja b oletetaan todella olevan ilmoitettjen nimellistilavksien srisia (keskimäärin). 5.1. Kvitteellisten laimennskertoimien f ja F epävarms Tilavksista a ja b koostvan yhden laimennsvaiheen kertoimen (f) epävarms f saadaan arvioimalla yhdistetty epävarms toimitkselle f a + b a Kaavan (3) osoittaja ja nimittäjä ovat korreloitneita (sama a). Korrelaation takia ei sovelleta riippmattomien mttjien osamäärän kaavaa, vaan laimennskertoimen (f) standardiepävarms saadaan kaavasta (3) s s b f + a b a 4 a s (4) ja shteellinen standardiepävarms kaavasta 1 b 1 f sb + sa sb + b ( a + b) a ( a + b) a (5) F k f (6) Jos kokonaiskerroin (F) koost k:sta samanlaisesta laimennsvaiheesta, sen kokonaisepävarms on samojen periaatteiden mkaisesti Jlkais J1/001
9 Jos vaiheet ovat tilavsrakenteeltaan erilaisia, knkin shteellinen epävarms on laskettava erikseen ja laimennskertoimen epävarms on niiden vektorismma (neliöiden smman neliöjri). F 1 + +...+ k (7) 5.1.3 Laimennskertoimen (F) systemaattinen harha ja sen korjas. Todellinen laimennskerroin F' ja sen epävarms. Pääsääntöisesti laboratoriot kvittelevat nestemittasten systemaattiset harhat olemattomiksi tai ainakin merkityksettömiksi ja käyttävät holettomasti kvitteellisia laimennskertoimia mittastloksia laskiessaan. Mitatt tilavdet eivät kitenkaan välttämättä ole keskimäärin oletetn srisia. Tilavs voi mtta steriloitaessa nesteitä atoklaavissa eikä pipettien ja annostelijoiden antavs ole välttämättä nimellisarvon mkaista. Systemaattiset harhat ovat välinekohtaisia ja pipetointien osalta jopa osittain työntekijäkohtaisia. Kirjallisdessa jlkaistt kokeelliset havainnot eivät ole yleispäteviä. Jos laimennsmittasten nimellistilavksiin a ja b on havaitt liittyvän systemaattiset virheet srdeltaan keskimäärin a ja b, niin k-portaisen laimennssarjan todellinen laimennskerroin on a + a + b + b F k a + a k (8) Tilavksien tosiarvot (a + a) ja (b + b) saadaan kokeellisista kalibrointimittaksista. Tilavksien mittasepävarmdet selviävät samassa yhteydessä. Todellisen laimennskertoimen epävarmden arvo on sama kin kvitteellisen laimennskertoimen (F) epävarms (5.1.). 5. Varmistvden (p) epävarms Varmistvs on varmistneiden tapasten ja alstavien positiivisten tapasten shde; eräänlainen tnnistamisen tai onnistmisen todennäköisyys. Mikäli tapaskohtainen kokonaisvarmists ei tle kysymykseen, on hyväksyttävä jokin yleistävä yksinkertaists. Varmistvden lkarvo estimoidaan eristämällä satnnaisesti n alstavasti positiivista pesäkettä ja toteamalla varmistneiden lkmäärä (k). Merkitään varmistvtta p:llä. Sen paras estimaatti on $p k n (9) HUOM. Sanaa 'satnnaisesti' ei voi liikaa korostaa. Missään eristämisen vaiheessa ei saa antaa sbjektiivisen valinnan ohjata poimintaa alstavien positiivisten pesäkkeiden jokosta. Sosits valita jokaisen eri pesäketyypin edstaja varmistettavaksi on sorastaan vaarallinen. Jlkais J1/001
30 Koska pesäkkeiden aiheet jotvat maljalle aln alkaen satnnaisiin paikkoihin, satnnaisen eristämisen menettelyksi riittää valita mielivaltainen aloitspaikka ja eristää siitä alkaen esimerkiksi kalvosodattimen rtriviä pitkin edeten jokainen vastaan tleva alstavat lkonäkökriteerit täyttävä pesäke knnes etkäteen valitt määrä tlee täyteen. On lvallista hypätä sellaisen pesäkkeen yli, jonka eristäminen phtaana tnt hyvin epätodennäköiseltä. On pyrittävä vaststamaan kisasta valita aloitskohta aina siten, että paras pesäke tlee varmasti eristettyjen jokkoon. Tapaskohtainen tosipositiivisten osden (varmistvden) estimointi olisi toivottavaa. Ellei se ole mahdollista, voi olla pakko jopa kvitella varmistvden olevan menetelmäkohtainen vakio. Aineiston karttessa tlee mahdolliseksi ryhmitellä näytetyypit varmistvden mkaisiin lokkiin, mikäli tarpeen. Koska esimerkiksi ympäristönäytteissä varmistvs oletettavasti vaihtelee näytepaikkakohtaisesti ja vodenajoittain, niin hyväksyttävimmältä tnt sellainen ratkais, että vähitellen näyte näytteeltä kerätään tietoa, joka ajan oloon ryhmitellään paitsi näytetyyppi- ja vodenaika- myös työntekijäkohtaisesti. Loplta p:n estimaatit täsmentyvät ja mittastlosten epävarms vastaavasti pienenee. Silti tällaisen estimaatin yleispätevyyden shteen on aina pieni epäilys. Varmistvden varianssi on Var(p) p(1-p)/n (binomijakama). p esiintyy mittastlosten laskkaavoissa (3., 3.3) tlon tekijänä, joten sen epävarmden käyttökelpoisin ilmais on shteellinen keskihajonta. Sen voi laskea kaavalla p 1 p p(1- p) n 1- p np (30) missä p on tnnetksi kvitelt tai aikaisemmasta aineistosta laskett varmistvden arvo ja n on se pesäkkeiden lkmäärä, johon arvon määritys persti. p:n arvoa ei koskaan varmasti tiedetä etkäteen. Periaatteessa se tlisi määrittää jokaisen näytteen kohdalla erikseen. Siinä tapaksessa, että näin menetellään, p:n estimaatiksi valitaan k tapaskohtainen varmistvs $p. Sen epävarmden laskkaava on n n - k pˆ (31) nk n k varmistettavaksi valitt pesäkkeiden lkmäärä, positiivisiksi varmistneiden lkmäärä. Näytekohtainen mtaman pesäkkeen varmistaminen on hyvin epäedllista mittasepävarmden kannalta. Jos varmistettavaksi valitaan 5 pesäkettä, p:n shteellinen epävarms on lokkaa 19- % ja kymmenenkin pesäkkeen eristyksessä on epävarms vielä 10-16 %. Vasta kn on ttkitt ainakin 100 pesäkettä tlee varmistvs arvioidksi alle 5 % shteellisella epävarmdella. Jlkais J1/001
31 5.3 Kvantitatiiviset mikrobipitoissestimaatit ja niiden epävarms Pesäkkeiden laskemiseen perstvien menetelmien kahdesta päätyypistä käytettiin edellä nimityksiä kokonaispesäkelk- ja otosvarmiststyypit. Kokonaispesäkelktyyppiin klvat pesäkemenetelmät, joissa kaikki tai kaikki tietyt lkonäkökriteerit täyttävät pesäkkeet (myös bakteriofagien plakit) lasketaan. Ns. in sit-varmistkset, missä maljan kaikille pesäkkeille tehdään jokin varmistava mittas reagenssilisäyksen tai kalvosodattimen siirron avlla, klvat samaan tyyppiin, samoin kin tapaskohtaisesti täysin varmistett pesäkelvt. Näitä tloksia ei korjata jälkikäteen varmistvskertoimella. Otosvarmistettihin pesäkelkihin (ks. 3.3) tehdään varmistvskorjas. 5.3.1 Yhden maljan instrmentti Yhden maljan mittalaite syntyy, kn ei tehdä rinnakkaismaljoja ja jonkin rajoittavan lasksäännön (10-100, 5-50, 30-300 tms.) tai mn syyn takia käytettävissä on vain yksi laimenns (kva 3). Toisinaan näyte katsotaan niin ttksi, että alnperin valmistetaan vain yksi malja. Toistojen pttessa A-tyyppinen kokonaisepävarmden arvio ei ole mahdollinen. Mittastloksen yhdistetty epävarms lasketaan tnnetiksi oletetista epävarmskomponenteista. Yhden maljan havaittn pesäkkeiden lkmäärään vaikttaa lähinnä neljä epävarmstekijää: hikkastilastollinen hajonta (7.), laimennskertoimen (5.1) ja siirrostilavden (7.4) epävarms sekä henkilökohtainen lkema(epä)varms (3.4.1, 7.1). Kokonaispesäkelktyypin estimaatti saadaan lasktoimitksesta y F c v (3) Kaavassa F c v kvitteellinen tai todellinen laimennskerroin, maljan pesäkelkmäärä, siirrostilavs. Mittastloksen kokonaisepävarms ilman henkilökohtaista lkemaepävarmden komponenttia on 4.1:ssä esitettyjen periaatteiden mkaan y F + c + v (33) F laimennskertoimen shteellinen standardiepävarms (kts. 5.1., 5.1.3), c pesäkelkmäärän shteellinen hikkastilastollinen hajonta (ks. 7.), v siirrostilavden shteellinen mittasepävarms (ks. 7.4). Henkilökohtainen lkemaepävarms ( z ) otetaan päätesspension tiheysestimaatissa homioon lisäterminä, joten mittastloksen kokonaisepävarms on Jlkais J1/001
3 y F + c + v + z (34) Pesäkkeiden lkmäärän laskeminen ei kenelläkään ole erehtymätöntä. Tlos vaihtelee, jos henkilö laskee saman maljan pesäkkeet destaan. Yleensä lkeman shteellinen toistettavs on sangen hyvä ja henkilökohtaisesti varsin vakinainen, vaikkakin eri menetelmien kohdalla erilainen. Joissakin hankalissa menetelmissä ja näytetyypeissä tloksen lkeminen voi olla niin epävarmaa, että tämä on syytä homioida lkemaepävarmden komponentin modossa. Lkemaepävarmdesta on syytä ottaa selvää lkemalla pieni osa rtiinimaljoista kahdesti mieliten siten, että vasta ensimmäisen lkkerran jälkeen katsotaan arvalla klko malja destaan lettavien jokkoon. Se, että valitaan ainoastaan ongelmatapaksia delleen laskettaviksi, vääristää lkemaepävarmden arvioinnin täysin. Toistotloksista voidaan laskea esimerkiksi varianssianalyysin avlla henkilön tloksen toistettavskeskihajonta z shdeasteikossa (ln-mnnetista pesäkelvista). Jos yksimaljaisen instrmentin tlos on varmistettava, niin lopptlos saadaan kaavasta y pf c v (35) ja shteellinen kokonaisepävarms kaavasta y p + F + c + v + z (36) Vain p:n epävarms on tta edelliseen (ks. 5.). 5.3. Monen maljan instrmentti Kn laskettavia maljoja on enemmän kin yksi, niin päätesspension mikrobitiheys saadaan ns. painotetn keskiarvon periaatteella jakamalla pesäkesmma siirrostilavksien smmalla. Siirrokset on tässä tapaksessa ilmaistava päätesspension tilavksina. Mittastlos laimennskertoimella korjaamisen jälkeen on y Fx F Σ ci Σ v i F C V (37) F C V laimennskerroin, Σc i pesäkelkjen smma, Σv i siirrostilavksien smma. Kaavan samankaltaiss yhden maljan kaavan kanssa osoittaa, että monimaljaisen detektioinstrmentin mittastloksen kokonaisepävarms saadaan yhdistämällä laimennskertoimen ja pesäke- ja tilavssmmien shteelliset epävarmdet y F + C + V (38) Jlkais J1/001
33 Kaavoissa: F kvitteellinen tai todellinen laimennskerroin ja F sen shteellinen keskihajonta (5.1., 5..3), C maljojen pesäkesmma ja C sen shteellinen hikkastilastollinen keskihajonta (7.), V siirrostilavksien smma ja V sen shteellinen keskihajonta (7.5). Lkemaepävarmden arvo koko maljasarjalle lasketaan kten kohdassa (7.1.1) on esitetty. Arvo liitetään halttaessa mittastloksen epävarmsestimaattiin, kten edellä (5.3.1). Jos lopptloksen pitää olla varmistett, kaavoihin liitetään varmistvs ja sen epävarms kten (5.3.1):ssä. Tilavssmman V epävarmden laskeminen on verrattain mtkikasta (ks. 7.5). Monen maljan määritysten epävarmsarviossa kannattaakin hyödyntää sitä tietoa, että havaittjen pesäkelkmäärien välinen vaihtel sisältää lonnostaan hikkastilastollisen hajonnan ohella laimenns- ja tilavsmittasten epävarmdet sekä tloksen lkijan henkilökohtaisen lkemaepävarmden. Tämän ansiosta monen maljan "instrmentin" päätesspension tiheyden (x) kokonaisepävarms voidaan perstaa myös pelkästään maljojen väliseen hajontaan (Lk 6). 5.3.3 Yhden laimennstason MPN-instrmentti Mittastlos saadaan laskkaavasta y Fx F 1 v n ln s (39) F v n s päätesspension todellinen tai kvitteellinen laimennskerroin, yhden koeannoksen tilavs, kasvkennojen (ptkien) kokonaislkmäärä, steriileiksi (tai negatiivisiksi) todettjen kasvkennojen lkmäärä. On myös talkoita (esim. SFS 4447:1979, Niemelä 1983) missä on annett positiivisten tlosten lkmäärään perstva MPN-arvo ja sen 95 % lottamsväli. Monipolisimmat tietokoneohjelmat (Hrley ja Roscoe, 1983) antavat näiden lisäksi keskihajonnan log 10 - asteikossa. Laimennskertoimeen (F) ja siirrostilavden mittaksiin (v) liittyy epävarmtta. Kitenkin siirrostetn kokonaistilavden V nv epävarms v tasoitt yleensä merkityksettömäksi, koska se nodattaa kaavaa V 1 v v V nv nv (nv ) v v n n (40) Jlkais J1/001
34 Kn tietolähteet antavat 95 % lottamsvälin, MPN-estimaatin tai päätesspension mikrobitiheyden shteellisen keskihajonnan arvo voidaan johtaa niistä logaritmimnnosten avlla seraavasti. i) Oletetaan, että talkoista tai tietokoneohjelmista saadaan 95 % lottamsväli modossa yläraja x Y, alaraja x A. Yksinkertaisinta on laskea shteellinen epävarms kaavalla MPN ln (xy ) - ln (x 4 A ) (41) ii) iii) Kn tietokoneohjelma (esim. Hrley ja Roscoe 1983) antaa MPN-estimaatin keskihajonnan Log10-järjestelmässä (S.E. of Log10 MPN), niin tarvitaan ainoastaan mnto lonnolliseen logaritmijärjestelmään modlilla (,303) kertomalla (kts. 4..1). Kn tietolähteiden pttessa mittasepävarms jodtaan arvioimaan omin avin, niin lasketaan ensin "yksinkertaiset" ylä- ja alarajat. Arviot perstvat ajatkseen, että steriilien ptkien määrä (s) vaihtelee satnnaisesti hikkastilastollisista syistä. Voidaan olettaa, että vaihtel on binomijakaman mkaista, niin että s:n varianssi on s(n-s)/n. Näin on menetelty mm. NMKL:n mittasepävarmsdokmentissa (NMKL, 1999). Lasketaan ensin MPN-tiheysestimaatin ylä- ja alalikiarvot (x Y, x A ). 1 n x ln (4) v s(n - s) s ± n (Plsmerkki nimittäjässä liittyy alalikiarvoon ja miinsmerkki ylälikiarvoon.) Estimaatin shteellinen epävarms arvioidaan ottamalla raja-arvoista lonnolliset logaritmit ja jakamalla niiden erots kahdella. Nimitetään sitä tiheysestimaatin shteelliseksi epävarmdeksi MPN : MPN ln (x Y ) - ln (x A ) (43) x Y ylälikiarvo, x A alalikiarvo. Kten todett, siirrostilavden v epävarmdesta ei tarvitse välittää, koska sillä on mitätön vaikts yhdistettyyn epävarmteen. Jlkais J1/001
35 Laimennskertoimen epävarms saattaa olla merkittävä, joten se kannattaa homioida shteellisen kokonaisepävarmden kaavassa: y F + MPN (44) F MPN kvitteellisen tai todellisen laimennskertoimen shteellinen keskihajonta (5.1., 5.1.3), sspensiotiheyden shteellinen hikkastilastollinen epävarms. Lkemisen epävarmteen ei MPN-menetelmissä ole tavatt kiinnittää homiota. 5.3.4 Usean laimennstason MPN-instrmentti Epävarmsparametrin arvo perst mittastloksen laskkaavaan y F MPN (45) missä F on kvitteellinen tai todellinen laimennskerroin ja MPN on talkoiden tai tietokoneohjelman antama todennäköisin bakteerimäärä. MPN-menetelmien piilevät olettamkset ovat, että kaikki detektioinstrmentin sisäiset laimennkset sekä detektorien siirrostamiseksi tarvitt sspensioiden mittakset on tehty virheettömästi ja kaikki sspensiot ovat niin täydellisesti sekoitettja, että Poisson-jakama pätee. Jos Poisson-jakama ei päde, mittastlos on arvoton eikä sitä pidä käyttää. Poissonjakamaa ei kitenkaan yleensä aseteta kyseenalaiseksi MPN-menetelmiä käytettäessä ehkä mittastloksen menetyksen pelossa. Eräät modernit MPN-arvojen talkot ottavat tämän homioon eivätkä anna tlosta ptkisarjoille, joiden tilastollinen pätevyys on kyseenalainen. Yhdistetyn epävarmden malli on y F + MPN (46) MPN-arvon mittasepävarmden shteen ollaan riippvaisia joko talkoista tai tietokoneohjelmista, joista itse MPN-arvokin haetaan. Molemmat lähteet ilmoittavat tavallisesti laajennetn epävarmden (95 % lottamsvälin) ylä- ja alalikiarvojen modossa. Tällöin menetellään kten vaihtoehdossa i) (5.3.3). Vaihtel edstaa pelkästään systeemin hikkastilastollista hajontaa. Koska lottamsvälin estimointimenetelmiä on seanlaisia, eri tietokoneohjelmat tai talkot saattavat antaa toisistaan poikkeavia arvoja. Monipolisin tietokoneohjelma (Hrley ja Roscoe 1983) antaa lottamsvälin lisäksi keskihajonnan arvon Log 10 -asteikossa. Jlkais J1/001
36 Omakohtainen mahdolliss estimoida hikkastilastollisen hajonnan oss on laskea Log 10 MPN-arvon keskihajonta Cochran'in (1950) esittämästä likimääräiskaavasta s 0,58 LogMPN log n 10 f (47) f n kahden perättäisen tason välinen laimennskerroin, yhden sarjan rinnakkaisptkien lkmäärä. Se mnnetaan MPN-arvon shteelliseksi keskihajonnaksi kertomalla ln-järjestelmän modlilla log 10 -järjestelmän shteen, eli lvlla,303. Pipetointien ja miden tilavsmittasten epävarms ei sisälly edellä esitettyyn epävarmsmalliin, mtta voitaisiin tarvittaessa homioida. On osoittatnt, että vaikts kokonaisepävarmteen on mitätön ja persolettamkset ovat tilavsmittasten osalta riittävän hyvin voimassa. Laimennskertoimen epävarmdella saattaa olla sen verran vaiktsta, että se kannattaa homioida samalla tavalla kin edellä (5.3.3). Jlkais J1/001