TEKNIIKKA JA LIIKENNE. Laboratorioalan koulutusohjelma OPINNÄYTETYÖ SOLANACEAE-HEIMON KASVIEN JA POTYVIRUKSEN VUOROVAIKUTUSTEN TUTKIMINEN

Transkriptio

1 TEKNIIKKA JA LIIKENNE Laboratorioalan koulutusohjelma OPINNÄYTETYÖ SOLANACEAE-HEIMON KASVIEN JA POTYVIRUKSEN VUOROVAIKUTUSTEN TUTKIMINEN Työn tekijä: Anni Piippo Työn ohjaajat: Arja Miettinen- Oinonen Tuuli Haikonen Jari Valkonen Työ hyväksytty: Arja Miettinen-Oinonen yliopettaja

2 ALKULAUSE Tämä opinnäytetyötyö tehtiin Helsingin yliopiston Maatalous-metsätieteellisen tiedekunnan Maataloustieteiden laitoksella. Haluan kiittää professori Jari Valkosta mahdollisuudesta suorittaa työharjoitteluni hänen ryhmässään. Kiitos, että pääsin osalliseksi niin erinomaiseen ryhmään ja oppimaan paljon uutta. Haluan erityisesti kiittää tohtorikoulutettava Tuuli Haikosta, jonka kärsivällisyyttä ja asiantuntevuutta tarvittiin työharjoitteluni lähiohjauksessa sekä etenkin opinnäytetyöni valmistumisessa. Kiitos myös dosentti Minna Rajamäelle, joka osallistui opinnäytetyöni ohjaamiseen. Haluan kiittää myös yliopettaja Arja Miettinen- Oinosta ohjauksesta koulun puolelta. Kiitos myös laboratorion henkilöstölle, erityisesti tohtorikoulutettaville Johanna Nykyrille, Johanna Santalalle, Anssi Vuoriselle ja Mikko Lehtoselle, joilta sain apua ja neuvoja aina tarvittaessa. Helsingissä Anni Piippo

3 TIIVISTELMÄ Työn tekijä: Anni Piippo Työn nimi: Solanaceae-heimon kasvien ja potyviruksen vuorovaikutusten tutkiminen Päivämäärä: Koulutusohjelma: Laboratorioala Ohjaava opettaja: Fil. toht. Arja Miettinen-Oinonen Sivumäärä: 49 s. + 1 liite Suuntautumisvaihtoehto: Työn ohjaajat: Maa- ja metsätieteiden maisteri Tuuli Haikonen ja Akatemian professori Jari Valkonen Tässä opinnäytetyössä tutkittiin perunan A-viruksen vuorovaikutuksia eri isäntäkasvien kanssa käyttämällä eri menetelmiä. Opinnäytetyö aloitettiin kloonaamalla mutatoituja geenejä, jotka koodaavat viruksen patogeenisyydelle tärkeää proteiinia, hiivan kaksihybridisysteemiin, minkä jälkeen ko. plasmidi transformoitiin hiivaan. Tämän jälkeen villityyppi- ja mutanttiproteiinien interaktioita eräitä kasviproteiineja vastaan tutkittiin seuraamalla hiivan kasvua interaktioselektiomaljauksella. Proteiinien tuotto hiivassa varmistettiin Western blot -menetelmällä. Työssä suoritettiin myös kasvikoe, jonka tarkoituksena oli havainnollistaa perunan A- viruksen leviäminen Petuniassa, Solanaceae-heimoon kuuluvassa mahdollisessa isäntäkasvissa. Agrobakteerien kasvatus ja infiltraatio -osassa tartutettiin agrobakteerivälitteisesti kahta perunan A-viruksen muotoa, infiltroimalla ne kolmen eri Petunia-lajikkeen ylälehtiin. Kasvien oireita seurattiin silmämääräisillä tarkasteluilla sekä testattiin viruksen määrää ylälehdissä ELISA- testillä 7, 14 ja 21 vuorokauden välein. Työn perusteella voitiin todeta, että mutatoitujen proteiinien tuottaminen hiivan kaksihybridisysteemissä onnistui. Mutaatioiden vaikutukset kasviproteiini-interaktioihin olivat pieniä. Havaittiin myös, että perunan A-virus ei kyennyt havaittavasti tartuttamaan petuniaa käytetyissä koeolosuhteissa. Tämä viittaa siihen, että kolme viikkoa on liian lyhyt aika selvittämään viruksen leviämisnopeutta. Infiltrointi-vaiheessa on otettava huomioon infiltroitavien lehtien ikä, joka vaikuttaa viruksen leviämisnopeuteen. Avainsanat: hiivan kaksihybridisysteemi, agroinfiltraatio, potyvirus

4 ABSTRACT Name: Anni Piippo Title: Studying of the interactions between plants from Solanaceae-family and a potyvirus Date: November 9th 2010 Department: Laboratory sciences Instructor: Arja Miettinen-Oinonen, Ph. D. Number of pages: 49 pages + 1 attachment Study Programme: Supervisors: Tuuli Haikonen, M. Sc. (Agr. & For.) and Jari Valkonen, Academy Professor In this graduate study the interactions between flower plants and Potato virus A were studied with the help of a few different methods. Firstly, two genes coding proteins which are important for the viral pathogenicity were studied for their host protein interactions. Certain mutated versions of the virus genes were cloned into yeast two hybrid system. After cloning the mutants were transformed to yeast cells. The interaction of wild type and mutant proteins were studied by following the growth of the yeast cells on interaction selection medium. The production of the proteins in yeast was confirmed with Western blot. The second part of the study was a plant experiment the purpose of which was to test if Potato virus A infected petunia. Petunia belongs to the Solanaceae-family and it is related to potato. This relation could make it possible for the Petunia to be a new host plant for the virus In the plant experiment two strains of Potato virus A were infected with three different cultivars of Petunia by agroinfiltration. The symptoms in plants were observed with eye and virus presence tested by taking leaf samples from new leaves for ELISA-testing after 7, 14 and 21 days. This study proved that the yeast two-hybrid system can be successfully used for the production of the mutated proteins. The effect of mutations to the plant protein interactions studied were small. It was also shown that Potato virus A did not detectably infect Petunia in the experimental conditions used. It was indicated that three weeks was too short a period for spreading of the Potato virus A in petunia. It is also important to pay attention to the age of infiltrated leaves, which alters the spreading rate of the virus. Keywords: Yeast two-hybrid system, agroinfiltration, potyvirus

5 SISÄLLYS ALKULAUSE TIIVISTELMÄ ABSTRACT LYHENTEITÄ JA MÄÄRITELMIÄ 1 JOHDANTO 1 2 KIRJALLINEN OSA Kasvitaudit ja niiden vaikutus kasveihin Kasvitaudit Kasvi viruksen isäntänä Kasvikokeen suorittaminen Proteiini-proteiini-vuorovaikutusten havainnointi Hiivan kaksihybridisysteemi (Yeast Two Hybris System, YTHS) Periaate pgadt7 AD -vektori (101) pgbkt7-vektori (103) Hiivan kasvatus selektiomaljoilla Kasvitransformaatio PCR- ja pesäke-pcr -reaktiot 11 3 KOKEELLINEN OSA Työn tarkoitus Kasvien tartutus Agrobakteerien kasvatus ja agroinfiltraatio Petuniaan ELISA-testi Hiivan kaksihybridisysteemi Kloonaus hiivavektoreihin E. coli :n (DH5 ) transformaatio Hiivan transformaatio Interaktioselektiomaljat Transformoidun hiivan proteiininäytteet Liemikasvatus Western Blot 25

6 4 TULOKSET JA NIIDEN TARKASTELU Virustartutetut kasvit Agrobakteerien kasvatus ja agroinfiltraatio Petuniaan ELISA- testi VPg:n kloonaus PCR Pesäke-PCR HC-Pro-330mA:n kloonaus PCR Pesäke-PCR HCpro-330mA:n tarkistusdigestio Hiivan transformaatio ja proteiinien väliset interaktiot hiivassa Kasvatusmaljat Interaktioselektiomaljat Western Blot HCpro-fuusioproteiinien havaitsemiseksi 42 5 YHTEENVETO 46 VIITELUETTELO 48 LIITE Kokeissa käytetyt liuokset

7 LYHENTEITÄ JA MÄÄRITELMIÄ AD Activation domain. Aktivaatiodomeeni. Proteiinin toiminnallisen tai rakenteellinen osa, johon hiivan transkriptiokoneisto sitoutuu. APS Ammoniumpersulfaatti BD Binding domain. Kiinnitysdomeeni, proteiinin DNA:n sitoutuva osa. DMSO Dimetyylisulfoksidi Domeeni Proteiinin toiminnallisesti tai rakenteellisesti itsenäinen osa. ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay. Entsyymivälitteinen immunosorbentti-menetelmä. Yleensä immunologiassa käytetty biokemiallinen tekniikka, jolla havainnoidaan vasta-aineen avulla antigeenin läsnäolo näytteessä. GFP Green fluorescent protein. Fluoresoiva proteiini, joka havaitaan vihreänä värinä UV-valossa. PCR Polymerase chain reaction. Polymeraasiketjureaktio. Reaktio, jolla voidaan tuottaa miljoonia kopioita tietystä DNAsekvenssistä. PVA Potato virus A. Perunan A-virus. Potyviruksiin kuuluva, kasveja tartuttava RNA-virus. SDS Natriumdodekyylisulfaatti SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesi. Tekniikka, jolla erotellaan proteiineja niiden elektroforeettisen liikkuvuuden, esim. molekyylipainon, perusteella. SOB-liemi Super optimal broth. Erittäin optimaalinen liuos tiettyjen bakteerien nestekasvatukseen. SOC-liemi Super optimal broth with catabolite repression. SOB-lientä, johon on lisätty glukoosia. TCA Trikloorietyylihappo TEMED Tetrametyylietyleenidiamidi

8 YTHS Yeast Two Hybrid System. Hiivan kaksihybridisysteemi. Molekyyligeneettinen menetelmä, jolla tutkitaan proteiini-proteiinisidosten olemassaoloa.

9 1 1 JOHDANTO Kasvien virustutkimuksen tarkoituksena on perehtyä viruksen toimintaan kasvin sisällä, jotta viruksen aiheuttamat taudit pystytään estämään tai ehkäisemään ja kasviviruksen tartunta pystytään havaitsemaan ajoissa. Sen avulla pystytään eliminoimaan tartunnan saaneet kasvit terveiden pelastamiseksi. Viruksen vaikutus- ja leviämistavan tutkimuksella pyritään ehkäisemään mahdollisia virustartuntoja etukäteen. Viruksia ei kuitenkaan pystytä torjumaan kasvinsuojeluaineilla, kuten esim. sienitartuntoja, vaan kestävien lajikkeiden suosiminen ja virusten ennaltaehkäisy ovat ainoita keinoja. Tässä opinnäytetyössä tarkastellaan kahta virus-kasvi -proteiiniparia, joilla tiedetään olevan vuorovaikutusta keskenään. Vuorovaikutusten tutkiminen helpottaa ymmärtämään tartunnan alaisen solun toimintaa paremmin. Jos viruksen ja isäntäkasvin proteiinien vuorovaikutukset tunnetaan, kyetään seurauksia arvioimaan etukäteen, etenkin, jos isäntäkasvi tai kasvivirus vaihtuu sellaiseksi, josta tällaista tutkimusta ei vielä ole tehty. Aiemmassa tutkimuksessa on selvitetty Solanaceae-heimon (mm. tupakka, peruna ja Petunia) ja perunan A-viruksen (PVA) välisiä vuorovaikutuksia tarkemmin ja tehty sen perusteella mutaatioita virusproteiineihin. [21]. Mutaatioiden tarkoituksena oli poistaa vuorovaikutukset kasviproteiinien kanssa ja tässä opinnäytetyössä selvitettiin onko niin tapahtunut. Lisäksi työssä haluttiin selvittää, tartuttaako perunan A-virus Petuniaa. Jos Petunia olisi viruksen isäntäkasvi, sitä voitaisiin käyttää uutena malliorganismina kasviviruskokokeissa.

10 2 2 KIRJALLINEN OSA 2.1 Kasvitaudit ja niiden vaikutus kasveihin Kasvitaudit Kasvitauti on haitallinen häiriö kasvin elintoiminnassa. Sen aiheuttajana toimivat mikrobit eikä sairastunutta kasvia kyetä usein pelastamaan taudilta. Erot terveen ja sairaan välillä saattavat olla niin lieviä, ettei niitä havaitse paljaalla silmällä. Luonnossa olevista kasveista on usein hankalaa määrittää, onko kasvi terve, sillä ulkoiset olosuhteet vaikuttavat suurelta osin kasvien yksilöihin aiheuttamatta kuitenkaan itse tautia. Erilaisia taudinaiheuttajia ovat sienet, bakteerit ja mykoplasmat sekä virukset ja viroidit. Tässä työssä keskitytään virustartuntaan. Virukset ovat joiltakin osin samankaltaisia kuin kasvisoluissa esiintyvät molekyylit. Niille on oma määritelmänsä, jotta ne pystytään erottamaan normaaleista solurakenteista. Yleisesti määritettynä virukset ovat omaa monistumistaan sääteleviä, elävän isäntäsolun sisällä lisääntyviä, perintöainesmolekyylejään kopioivia taudinaiheuttajia. Ne eivät kuitenkaan pysty elämään eivätkä monistumaan itsenäisesti solun ulkopuolella, joten virusten on kyettävä tartuttamaan uusi isäntäkasvi aina tarpeen tullen. Tästä syystä virusten nimeäminen tapahtuu isänkasvin tai viruksen isäntäkasviin aiheuttamien oireiden mukaan. Viruksilla ei ole kromosomeja. Ne koostuvat ainoastaan perintöainesmolekyylistä, joka on RNA:ta tai DNA:ta sekä valkuaisainekuoresta, jonka sisälle perintöaines on pakattu. Viruksen ulkomuoto vaihtelee lajityypin mukaan ja ne ovat yleisesti noin nm pituisia. Niiden päätarkoituksena on loisia isännässä, jotta ne saavat isäntäeliön solukoneiston toimimaan oman lisääntymisensä edistämiseksi. Kasviviruksen perimä voi koostua alle 10 geenistä, joten viruksen on kyettävä soluttautumaan isäntäsolun toimintoihin oman monistumisensa varmistamiseksi. [1, s ] Tässä työssä keskityttiin erityisesti perunan A-virukseen (PVA), joka kuuluu potyviruksiin. Potyvirusten proteiinit tuotetaan aluksi yhtenä suurena mole-

11 3 kyylinä, joka pilkotaan yksittäisiksi proteiineiksi viruksen itsensä tuottamilla entsyymeillä. Tästä seuraa, että lopulta kasvisolut tuottavat kaikkia virusproteiineja yhtä paljon. Virus kykenee kuitenkin hyväksymään perintöaineksensa lisäyksen vierasproteiiniin, lisäyksen heikentämättä viruksen tartutuskykyä merkittävästi. Tämän avulla virusgenomiin lisätty vieras geeni pystytään muokkaamaan proteiiniksi virusproteiinien kanssa samanaikaisesti. Jo pienellä määrällä alttiita kasveja pystytään tuottamaan huomattava proteiinimäärä viruksen monistumisen ja leviämisen helppouden ansiosta. [2, s. 9-10]. Kuvassa 1 on nähtävissä yksiosaisen potyviruksen genomi. Kuva 1. Yksiosainen potyviruksen genomi. Laatikko kuvaa viruksen genomista tuotettavaa polyproteiinia, joka pilkkoutuu yksittäisiksi proteiineiksi (pystyviivat). [3.] Viruksen genomiin linkitetty proteiini VPg (viral genome-linked protein) on monitoiminen proteiini, joka on osallisena viruksen genomin monistuksessa ja kuljetuksessa kasvissa. Se on prosessoitu NI-a-proteiinin N-terminaalisesta päästä. VPg sitoutuu kovalenttisesti virus-rna:n 5 -päähän fosfodiesterisidoksella, jolloin VPg jää osaksi viruspartikkelia. [4, s ] HCpro:ta (helper component proteinase) tarvitaan potyviruksen kirvavälitteisessä leviämisessä. Se on osallisena myös muissa viruskierron vaiheissa, kuten replikaatiossa ja viruksen solusta soluun liikkumisessa. HCpro estää myös kasvien tärkeintä puolustusmekanismia, RNA-hiljennystä, viruksia vastaan. [5, s ] Molemmat näistä tutkituista proteiineista ovat tärkeitä viruksen infektiivisyydelle eli kyvylle tartuttaa kasvi sekä viruksen patogeenisyydelle eli kyvylle saada aikaan voimakas virustartunta.

12 Kasvi viruksen isäntänä Virukset eivät kykene liikkumaan itsenäisesti kasvista toiseen ja ovat myös täysin riippuvaisia elävästä solusta. Tästä johtuen virukset pyrkivät löytämään uuden isännän edellisen alkaessa kuolla. Viruksettoman kasvin on oltava vioittunut ja kosketusetäisyydellä tartunnan saaneesta kasvista, jotta virus pääsee valtaamaan sen solukon. Jotkut kasvivirukset kykenevät lisääntymään myös hyönteisissä. Viruksen kyky lisääntyä hyönteisessä ei kuitenkaan ole edellytys hyönteisen toimimiselle viruksen siirtäjänä, sillä esim. kirvavälitteisessä tartunnassa viruspartikkelit kiinnittyvät kirvan imukärsään ja huuhtoutuvat ulos seuraavaan kasviin, jossa kirva ruokailee. Mitkään kasvivirukset eivät kuitenkaan kykene lisääntymään lämminverisissä eläimissä tai ihmisissä, eivätkä leviämään niiden välityksellä. [1, s ] Viruskokeissa, jotka tehdään yleensä kasvatushuoneissa tai kasvihuoneissa, virukset voidaan inokuloida kasveihin eri menetelmillä, joissa joko inokuloidaan kasvit kokonaisilla viruspartikkeleilla tai tehdään geeninsiirto DNAmuotoon muutetulla viruksen genomilla. Menetelmiä on useita, joista esimerkkeinä voidaan mainita edellä mainittu kirvavälitys-menetelmä ja menetelmä, jossa viroottisen lehden mehua hierotaan terveen lehden pintaan. Jauhettuun viroottiseen lehteen lisätään carborundum-hiomajauhetta, minkä jälkeen seosta hierotaan lehden pintaan, jolloin hiomajauhe rikkoo lehden pinnan ja virus pääsee lehden sisään. Toisena esimerkkinä toimii geeninsiirtoon perustuva geenipyssy-menetelmä, jossa kasvin lehteä ammutaan kultapartikkeleilla, jotka on päällystetty viruksen genomilla. Sen lisäksi on myös agroinfiltraatio-menetelmä, jossa lehteen ruiskutetaan viruksen genomia plasmidissaan kantavaa agrobakteeria. Viimeksi mainittua menetelmää käytettiin tämän työn yhteydessä. [21.] Geneettisesti muokattujen virusten suljettu käyttö toteutuu kasvatushuoneissa ottamalla huomioon Geenitekniikan lautakunnan määrittämät yleisohjeet. Termi suljettu käyttö viittaa Geenitekniikan lautakunnan säädöksiin, joiden mukaan geneettisesti muokattuja organismeja on pidettävä ns. suljetulla alueella jokaisen organismin riskiluokituksen määrittelemän tason mukaisesti. Tässä työssä käytettyjen virusten ja agrobakteerien GMO-luokitus oli 2 ja

13 5 työn yhteydessä noudatettiin Geenitekniikan lautakunnan määrittämiä säädöksiä kyseisen tason kasviviruksista. [6.] Virukset aiheuttavat kasveille erilaisia oireita kasvista ja viruksesta riippuen. Yleisimpiä virustautien tunnusmerkkejä ovat mosaiikkimainen kirjavuus, lehtien kurttuisuus sekä rengaslaikut. Luonnossa elävät kasvit ovat hyvinkin usein useamman viruksen tartuttamina ja yksittäisen viruksen havainnointi saattaa siis olla hankalaa. Itse isäntäkasvin tappaminen tai vakavien oireiden aiheuttaminen ei ole virukselle eduksi, joten se pyrkii pitämään isäntäkasvin elossa mahdollisimman pitkään. Maatalous- ja puutarhakasveja vaivaavat virustaudit heikentävät yleensä satoa tai sadon laatua, joten ne aiheuttavat mm. taloudellisia tappioita. [1, s ] Kasvikokeen suorittaminen Agrobakteerivälitteisen transientin geeninsiirron tarkoituksena on tartuttaa virus kasviin. Oireiden ja virukseen lisätyn GFP-geenin (green fluorescence protein) tuottaman GFP-fluoresenssin seuraamisella yritetään havainnollistaa tartutetun viruksen leviämistä itse kasvissa. Kasvin ylimmät täysikasvuiset lehdet tartutetaan viruksella agrobakteerivälitteisesti, minkä jälkeen virus alkaa levitä kasvissa sen normaalien kasvutoimintojen yhteydessä. Leviäminen ei kuitenkaan tapahdu hetkessä, sillä viruksen leviäminen on riippuvainen kasvin kasvunopeudesta ja muista olosuhteista. Tartutettujen kasvien vertailukohteeksi osa kasveista valetartutetaan, jotta nähtäisiin reagoiko kasvi itse infiltrointiin vai pelkästään tartutettuun virukseen. Valetartutuksella tarkoitetaan plasebo-liuoksen ruiskuttamista kasviin. Tästä syystä on tärkeää, että jokaista tartutettua lajiketta kohden on useampi valetartutettu kasvi, sillä erot voivat olla myös lajikekohtaisia. Viruspitoisuuden tutkimiseen käytetään ELISA-testiä. [21.] ELISA-testin tarkoituksena on selvittää vasta-aineen avulla, löytyykö tutkittavasta näytteestä tiettyä virusproteiinia. Testin avulla määritetään rinnakkaisnäytteiden avulla tutkittavan proteiinin pitoisuus. ELISA-testissä käytetyn levyn kaivoihin on kiinnitetty proteiineja sitovaa vasta-ainetta, jonka avulla pienimmätkin pitoisuudet saadaan selville. PVA:ta testattaessa ELI-

14 6 SA:ssa käytettiin viruksen kuoriproteiinia vastaan tehtyä vasta-ainetta sitomaan viruspartikkelit kaivoihin. Sitoutuneen viruksen määrää mitattiin saman vasta-aineen konjugoidulla versiolla, joka antaa värireaktion substraatin kanssa. 2.2 Proteiini-proteiini-vuorovaikutusten havainnointi Tässä tutkimuksessa keskityttiin hiivan kaksihybrisysteemin avulla seuraamaan proteiinien fyysisiä vuorovaikutuksia (interaktioita). Kaksihybridisysteemeistä yleisimmin käytössä on GAL4-menetelmä. Hiivan kaksihybridisysteemistä kerrotaan tarkemmin kappaleessa 2.5. Seuraavaksi esitellään muutama muu menetelmä, joilla tutkitaan proteiiniproteiini-vuorovaikutuksia. Seuraavia menetelmiä ei kuitenkaan käytetty tämän tutkimuksen yhteydessä, vaan ne toimivat yleisinä vertailukohteina. Biomolekyylinen fluoresenssikomplementaatio Biomolekyylisen fluoresenssikomplementaation (bimolecular fluorescence complementation, BiFC) avulla pystytään visualisoimaan proteiinien välisiä vuorovaikutuksia elävissä soluissa. Tekniikka perustuu fluoresoivan proteiinin puolittamiseen kahdeksi fluoresoimattomaksi fragmentiksi, jotka muodostavat fluoresoivan kompleksin vasta yhdessä. Tämä kompleksi voidaan saada syntymään, jos fluoresoimattomat fragmentit fuusioidaan kahteen proteiiniin, jotka ovat vuorovaikutuksessa keskenään. Kuvan 2 on kaavakuvassa fluoresoimattomat fragmentit yhdistyvät ja täten rupeavat tuottamaan fluoresenssia kompleksina. Kuvassa 2 on myös nähtävissä BiFC-analyysista saatu esimerkkikuva, jossa tutkitun proteiiniparin interaktiolla on tuman sisällä pistemäinen lokalisaatio. [8, s ]

15 7 Kuva 2. Kaavakuva BiFC:n toiminnasta sekä analyysin jälkeinen kuva [8] Immunopresipitaatio Immunopresipitaatio (immunoprecipitation) on tekniikka, jossa käytetään proteiineille spesifisiä vasta-aineita poistamaan proteiinit liuoksesta. Vastaaine proteiinikompleksit saostetaan pois liuoksesta lisäämällä liuokseen vasta-aineen sitomisproteiinien liukenematonta muotoa. Kuvasta 3 voidaan nähdä, kuinka tämä käytännössä tapahtuu puhdistettaessa yhtä haluttua proteiinia muiden joukosta. Jos vasta-aineen tunnistamaan proteiiniin (kuva 3, punainen pallo) on sitoutunut muitakin proteiineja, ne saostuvat tunnistetun proteiinin mukana ja saannos voidaan analysoida pelletistä. [9.] Kuva 3. Immunopresipitaatio A- ja G-proteiineilla [9] Kuten kaikissa menetelmissä, myös edellä mainituissa on hyötynsä ja haittansa. Seuraavaksi luetellaan muutamia eroja näiden kahden menetelmän välillä.

16 8 BiFC-menetelmällä visualisoidaan interaktioita elävissä soluissa, jolloin se vaatii interaktioiden suoraa havainnointia ilman solujen normaalin ympäristön aiheuttamaa häiriötä. Eräs rajoittava tekijä BiFC-menetelmässä on aikaa vievä fluoroforeettinen kypsyminen. Se heijastaa kemikaalisia reaktioita, joita tarvitaan fluoroforin syntymistä ohjaavassa kierrossa. Fluoroforeettisen kypsymisen vaatiman ajan takia nopeiden muutosten reaaliaikainen havainnointi ei ole mahdollista BiFC-menetelmällä. [8, s ] Immunopresipitaatio vaatii proteiinien koon ja laadun tarkistamisen SDS- PAGE:lla ennen työn suorittamista, jotta oikea määrä vaadittavia reagensseja pystytään laskemaan. Proteiini-proteiini-vuorovaikutukset saadaan selville immunopresitoimalla toinen proteiini ja blottaamalla toinen. Menetelmän avulla selvitetään vaikeasti havaittavissa olevia proteiinikomplekseja. [9.] 2.3 Hiivan kaksihybridisysteemi (Yeast Two Hybris System, YTHS) Periaate Hiivan kaksihybridisysteemiä käytetään proteiini-proteiini-vuorovaikutusten tutkimiseen hiivassa käyttäen kahta domeenia. DNA-kiinnitysdomeeni (DNA binding domain, BD) tunnistaa tietyn sekvenssin DNA:sta, joka sijaitsee merkkigeenien promoottoreissa hiivan genomissa. Aktivaatiodomeeni (activation domain, AD) koordinoi transkriptioon tarvittavia elementtejä ja hiljentää RNA-polymeraasi II:n kääntääkseen spesifisen välittäjä-geenin vastakkain kiinnitysdomeenin kanssa. [10, s ] Kaksihybridisysteemiä käytettäessä kohdeproteiini (X) ekspressoidaan fuusiona kiinnitysdomeeniin ja toinen kohdeproteiini (Y) ekspressoidaan taas fuusiona aktivaatiodomeeniin. Fuusioidut vektorit transformoidaan hiivasoluihin, joista toinen sisältää kiinnitysdomeenia koodaavan sekvenssin fuusioituna kohdeproteiinin (X) sekvenssiin ja toinen aktivaatiodomeenia koodaavan sekvenssin fuusioituna kohdeproteiinin (Y) sekvenssiin. Jos kohdeproteiinit X ja Y joutuvat kosketuksiin keskenään, myös domeenit yhdistyvät. Tämä yhdistyminen aktivoi välittäjä-geenin ekspression, joka on nähtävissä kuvassa 4. [10, s ]

17 9 Hiivasysteemiin kloonattaessa lisätään alukkeisiin templaattiin sitoutuvien kohtien lisäksi restriktioentsyymien tunnistuskohdat. Alukkeet on suunniteltu pitämään lukukehys samana siirryttäessä AD- ja BD-alueilta kloonatun proteiinin alueelle. Jos lukukehys ei pysy samana, translaatio häiriintyy, eikä hiivasolu kykene tuottamaan täyspitkää fuusioproteiinia. Kuva 4. DNA-BD ja -AD liitettyinä yhteen aktivoidakseen reportteri-geenin transkription. [11] pgadt7 AD -vektori (101) pgadt7 AD on hiivan ekspressiovektori, joka on suunniteltu ilmentämään haluttua proteiinia tämän liittyessä GAL4-aktivaatiodomeeniin. GAL4 AD:hen fuusioitunut translaatiotuote sisältää N-terminaalisen SV40- tumalokalisaatio-signaalin, jonka avulla pystytään kohdistamaan proteiini hiivan tumaan. Vektori sisältää ampisilliini-resistenssigeenin (Amp r ) E. coli - selektiota varten sekä leusiini-aminohappo -synteesin mahdollistavan LEU2- markkerin hiiva-selektioita varten. [12, s. 1-3.] Kuvassa 5 voidaan nähdä sen plasmidikartta. [13].

18 10 Kuva 5. Vektorien pbpkt7 ja pgadt7 plasmidikartat pgbkt7-vektori (103) pgbkt7-vektori ilmentää testiproteiinit fuusiona GAL4-proteiinin DNA:han sitoutuvan domeenin kanssa. Hiivassa fuusio-proteiinit havaitaan suurten ADH1-promoottorimäärien avulla. Vektorilla on kanamysiiniresistenssigeeni (Kan r ) E. coli -selektiossa ja aminohapposynteesiä koodaava TRP1-markkeri (tryptofaani) hiiva-selektioissa. [14, s. 1-2.] Kuvassa 5 voidaan nähdä sen plasmidikartta. [13] Hiivan kasvatus selektiomaljoilla Kun molemmat plasmidit on transformoitu hiivaan, hiiva kykenee kasvamaan synteettisellä aminohappo-vajaalla alustalla, jolta puuttuvat plasmidiselektion aminohapot leusiini ja tryptofaani. Interaktion todentamiseen voidaan hyödyntää useita reportterigeenejä. Kaksi reportterigeeneistä mahdollistaa hiivan kasvun aminohapposelektioalustalla, jolta puuttuvat adeniini ja histidiini. Toisaalta myös väriselektiota, alfa- tai beta-galaktosidaasiaktiivisuus, voidaan käyttää interaktion havaitsemiseksi ja mittaamiseksi.

19 Kasvitransformaatio Agrobakteerivälitteinen geneettinen transformaatio on monivaiheinen prosessi, joka alkaa, kun virulentti agrobakteeri tunnistaa haavoittuneen isäntäsolun. Tässä työssä se tapahtui petunia-kasvin lehden solujen transformaatiolla agrobakteerin avulla, agrobakteerin tarttuessa kasvisolun pintaan ja lähettäessä sen sisään T-DNA:n, joka sisältää pätkän plasmidia, jossa on viruksen genomi. Agrobakteeri levittää suuren määrän proteiineja sekä käyttää useita molekyylikoneistoja saadakseen transformaation käyntiin. Kromosomaalisen virulenssin koodaamat proteiinit välittävät viruksen tunnistuksen ja kiinnityksen isäntäsoluun. Tämä edesauttaa liikkuvan T-juosteproteiinin kompleksia sekä sen kulkeutumista isäntäsoluun. Viruksen päästyä isäntäsolun sisälle, isäntäsolun sytoplasma, useat virusproteiinit sekä osia isäntäsolun rakenteista toimivat yhdessä saadakseen T-kompleksin isäntäsolun genomiin. [15, s ] 2.5 PCR- ja pesäke-pcr -reaktiot Polymeraasiketjureaktiolla (PCR) monistetaan DNA-jaksoja, jotka sijaitsevat kahden nukleotidijärjestykseltään tunnetun DNA-jakson välissä. Koska monistettavan DNA-jakson sekvenssi määrää käytettävien alukkeiden sekvenssin, yhtä alukeparia ei yleensä voi käyttää kuin vain yhteen PCRsovellukseen. Monistettavan DNA-jakson pituus voi vaihdella alle sadasta emäsparista tuhansiin emäspareihin ja mm. tämä sekä alukkeiden ainutlaatuisuus johtavat siihen, että ei ole olemassa yhtä yleispätevää PCR -reaktioohjetta, vaan yleensä jokaisen PCR-reaktion olot pitää optimoida erikseen. [16, s ] Pesäke-PCR on menetelmä, jossa plasmiditemplaatti saadaan suoraan pesäkkeestä ilman plasmidin puhdistusta. Muutoin pesäke-pcr:ssä käytetään samalla tavalla reagensseja kuin tavallisessa PCR-reaktiossa. Erona on monistettavan tuotteen lisääminen, josta menetelmä on saanut myös nimensä. Kasvatusmaljalta siirrostetaan pipetin kärjen avulla yksi kokonainen pesäke tai osa pesäkkeestä PCR-putkeen. Kärjen toisesta päästä työnnetään hansikoidulla sormella sormipipetinomaisesti kapillaarineste pois kärjestä takaisin PCR

20 12 putkeen. Kärjellä vedetään viiva uudelle maljalle, jonka tarkoituksena on toimia puhdasviljelmänä jatkotoimenpiteitä varten. Tehty varmistusmalja laitetaan kasvatukseen yön yli 37 C:seen. Putket ajetaan lähes normaalin PCR-ohjelman mukaan. Poikkeuksena on pidempi ensimmäinen denaturaatio bakteerisolujen rikkomiseksi, jotta templaatti varmasti vapautuu polymeraasille. Menetelmää käytetään avuksi kloonauksessa, etsittäessä ligaation jälkeisen transformaation tuottaneista pesäkkeistä sellaisia, jossa ligoitu insertti on paikallaan ja oikeansuuntainen. 3 KOKEELLINEN OSA 3.1 Työn tarkoitus Työn tarkoituksena oli tutkia eri menetelmillä kasvien ja potyvirusten välisiä vuorovaikutuksia. Virusproteiinin ja kasviproteiinin vuorovaikutusta tutkittiin transformoimalla tutkittuja proteiineja sekä niiden mutatoituja muotoja ilmentävät plasmidit hiivaan, jonka jälkeen transformoidulle hiivalle tehtiin interaktioselektiot. Transformoidusta hiivasta valmisteltiin myös proteiininäytteet, joista tutkittujen proteiinien ilmentyminen hiivassa sekä oikea koko tarkistettiin Western Blot -menetelmällä. Työn toisessa osassa tutkittiin PVA:n kykyä tartuttaa perunan lähisukulaista, Petuniaa. Kasvikokeessa Petuniat tartutettiin viruksella agrobakteerivälitteisesti, ja viruksen leviämistä seurattiin kirjaamalla virusoireiden näköiset muutokset kasveissa, havainnoimalla geenimuokatun viruksen tuottaman fluoresenssin näkymistä kasvissa sekä mittaamalla viruksen määrää kasvin ylälehdissä ELISA-menetelmällä. Työvaiheissa käytettyjen liuosten koostumukset ovat nähtävissä liitteessä.

21 Kasvien tartutus Agrobakteerien kasvatus ja agroinfiltraatio Petuniaan Tässä työvaiheessa oli tarkoituksena tartuttaa kolmeen eri Petunialajikkeeseen kahta perunan A-viruksen rotua ja tarkkailla niiden leviämistä UV-valohavainnoilla ja ELISA-testin avulla kussakin lajikkeessa. Virustartutus tehtiin agrobakteerivälitteisesti. Agrobakteereissa olevissa plasmideissa oli virusten genomien infektionaaliset kopiot, jotka siirtyivät agrobakteerin tekemässä geeninsiirrossa kasviin. Kasvikoetta varten valittiin kolme Petunia-lajiketta, joiden siemenistä kasvatettiin kasveja tulevaa koetta varten. Pyrkimyksenä oli saada hyväkuntoisia ja terveitä kasveja, joihin sitten tartutettaisiin PVA. Kasveihin sovellettiin normaaleja kasvatusmetodeja standardoiduissa kasvatushuoneolosuhteissa. Työssä käytetetyt virukset olivat: PVA-B11 eli perunan A-virus, rotu B11 PVA-B11-GFP eli perunan A-virus, geneettisesti muokattu rotu B11, joka tuottaa GFP:tä virusinfektoituneissa kasvisoluissa Agro GV2260 eli valetartutus eli plasebo Bakteerikasvatus aloitettiin siirrostamalla yksi hiivapesäke 20 ml:aan LBelatuslientä, joka sisälsi oikean selektion bakteerin vaatimia antibiootteja. PVA:n binääriplasmidissa sisältämät agrobakteerit kasvatettiin Kan-, Rif- ja Cb-selektiossa [liite, s. 1] ja GV2260-agrobakteerikanta ilman binääriplasmidia ainoastaan Rif- ja Cb-selektiossa. [liite, s. 1]. Liemen sisältävät Falcon - putket laitettiin yön yli kasvatukseen +28 C 210 rpm. Putket sentrigugoitiin Eppendorf Centrifuge 5810R -laitteessa 3000 G 10 min ajan huoneenlämmössä. Liemi kaadettiin varovasti pois ja pelletit resuspensoitiin osittain n. 5 ml infiltraatiopuskuria. Tämän jälkeen liemien OD arvot tarkastettiin ja liemiä laimennettiin infiltraatiopuskurilla, kunnes OD 600 -mittauksella absorbanssi saavuttaisi lukeman 0,5. Vaadittavan lukeman il-

22 14 mentävistä laimennoksista tehtiin vielä 1:10 -laimennokset, joita inkuboitiin 2 h 30 min huoneenlämmössä. Viimeisimmän 1:10 -laimennosten avulla varmistettiin, ettei kasvi kärsi liian suuresta agrobakteeri -määrästä. Tartutusta varten kasvatetut Petunia-lajikkeet (Petunia hybrida W138, W115 ja V26) jaettiin tasaisesti kolmeen osaan käsittelyä varten. Kolmella jaottoman kasvimäärän kohdalle osuessa valetartutukseen käytettiin useampaa kasvia. Tartutettujen kasvien määrä on nähtävissä taulukossa 1. Taulukko 1. Tartutettujen kasvien lukumäärä kussakin käsittelyssä Kasvi Virus B11 B11 GFP GV 2260 Petunia V Petunia W Petunia W Infiltrointi aloitettiin tekemällä pipetin kärjellä reiät 2-4 lehteen riippuen lehden koosta. Rei ittäminen helpottaa lehteä vastaanottamaan infiltroitua nestettä. Jokaiseen lehteen ruiskutettiin 10 ml:n muoviruiskulla sopiva määrä laimennettua agrobakteeri -lientä lehden alapuolen kautta. Alapuolelta ruiskuttaminen helpottaa nesteen leviämisen näkemistä ja pipetin kärjellä tehty reikä helpottaa infiltroidun lehden tunnistamista myöhemmässä tarkkailussa. Kasvien oireita, esim. lehtien kurttuisuutta, tarkasteltiin silmämääräisesti seuraavien kolmen viikon aikana. Fluoresenssiproteiinia tuottavan B11-GFPviruksen leviämistä kasveissa tarkasteltiin UV-valon avulla. Kasveista otettiin lehtinäytteet 7, 14 ja 21 päivän välein ja näytteet tutkittiin ELISAmenetelmällä viruskonsentraation selvittämiseksi.

23 ELISA-testi Tässä osuudessa tarkastellaan infiltroidun viruksen kulkeutumista ylälehtiin ja kasvukonsentraatiota saman kasvin eri lajikkeissa. Ensimmäisessä ELISA-testissä käytettiin vahingossa soluviljelyyn tarkoitettua 96-kuoppalevyä tavallisen ELISA-levyn sijaan. Tämä ei kuitenkaan aiheuttanut suurta haittaa, sillä ensimmäisen viikon jälkeen ei ollut edes oletettavissa, että virus olisi vielä kerinnyt leviämään. Työ aloitettiin päällystämällä kuoppalevy perunan A-viruspartikkelien kuoriproteiinin tunnistavalla 58/0-vasta-aineella 1:1000 laimennoksena päällystyspuskurissa [liite, s. 2-3]. Jokaiseen kuoppaan pipetoitiin 100 µl laimennettua vasta-ainetta. Levy peitettiin teipillä ja jätettiin inkuboitumaan +37 C:seen 3 h:n ajaksi. Inkubaation aikana käytiin keräämässä näytteet kasveista. Jokaisesta kasvista otettiin yksi ylälehti erilliseen näytepussiin. Lehdet punnittiin ja pusseihin lisättiin painon mukaan 1:10-laimennoksen mukaan näytepuskuria [liite, s. 2-3]. Lehdet jauhettiin vahvaseinäisissä muovipusseissa koeputken päällä hangaten. Murskattuja lehtiä pidettiin jäillä, kunnes kasvisakka oli laskeutunut. Murskatuista lehdistä tehtiin vielä 1:20 laimennokset 1,5 ml Eppendorf -putkiin levylle pipetoimista varten. Kaivot tyhjennettiin kippaamalla levy nopeasti ja lyömällä paperipyyhkeitä vasten kunnolla. Kaivot huuhdeltiin pesupuskurilla [liite, s. 2-3], minkä jälkeen uusi kippaus ja inkubointi pesupuskurilla 2 x 4 min ajan. Tämän jälkeen kaivot tyhjennettiin jälleen ja jokaiseen kaivoon pipetoitiin 100 µl kontrollinäytteitä (PVA virions 1500 ng/µl). Kolmeen kaivoon tuli pelkkää näytepuskuria sekä viisi standardikaivoa, joissa oli 1:5 -laimennossarjaa (200 ng, 40 ng, 8 ng, 1,6 ng ja 0,32 ng puhdistettua virusta kaivoa kohden) käyttäen tehdyt standardit. Jokaiselle näytteelle pipetoitiin kolme rinnakkaisnäytettä vertailua varten. Levy peitettiin taas teipillä ja laitettiin inkuboitumaan +4 C:seen yön yli. Seuraavana päivänä levy pestiin kuten edellä. Kaivoihin lisättiin 100 µl entsyymikonjugoitua 58/0-AP-vasta-ainetta 1:4000-laimennettuna näytepuskuriin [liite, s. 2]. Levy peitettiin jälleen teipillä ja inkuboitiin +37 C:ssa 3 h.

24 16 Tällä välin substraattipuskuri [liite, s. 2-3] otettiin huoneenlämpöön seisomaan. Kun liuos oli lämmennyt huoneenlämpöön, lisättiin siihen yksi substraattipilleri [liite, s. 2-3] ja sekoiteltiin, kunnes pilleri liukeni. Levy pestiin jälleen kuten edellä, minkä jälkeen pipetoitiin substraattiliuosta [liite, s. 2-3] 100 µl jokaiseen kaivoon ja odotettiin reaktiota. Ensimmäiset värireaktiot tulevat yleensä näkyviin 1-2 tunnin kuluessa. Levy mitattiin Bio-Rad Microplate reader -laitteella 405 nm:n aallonpituudella, kun korkeimman standardin absorbanssi ylitti arvon 2,5. Tämä vaati kuitenkin levyn pitämistä +4 C:ssa yön yli ensimmäisellä kerralla, sillä reaktio oli erittäin hidas. Muissa ELISA-kokeissa käytettiin oikeanlaista levyä (ELISA-plate, Microlon, 96 W, flat-bott., high binding. Valmistaja: Greiner bio-one, Saksa. Tuotenumero ). Toisella ja kolmannella kerralla substraattireaktioon kului noin 3 h. Levyjen lukemisen jälkeen tulokset analysoitiin Microplate Manager 5.2 -ohjelmalla. 3.3 Hiivan kaksihybridisysteemi Kloonaus hiivavektoreihin Tässä osuudessa kerrotaan hiivan viruksen kaksihybridisysteemiin liittyvistä välivaiheista. Työssä kloonattiin hiivasysteemiin osa interaktiotesteissä käytetyistä mutanteista. Muut interaktiotesteissä käytetyt plasmidit (kontrolliplasmidit) on tilattu Clontechilta tai kloonattu aiemmin professori Jari Valkosen laboratoriossa (alkuperäiset mutatoimattomat kasvi- ja virusgeenit sekä osa mutanteista). Taulukossa 2 nähdään sekä VPg:n, että HCpro:n mutanttien kloonauksessa käytetyt alukkeet ja niiden sekvenssit sekä annealinglämpötilat. Näitä muuttujia sovellettiin kloonausten yhteydessä reaktiotaulukoihin.

25 17 Taulukko 2. VPg:n ja HCpron:n PCR-reaktioiden alukkeet. F = forward-aluke ja R = reverse-aluke. Geeni Aluke Sekvenssi Annealing ( C) PCR- reaktio VPg VPg-YHTS (F) 5 -CCGGGATCCGTGG- CTATAATAAGC-3 58 VPg-YHTS (R) 5 -CCGGTCGACCTCG- AATTCAACCGAC-3 HCpro HC123-5 acg5 GGATCCGTTATTC- 56 BamHI (F) AACAGGGGATGTTTTC-3 HC123-3 SalI (R) atat 5 -GTCGACCTATCCA- ACCCTGTAGTGCTTC-3 Pesäke- PCR VPg 5 AD 5 - AACTGTGCATCG- TGCACCATCT-3 3 AD 5 -AGATGGTGCA- CGATGCACAG BD 5 -GTAATACGACT- CACTATAGGGCG-3 3 BD 5 -GACTCTTAGGTT- TTAAAACGAAAA-3 HCpro HCpro 11 (F) 5 -TTGGATGAT- GGCACTCC AD (R) 5 -AGATGGTGCA- CGATGCACAG-3 Seuraavat työvaiheet suoritettiin sekä VPg:lle että HCpro:lle. Molempien geenien PCR-reaktioissa käytettiin samoja ohjelmia pois lukien muuttujat taulukossa 2. Työ aloitettiin monistamalla haluttu kohta vektorista PCRreaktiolla, jonka reagenssit ovat nähtävissä taulukossa 3.

26 18 Taulukko 3. VPg-plasmidin kloonaukseen pipetoitujen reagenssien määrät 50 µl:n reaktioon [Liite, s. 3] Reagenssi Loppukonsentraatio Pipetoitu (µl) 5 x reaktiopuskuri 1 x mm dntps 0,2 mm 1 Primer-F 0,6 pmol/µl 2,5 (30 pmol/µl) Primer-R 0,6 pmol/µl 2,5 (30 pmol/µl) Templaatti - 1 Finnzymes Phusion 2U/µl 0,02 U/µl 0,5 MilliQ water - 32,5 Sekä VPg:n että HCpro:n PCR-reaktiossa käytettin ajo-ohjelmaa, joka on nähtävissä taulukossa 4. Taulukko 4. Kloonauksen PCR-ajo-ohjelma Sykli (kpl) Lämpötila ( C) Aika (T) s s 29 58/56 20 s s min - 4 pito Seuraavaksi kuvaillaan tarkemmin, kuinka inserttien kloonaaminen hiivavektoreihin suoritettiin.

27 19 Hiivavektoreihin pgadt7 ja pgbkt7 kloonattiin perunan A-viruksen VPgproteiinia koodaavia osia. Hiivavektoriin pgadt7 kloonattiin perunan A- viruksen mutatoitua HCpro-proteiinia koodaava osa (HCpro, mutantti A). PCR-reaktiossa VPg:n templaattina käytettiin kahta plasmidia, jotka sisälsivät kaksi eri PVA:n VPg-mutanttia, VPg-C 1 ja VPg-C 2 puc18-plasmidissa. HCpro, mutantti A:n kloonauksessa käytettiin samoja määriä reagensseja kuin taulukossa 5 mainitaan. Templaattina oli kuitenkin mutatoidun HCpro:n sisältävä perunan A-viruksen infektionaalisen kloonin osa plasmidissa pgem-t. Saaduista PCR-tuotteista tehtiin varmistusgeeli, minkä jälkeen tuotteet puhdistettiin e. Z. N. A. Gel Extraction-kitin (PLN 350-1KT) ohjeen mukaisesti, sillä PCR:ssä käytetyssä puskurissa saattaa esiintyä seuraavia vaiheita haittaavia ainesosia. Puhdistuksen jälkeen PCR-tuotteille sekä kohdeplasmideille tehtiin digestiot yhteen sopivien päiden katkaisemiseksi. Digestiot puhdistettiin edellä mainitun kitin ohjeen mukaisesti. Taulukossa 5 nähdään pipetointimäärät. Taulukko 5. VPg:n ja HCpro:n digestiossa käytetyt reagenssit. VPg- ja HCpro -PCR-tuotteet digestoitiin entsyymiparilla BamHI ja SalI, PGADT7 digestoitiin VPg:ta ja HCpro:ta varten parilla BamHI/XhoI ja pgbkt7 VPg:ta varten parilla BamHI ja SalI. [Liite 1, s. 3.] Reagenssi Loppukonsentraatio Pipetoitu (µl) 10 x reaktiopuskuri 1 x 10 Entsyymi I 0,2 U µl 3 Entsyymi II 0,2 U/µl 3 Templaatti DNA MilliQ water µl asti Seuraavaksi hiivavektoreihin kloonatuille näytteille tehtiin ligaatio (taulukko 6), jotta leikattu insertti liittyisi plasmidiin.. Näytteiden DNA-konsentraatiot tarkistettiin GE Gene Quant laitteella.

28 20 Taulukko 6. Ligaatio. Reaktion lopputilavuus 20 µl. Digestoidut vektorit: vektori PGADT7 digestoitu VPg:ta ja HCpro:ta varten parilla BamHI/XhoI ja vektori pgbkt7 VPg:ta varten parilla BamHI ja SalI. Digestoidut PCR-tuotteet: VPg- ja HCpro -PCR-tuotteet digestoitu BamHI ja SalI -entsyymiparilla. Reagenssi Loppukonsentraatio Pipetoitu (µl) 1 x rapid 1 x 10 ligation buffer T4 DNA ligase 3 U/µl 0,3 U/µl 1 Digestoitu vektori - 1,5 (50 ng) Digetoitu PCR-tuote - 0,5 (150 ng) MilliQ water - 7 Ligaatio-tuotteista tehtiin transformaatio kompetentteihin DH5 -soluihin. Transformaatiosta saaduille pesäkkeille tehtiin pesäke-pcr, jotta varmistuttiin sisältävätkö pesäkkeissä olevat plasmidit ligaation avulla liitetyn insertin vai eivät. Alukkeina käytettiin insertin sisälle sitoutuvaa inserttispesifistä aluketta ja vektoriin monikloonauskohdan ulkopuolelle sitoutuvaa yleisaluketta. Pesäke-PCR:n reagenssit ovat nähtävissä taulukossa 7.

29 21 Taulukko 7. Pesäke-PCR:n reagenssit 20 µl:n reaktioon. Temlaattina toimi bakteeripesäke. Reagenssi Loppukonsentraatio Pipetoitu (µl) 10 x reaktiopuskuri 1 x 2 10 mm dntps 0,2 mm 0,4 Primer-F 1,5 pmol/µl 0,8 (30 pmol/µl) Primer-R 1,5 pmol/µl 0,8 (30 pmol/µl) 25 mm MgCl 2 2,5 mm 2 Taq 5 U/µl 0,5 U/µl 0,1 MilliQ water - 32,5 Pesäke-PCR:n ajo-ohjelma on nähtävissä taulukossa 8. Taulukko 8. Pesäke-PCR-ohjelma Sykli (kpl) Lämpötila ( C) Aika (T) min s 29 52/48 30 s 72 1 min min min - 16 pito

30 22 Pesäke-PCR:n jälkeen ajettiin varmistusgeeli, jonka avulla selvitettiin insertin sisältäneet pesäkkeet. Insertin sisältävistä pesäkkeistä valittiin muutama, joista tehtiin nestekasvatukset plasmidi-dna:n eristämiseksi. Nestekasvatuksista valmistettiin plasmidi-dna:ta, jonka eristämiseen käytettiin Sigma GenElute Plasmid Miniprep -kittiä (D ). Saadut plasmidi-dna:t lähetettiin sekvensointiin niiden oikeellisuuden tarkistamiseksi. Sekvensoinneista saadut kromatogrammit luettiin ja tarvittaessa editoitiin Chromas Lite -ohjelmalla [17] ja analysoitiin linjaamalla saadut sekvenssit oletettua sekvenssiä vastaan kahta sekvenssiä varten kirjoitetulla algoritmilla. [18.] E. coli :n (DH5 ) transformaatio Kompetentit E. coli -solut (DH5 ) valmistettiin Inoue-menetelmällä [19]. Kompetentteja solujen valmistus aloitettiin valmistamalla aloitusviljely, jossa tuore kolonni on haluttua bakteeria. Yksi kolonni siirrostettiin 25 ml SOBlientä [liite, s. 1] ja sitä kasvatettiin 6-8 h 37 C:ssa 210 rpm. Aloitusviljelyä pipetoitiin 10, 4 ja 2 ml kolmeen litran Erlenmeyer-pulloon, joissa kaikissa oli 250 ml SOB-lientä [liite, s. 1]. Pulloja inkuboitiin yön yli 18 C:ssa 200 rpm. Pullojen OD 600 -arvot tarkistettiin seuraavana päivänä ja mittausta jatkettiin kunnes yksi pulloista saavutti lukeman 0,55. Kun oikea lukema oli saavutettu, kyseinen pullo asetettiin jäille jäähtymään 10 minuutiksi. Toiset viljelmät heitettiin pois. Jäähdytetty viljelmä jaettiin esijäähdytettyihin 50 ml:n sentrifugiputkiin. Solut kerättiin sentrifugoimalla 2500 G 10 min 4 C Eppendorf centrifuge 5810R -laitteessa. Supernatantit heitettiin pois ja putket jätettiin ylösalaisin paperipyyhkeelle 30 s. Pelletit resuspensoitiin varovaisesti kylmällä transformaatiopuskurilla [liite, s. 1]. Putket sentrifugoitiin kuten edellä. Uusi kevyt resuspensointi 20 ml:lla transformaatiopuskuria [liite, s. 1], jonka jälkeen putkiin lisättiin 1,5 ml DMSO:a (dimetyylisulfoksidi). Sekoiteltiin heiluttamalla, jonka jälkeen putket asetettiin jäille 10 min ajaksi. Tämän jälkeen jaettiin 1,5 ml esijäähdytettyihin Eppendorf- putkiin. Jokaiseen putkeen pipetoitiin 50 µl soluja. Heti pipetoimisen jälkeen Eppendorfit upotettiin nestetyppeen, jonka jälkeen putket siirrettiin -80 C:seen säilytykseen.

31 23 E. coli -transformaatiossa voidaan käyttää -80 C:ssa pakastettuja kompetentteja soluja, sillä E. colin transformaatiotehokkuus ei laske pakastuksen aikana. Hiivan transformaatiossa taas on valmistettava joka kerta uudet kompetentit solut, sillä niiden transformaatiotehokkuus laskee pakastuksen aikana. Tavallista transformaatiota varten otettiin 100 µl kompetentteja soluja, jotta saadaan mahdollisimman paljon tuotetta. Eppendorf -putkeen pipetoitiin 8 µl ligaatio-tuotetta ja sitä inkuboitiin jäillä 30 min. Tämän jälkeen soluille annettiin lämpöshokki 42 C:ssa 1 min 30 s, jonka jälkeen putkea pidettiin jäillä 1-2 min. Putkeen lisättiin LB-lientä [liite, s. 1] 1 ml:aan asti ja putki laitettiin inkuboitumaan ravistukseen 210 rpm 37 C:seen 1 h. Sen jälkeen seosta pipetoitiin LB-Amp-maljoille 300 µl ja maljat laitettiin inkuboitumaan yön yli 37 C:seen Hiivan transformaatio Työvaiheen tarkoituksena oli transformoida hiivaan plasmidit, joissa olevien geenien koodaamien proteiinien interaktioita aiotaan tutkia. Työn suoritukseen käytettiin Clontechin Yeast transformation -manuaalia. [20, s. 6-8]. Aluksi siirrostettiin AH109-hiivapesäke YPAD-maljalle [liite, s. 1-2], jota kasvatettiin +28 C:ssa neljä vuorokautta. Puhdasviljelmältä siirrostettiin yksi pesäke 20 ml:aan YPAD-lientä [liite, s. 1-2]. Kasvatusta inkuboitiin vuorokausi +28 C:ssa. Sen jälkeen yön yli kasvatusta lisättiin suhteessa 1:50 YPAD-liemeen [liite, s. 1-2], joka laitettiin kasvamaan ravistuksessa 210 rpm +28 C:ssa n. kolme tuntia. 2,5 h alkaen kasvatuksesta otettiin näytteitä, jotka mitattiin Gene Quant spektrofotometrillä D 600 -mittauksella. Hyväksyttävä absorbanssilukema oli 0,4-0,6. Ihannelukema olisi 0,5. Kunoli saavutettu tarvittava lukema, jatkettiin jakamalla kasvatus 8 kpl:seen 50 ml Falcon-putkia, minkä jälkeen putket sentrifugoitiin 1000 x G 5 min huoneenlämmössä Eppendorf centrifuge 5810R -laitteella. Supernatantti poistettiin ja pelletit resuspensoitiin n. 5 ml 1 x TE [liite, s. 1-2]. Tämän jälkeen putkien sisältöjä yhdisteltiin, jotta jäljelle jäisi vain kaksi putkea. Uusi sentrifugointi kuten edellä. Supernatantti poistettiin jälleen ja resuspensointi

32 24 tapahtui 1 x TE/1 x LiAc -liuoksella [liite, s. 1-2]. Eppendorf -putkiin, joihin oli jo valmiiksi pipetoitu AD-plasmidia 2 µl (200 ng) ja BD-plasmidia 4 µl (400 ng), lisättiin 100 µl hiiva-kompetenttia ja kaikki putket vorteksoitiin kunnolla. Sitten putkiin lisättiin 600 µl 1 x TE /1 x LiAc /PEG 50 % -liuosta [liite, s. 1-2] ja vorteksoitiin jälleen kunnolla. Näytteitä inkuboitiin ravistuksessa 200 rpm +28 C:ssa 30 min. Inkuboinnin jälkeen jokaiseen putkeen lisättiin 70 µl DMSO:ta ja sekoiteltiin varovasti. Putket siirrettiin lämpöhauteeseen +42 C:seen 15 min, jonka jälkeen niitä pidettiin jäillä muutaman minuutin. Putket sentrifugoitiin nopeasti Heraeus FRESCO 17 centrifuge -laitteessa rpm 5 s ajan RT, jonka jälkeen supernatantti poistettiin. Pellettien päälle pipetoitiin 300 µl 1 x TE - liuosta ja pelletti resuspensoitiin naputtamalla putkea. Koko 300 µl pipetoitiin SD/ -Leu, -Trp -kasvualustoille [liite, s. 1-2] ja levitettiin. Maljat laitettiin +28 C:Seen kasvamaan 2-4 päiväksi Interaktioselektiomaljat Tämän osuuden on tarkoitus tutkia transformaatiossa saatujen pesäkkeiden kasvunopeutta sekä kykyä kasvaa alustalla, josta puuttuu neljä aminohappoa. Työvaiheessa käytettiin SD/ -Ade, -His, -Leu, -Trp -kasvualustoja [liite, s. 1-2]. Neljä maljaa jaettiin kahdeksaan sektoriin ja yhdelle maljalle tehtiin ruudukko 25 x 25 sekä positiivisen ja negatiivisen näytteen ruudut. Kasvatetuilta hiivan transformaatiomaljoilta otettiin kustakin vähintään kolme pesäkettä, joista piirrettiin merkittyyn sektoriin raita puisella siirrostustikulla. Kasvatusta jatketaan +28 C:ssa viikon ajan havainnoiden hiivan kasvua välillä. Interaktioselektiossa käytettiin Clontechin positiivisia ja negatiivisia kontrolleja. Positiivinen interaktiokontrollipari oli pgadt7-t (AD- SV40 large T- antigen) ja pgbkt7-53 (BD- murine p53), negatiivinen pgadt7-t ja pgbkt7-lam (BD- human lamin C), Clontechin ohjeen mukaisesti.

33 Transformoidun hiivan proteiininäytteet Liemikasvatus Tämän työvaiheen tarkoituksena oli valmistaa proteiininäytteitä, joiden sisältämät proteiinit erotellaan niiden molekyylikoon perusteella SDS-PAGEgeeliajolla ja tutkitut proteiinit havaitaan vasta-aineen avulla Western Blot menetelmällä. Jokaiselta interaktioselektio-maljalta (kohdissa ja valmistetut maljat) otettiin kaksi pesäkettä, jotka siirrostettiin kahteen eri 50 ml:n Falconputkeen, jotka sisälsivät 15 ml SD/ -Leu, -Trp lientä [liite, s. 1-2]. Yhteen samanlaiseen putkeen pipetoitiin 15 ml YPAD-lientä [liite, s. 1-2] ja siihen siirrostettiin yksi AH109-hiivakannan pesäke, sillä alkuperäinen hiivakanta ei kasva edellä mainitussa selektioliemessä. Putkia kasvatettiin ravistuksessa 210 rpm +28 C:ssa yön yli. Seuraavana päivänä putket sentrifugoitiin 1000 rpm 5 min huoneenlämmössä Eppendorf centrifuge 5810R -laitteessa ja supernatantti poistettiin. Pelletit jäädytettiin nopeasti upottamalla ne nestetyppeen, minkä jälkeen jäätyneet putket vietiin -80 C:seen säilytykseen Western Blot Syväjäädytyksessä olleen hiivapelletit sulateltiin jäillä seisottamalla. Sitten pellettien päälle pipetoitiin kylmää 1,85 M NaOH + 7 % -merkaptoetanoli [liite, s. 2] solujen lyysaamiseksi. Pelletti resuspensoitiin kunnolla pipetin kärjellä, pipetoimalla edestakaisin. Sen jälkeen solut siirrettiin Eppendorf putkiin ja pelletoitiin sentrifugoimalla +4 C:ssa 10 min täydellä nopeudella Heraeus FRESCO 17 centrifuge -laitteella. Presipitointiin käytettiin 100 µl 50 % TCA:ta (trikloorietyylihappo), minkä jälkeen putkien inkuboiminen jäillä 5 min ajan. Sitten putket sentrifugoitiin täydellä nopeudella 10 min huoneenlämmössä samalla sentrifugilla kuin edellä. Tämän jälkeen pelletit pestiin 400 µl 1 M TRIS -liuoksella (ph neutraali) ja sentrifugoitiin pelletiksi täydellä nopeudella samalla sentrifugilla kuin edellä huoneenlämmössä. Pestyt pelletit liuotettiin 100 µl:aan 2 x Laemli -puskuria [liite, s. 2]. Sitten putkia keitettiin 7 min, jotta päästäisiin eroon agregoituneista proteiineista. Tä-

34 26 män jälkeen putkissa olevaa supernatanttia pipetoitiin Western Blot -geelille µl. SDS-PAGE Geelit valmistettiin taulukon 9 ohjeen mukaisesti. Ohjeesta riittää kahteen geeliin Atto-SDS-PAGE -laitteessa [liite, s. 2]. Taulukko 9. SDS-PAGE -geelien sisältämät reagenssit Reagenssi Separating Gel 7,5 % Stacking Gel 4,5 % 40 % akryyliamidi 3,4 ml 0,7 ml geelipuskuri 4,5 ml 1,5 ml 10 % APS 80 µl 20 µl TEMED 10 µl 10 µl MQ 10,1 ml 3,8 ml Erotusgeeli, joka jää alapuolelle, pipetoitiin lasilevyjen väliin heti, kun TE- MED (tetrametyylietyleenidiamidi) ja 10 % APS (ammoniumpersulfaatti) oli pipetoitu niiden jähmettävien tekijöiden vuoksi. Kun erotusgeeli oli jähmettynyt, pipetoitiin kokoojageeli sen päälle. Kampa aseteltiin geelille ja odotettiin sen jähmettymistä. Sen jälkeen kaivoihin pipetoitiin 15 µl näytteitä ja laite laitettiin ajamaan 10 ma geeliä kohden. Kun kontrollibändit olivat päässeet alempaan geeliin asti, voitiin nopeutta lisätä arvoon 20mA/geeli asti, sillä näytteet kulkevat alemmassa geelissä hitaammin. Blottaus Hypond-ECL nirtocellulose Membrane (Amersham) esikasteltiin MilliQveteen, minkä jälkeen membraania uitettiin transfer-puskurissa [liite, s. 2] min. Membraanit olivat pinta-alaltaan suuremmat kuin geeli, jotta koko geelin alue peittyisi varmasti. Myös geeliä uitettiin transfer-puskurissa [liite, s. 2] 15 min ajan. Tämän jälkeen kasteltiin Extra thick blot paper (Bio- Rad) transfer-puskurissa [liite, s. 2]. Sitten rakennettiin sandwich TRANS- BLOT SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell -laitteen alle jäävään vastinkappaleeseen seuraavasti: kolme esikasteltua imupaperia, membraani, geeli ja päälle kolme uutta esikasteltua imupaperia. Ilmakuplat rullattiin jokaisen

35 27 kerroksen laittamisen jälkeen varovasti täyspipetin varrella. Laite ohjelmoitiin ajamaan 12 V 280 ma 20 min. Kun laite purettiin ajon jälkeen, piirrettiin geelien ääriviivat lyijykynällä membraaneihin, näytekaivojen paikallistamiseksi. Ajon jälkeen membraanit siirrettiin 1 x TBS-liuokseen [liite, s. 2] kuivumisen estämiseksi. Proteiinien värjäys Tämän osan tarkoitus oli varmistaa, että lataus on ollut tasainen, mikä tarkoittaa, että proteiinien määrä on kaikissa preparaateissa suunnilleen sama. Tässä osuudessa havaitaan myös ovatko proteiinit kulkeutuneet geelillä tasaisesti. Geelit pestiin blottauksen jälkeen 3 krt 10 min ajan MilliQ vedellä. Sen jälkeen geelit värjättiin 20 ml PageBlue -proteiininvärjäysliuoksella [liite, s. 2] kevyessä ravistuksessa Stovallin The Bellydancer -laitteessa yön yli. Sen jälkeen geeli huuhdeltiin astiassa 5 min MilliQ-vedellä pari kertaa ja valokuvattiin digikameralla. Immunodetektio Blokkaus Membraanit upotettiin 5 % maitojauhetta, 1 x TBS + 0,1 % Tween -liuokseen [liite, s. 2] ja ravistuksessa 1h huoneenlämmössä. Tämän vaiheen olisi voinut suorittaa myös pitämällä membraaneja ravistuksessa edellä mainitussa liuoksessa +4 C yön yli. Membraaneja ei pesty tässä välissä. Molemmat membraanit laitettiin muovipusseihin, jotka suljettiin Severin Folio -laitteella tiiviyden saavuttamiseksi. Ensimmäinen vasta-aine (AD Gal4) kiinnitettiin pipetoimalla 5 ml 2,5 % maitojauhetta 1 x TBS - liuosta [liite, s. 2], johon pipetoitiin 0,75 µl 0,2 mg/ml AD Gal4 -vasta-ainetta toisen membraanin päälle varovasti. Toisen membraanin päälle pipetoitiin 5 ml edellä mainittua liuosta, johon pipetoitiin 0,6 µl 0,25 µg/ml AD Gal4 -vasta-ainetta.

36 28 Vasta-aineliuosta levitettiin varovasti koko membraanin alueelle ja pussit suljettiin. Pussit jätettiin +4 C:seen Scientific Industries Inc. Roto-Shake Genie -laitteeseen yön yli. Pesu Membraanit pestiin kolme kertaa 1 x TBS + Tween 10 min ajan ravistuksessa Stovall The Bellydancer -laitteessa. Toinen vasta-aine (anti-mouse Ig, horse-radish peroxidase linked) kiinnitettiin membraaneihin pipetoimalla 50 ml:aan 5 % maitojauhetta, 1 x TBSliuokseen 0,5 µl peroxidase linked horse radish anti-mouse Ig:tä. Tätä liuosta kaadettiin varovasti 25 ml molempien membraanien päälle ja inkuboitiin tunti huoneenlämmössä ravistuksessa. Membraanit huuhdeltiin runsaalla määrällä 1 x TBS + Tween [liite, s. 2], jonka jälkeen ne pestiin uudelleen samalla liuoksella 4 krt 5 min ajan Stovall The Bellydancer -laitteessa. Kuvaus Valmistettiin 1:1-laimennos working-solutionia Thermo Scientificin Super signal West Femto Maximun Sensitivity Subtrate -kitin (Lot KI138487) ohjeen mukaan, pipetoitiin 500 µl membraanien päälle ja inkuboitiin 5 min huoneenlämmössä. Liuos kaadettiin pois membraanien päältä ja ylimääräinen neste kuivattiin painamalla membraanin kulmaa kevyesti imupaperiin. Membraanit kuvattiin röntgenfilmille Kodak X-Omat 1000 Professional - laitteella. Kuvauksen jälkeen membraanit huuhdeltiin vielä kerran 1 x TBS + Tween - liuoksella [liite, s. 2] ja nostettiin imupaperille kuivumaan.

37 29 4 TULOKSET JA NIIDEN TARKASTELU 4.1 Virustartutetut kasvit Agrobakteerien kasvatus ja agroinfiltraatio Petuniaan Tässä osuudessa tutkittiin virustartutettujen kasvien oireita silmämääräisesti sekä UV-valon avulla havaittavaa fluoresenssin leviämistä. B11- ja B11- GFP-tartutettuja kasveja vertailtiin valetartutettuihin kasveihin. Valetartutetuista kasveista itsestään tehtiin yleishuomioita. Valetartutetulla kasvilla tarkoitetaan kasvia, johon infiltroidaan plaseboa, jotta pystytään tarkastelemaan reagoiko kasvi pelkästään infiltraatioon vai ovatko mahdolliset muutokset kasvussa viruksesta johtuvia. Viikon kuluttua lehtiä käytiin tarkastelemassa UV-valossa ja pystyttiin havaitsemaan autofluoresenssia infiltroiduissa lehdissä. Muissa lehdissä ei ollut havaittavissa minkään asteista viruksen leviämistä. Kahden viikon kuluttua osassa lehdistä oli havaittavissa lievää sinistä fluoresenssia valetartutetuissa sekä B11-tartutetuissa kasveissa. Yhdessä B11-GFPtartutetuista kasveista oli havaittavaa fluoresointia infiltroiduissa lehdissä, mutta sekin oli mitä luultavimmin autofluoresenssiä vielä tässä vaiheessa. Monet valetartutetuista kasveista olivat alkaneet tuottaa kukkia. Kukkien värit olivat lajikkeille tyypillisiä. Kolmen viikon kuluttua sinistä fluoresenssia oli havaittavissa hieman enemmän, ei kuitenkaan merkittävästi. Tartutetuista kasveista näki selkeästi, että ne kasvavat hitaammin kuin valetartutetut. Varsien korkeudet ja sivuhaarat jäivät vajaamittaisiksi sekä V26-lajikkeen lehdissä pystyi näkemään eriävää kurttuisuutta. Tartutetuista kasveista ainoastaan W138-lajikkeen kasvit tuottivat kukan tai nupun. Kahdessa muussa lajikkeessa ei ollut havaittavissa edes alkavaa kukintaa. Valetartutetuissa kukissa oli kahden eri värin omaavia kukkia, W138-lajikkeessa oli valkoisia kukkia punaisella pigmentillä ja V26- sekä W115-lajikkeissa liloja kukkia.

38 30 Sininen fluoresenssi ei ollut haettua GFP-fluoresenssia, joka ilmenisi vihreänä lehden pinnassa. Pystyttiin siis toteamaan, ettei kasveissa ollut ulkoisesti havaittavaa virustartuntaa kolmen viikon sisällä tartutuksesta ELISA- testi ELISA-testit tehtiin viikon välein kolmen viikon ajan kasvien ylälehdistä, joihin virusten pitäisi levitä tartutetuista alalehdistä. Ensimmäisestä ELISA-testistä ei saatu kunnollisia tuloksia. Oletuksena oli, että virus alkaa ilmetä aikaisintaan 14 päivän kuluttua, jos vielä silloinkaan. Saadut absorbanssit viittasivat selkeästi siihen, ettei virus ollut kerinnyt vielä leviämään tarpeeksi. Toisessa ELISA-testissä absorbanssit olivat edelleen melko pieniä. Testiin pyrittiin valitsemaan lehtiä, joissa oli havaittu edes hieman fluoresenssia UVvalon avulla tarkastelussa. Suurin absorbanssi oli kuitenkin alle 0.1, joka kertoi viruspitoisuuden olevan edelleen liian alhainen. Alhainen absorbanssilukema viittasi siihen, että virusta ei ole tai sen määrä on niin vähäinen, että se jää detektiokynnyksen alapuolelle. Kolmanteen ELISA-testiin saatiin valittua hieman enemmän fluoresoivia lehtiä. Mikään valituista lehdistä ei kuitenkaan fluoresoinut kokonaisuudessaan, vain pieniä osia sekä kärjessä näkyvää fluoresointia. Suurimmassa osassa otetuista näytteistä ei havaittu fluoresenssia ollenkaan. Mitä ilmeisimmin virus ei levinnyt kasveissa tarpeeksi nopeasti. Tämä johtui luultavimmin liian nuoriin lehtiin infiltroimisesta, mistä johtuen kasvuvaiheessa oleva lehti ei lähde levittämään tartutettua virusta eteenpäin, vaan keskittää sitä lehden kärkiosiin. Kasvuvaiheessa oleva lehti käyttää energiaa ravintoaineiden yms. kuljettamiseen lehden kärkiosiin sen kasvun edistämiseksi. Lehden saavutettua sopiva kasvuvaihe, alkavat ravintoaineet virrata poispäin lehdestä jatkaen matkaansa ylemmäksi kasvin suonissa. Tämän virtauksen mukana kulkeutuvat myös virukset alkaen tartuttaa lisää kasvinosia. [21.]

39 31 Mockien eli valetartutettujen kasvien raja-arvo laskettiin seuraavalla kaavalla. Valetartutettujen kasvien raja-arvon määrittämiseksi piti ensin laskea jokaisen kasvin rinnakkaisnäytteiden keskiarvo ja keskihajonta erikseen. Sen jälkeen valetartutettujen kasvien keskiarvoista laskettiin keskiarvo ja keskihajonnoista keskihajonta, jotka summattiin ja kerrottiin kahdella. Näin saatiin haluttu raja-arvo. Raja arvo 2*[ ka( A) keskihajonta( B)] A = rinnakkaisnäytteiden keskiarvo B = rinnakkaisnäytteiden keskihajonta Taulukkoon 10 on laskettu jokaisen mittauspäivän rinnakkaisnäytteiden keskiarvot. Verrattaessa Mockien eli valetartutettujen laskettuja raja-arvoja näytteiden keskiarvoihin, nähdään, että ne kaikki jäävät arvon alapuolelle. Se tarkoittaa, että kasviin tartutettu virus ei ole levinnyt tai monistunut ylälehdissä tarpeeksi ylittääkseen testin detektiokynnyksen.

40 32 Taulukko 10. ELISA-testien tulosten keskiarvot lajikekohtaisesti jokaiselta mittauspäivältä. 7 vrk 14 vrk 21 vrk Käsittely Lajike ka (näyte) ka (näyte) ka (näyte) Mock W138 0,080 0,078 0,074 Mock W138 0,072 0,087 0,076 Mock V26 0,089 0,089 0,079 Mock V26 0,069 0,077 0,071 Mock V26 0,063 0,075 0,066 Mock V26 0,082 0,088 0,071 Mock W115 0,075 0,079 0,067 Mock W115 0,066 0,078 0,072 Mock W115 0,094 0,078 0,076 Mock W115 0,096 0,091 0,088 Mock W115 0,112 0,094 0,085 Mock W115 0,076 0,076 0,073 B11 W138 0,063 0,074 0,069 B11 V26 0,062 0,074 0,066 B11 V26 0,099 0,077 0,068 B11 W115 0,133 0,079 0,078 B11 W115 0,076 0,081 0,074 B11 W115 0,102 0,088 0,085 B11 W115 0,109 0,090 0,084 B11 GFP W138 0,068 0,077 0,071 B11 GFP V26 0,099 0,076 0,071 B11 GFP V26 0,068 0,082 0,069 B11 GFP W115 0,075 0,077 0,067 B11 GFP W115 0,090 0,077 0,069 B11 GFP W115 0,139 0,089 0,088 B11 GFP W115 0,132 0,106 0,086 Keskiarvo (Mock) 0,081 0,083 0,075 Keskihajonta (Mock) 0,014 0,007 0,007 Raja-arvo (Mock) 0,177 0,172 0, VPg:n kloonaus PCR PVA-VPg-PCR-ajon jälkeen ajettiin tarkistusgeeli, jossa ajettiin näyte PCRreaktioista (5 µl) (kuva 6). Geeliä tehtäessä geelikammat menivät liian syvälle, joten negatiivinen kontrolli meni pipetointivaiheessa osittain geelin läpi. Standardin sekä molempien näytteiden kaivot säilyivät ehjänä. Kuvassa 6 nähtävissä tuotteissa kummassakin on näkyvissä vain yksi juoste, jotka

41 33 ovat 0,7 ja 0,5 kb:n välissä. Geelillä oli näkyvissä vain yksi juoste kummankin näytteen kohdalla, joten voitiin todeta, ettei epäspesifisiä tuotteita ollut. Näin ollen tuotteet puhdistettiin e. Z. N. A. Gel Extraction -kitin (PLN 350-1KT) PCR-tuotteen puhdistusosuuden ohjeen mukaisesti kb 10 kb 7 kb 5 kb 4 kb 3 kb 1. GenRuler 1 kb DNA -ladder 2. VPg-C 1 3. VPg-C 2 4. Negatiivinen kontrolli 2 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,7 kb 0,5 kb Kuva 6. PCR-tuotteiden tarkistugeeli Pesäke-PCR BamHI ja SalI tai BamHI ja XhoI digestoiduille tuotteille (hiivavektorit ja kloonatut VPg-insertit) tehtiin ligaatio, jonka jälkeen ne transformoitiin. Transformaatiossa saaduista pesäkkeistä tehtiin pesäke-pcr:t. Pesäke-PCRajojen tulokset ovat nähtävissä kuvissa Kaikissa tehdyissä pesäke- PCR:ssä kaivo 16 toimi negatiivisena kontrollina. Kaikissa ajoissa ei ollut mukana positiivista kontrollia, koska sellaista ei ollut saatavana kaikille alukepareille. Kuvassa 7 nähdään kirkkaita juosteita, joista voidaan päätellä, että suurimmassa osassa pesäkkeitä on ligaatiossa kiinnitetty insertti sisällä. Kaikki tuotteet sisältävät bändit ovat 1,0 ja 0,7 kb:n välissä. Plasmidi-DNA:n valmistusta varten valittiin pesäkkeet 1 ja 2, joista numeroa 1 sekvensoitiin ja käytettiin jatkossa.

42 kb 5 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,7 kb Kuva 7. VPg:n pesäke-pcr:n tarkistusgeeli, jossa tuotteina perunan A-viruksen plasmidi, jossa sisällä VPg-C mutantti. Kaivossa 1 on GenRuler 1 kb DNA-ladder, kaivoissa 2-8 sekä hiivapesäkkeet ja kaivossa 18 negatiivinen kontrolli. Kuvassa 8 on vain neljä pesäkettä, jotka sisältävät insertin. Kaikki tuotteen sisältävät bändit ovat 1,0 kb:n kohdalla. Plasmidi-DNA:n valmistusta varten valittiin pesäkkeet 1 ja 4, joista numero 4 sekvensoitiin ja käytettiin jatkossa kb 5 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,7 kb Kuva 8. VPg:n pesäke-pcr:n tarkistusgeeli, jossa tuotteina perunan A-viruksen plasmidi, jossa sisällä VPg-C mutantti. Kaivossa 1 on GenRuler 1 kb DNA-ladder, kaivoissa 2-11 sekä hiivapesäkkeet ja kaivossa 18 negatiivinen kontrolli. Kuvassa 9 on nähtävissä useita insertin sisältäviä pesäkkeitä. Kaikki tuotteen sisältävät bändit ovat 1,0 ja 0,7 kb:n välissä. Plasmidi-DNA:n valmistukseen otettiin pesäkkeet 1 ja 2, joista numero 2 sekvensoitiin ja käytettiin jatkossa.

43 kb 5 kb 2,0 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,7 kb Kuva 9. VPg:n pesäke-pcr:n tarkistusgeeli, jossa tuotteina perunan A-viruksen plasmidi, jossa sisällä VPg-C mutantti. Kaivossa 1 on GenRuler 1 kb DNA-ladder, kaivoissa 2-16 hiivapesäkkeet ja kaivossa 17 negatiivinen kontrolli. Kuvassa 10 on vain kuusi pesäkettä, jotka sisältävät insertin. Kaikki tuotteen sisältävät bändit ovat 1,0 kb:n kohdalla. Plasmidi-DNA:n valmistukseen otettiin pesäkkeet 9 ja 10, joista numero 9 sekvensoitiin ja käytettiin jatkossa kb 5 kb 3 kb 2 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,7 kb Kuva 10. VPg:n pesäke-pcr:n tarkistusgeeli, jossa tuotteina perunan A-viruksen plasmidi, jossa sisällä VPg-C mutantti. Kaivossa 1 on GenRuler 1 kb DNA-ladder, kaivoissa 2-16 hiivapesäkkeet ja kaivossa 17 negatiivinen kontrolli.

44 HC-Pro-330mA:n kloonaus PCR Kuvassa 11 on nähtävissä HCpro-330mA:n positiivisen ja negatiivisen PCR-reaktion tuote kuvattuna tarkistusgeeliajon jälkeen. Positiivinen tuote on 1,5 kb:n kohdalla. HCpro:n tiedetään olevan 1,5 kb:n kokoinen, joten positiivinen tuote on todennäköisesti HCpro-330mA. Negatiivisessa kontrollissa näkyvä tuote on todennäköisesti kontaminaatio positiivisesta tuotteesta, sillä bändi on samalla kohdalla positiivisen tuotteen bändin kanssa. HCpro-PCR-tuote puhdistettiin e. Z. N. A. Gel Extraction -kitin (PLN 350-1KT) ohjeen mukaisesti kb 10 kb 5 kb 1. GenRuler 1 kb DNA ladder 2. HC positiivinen näyte 4. HC negatiivinen näyte 3 kb 2 kb 1,5 kb 1,0 kb Kuva 11. HCpro-330mA Phusion PCR:n tarkistugeeli Pesäke-PCR Kuvassa 12 on HCpro-330mA pesäke-pcr:n insertin sisältävät pesäkkeet sekä positiivinen (kaivo 15) ja negatiivinen (kaivo 16) kontrolli. Vain kahteen vektoriin on kiinnittynyt insertti ligaatiossa. Tuotteet ovat 0,7 kb:n kohdalla, kuten positiivinen kontrollikin. Tämän perusteella voitiin todeta, että saadut

45 37 tuotteet olivat HCpro-330mA:ta. Plasmidi-DNA:n valmitukseen otettiin pesäkkeet 7 ja kb 5 kb 1,5 kb 1,0 kb 0,7 kb 0,5 kb Kuva 12. HCpro-330mA pesäke-pcr:n tarkistugeeli. Kaivossa 1 GenRuler 1 kb DNAladder, kaivoissa 2-16 hiivapesäkkeet ja kaivossa 17 negatiivinen kontrolli HCpro-330mA:n tarkistusdigestio Kuvassa 13 on plasmidi-dna:sta tehdyt tarkistusdigestiot. Reaktio pysäytettiin denaturoimalla entsyymit 65 C:ssa 20 min. Tällä haluttiin varmistaa DNA:n normaali ajautuminen geelillä. Negatiivisena kontrollina toimi insertitön pgad-t7-plasmidi. Näytteiden ensimmäiset bändit ajautuivat samalle kohdalle kuin tyhjän plasmidin ensimmäinen bändi (7,0 kb). Tyhjän plasmidin toinen osa ajautui n. 1 kb:n kohdalle. Näytteiden toiset bändit ajautuivat n. 2,5 kb:n kohdalle ja kertovat n. 1,5 kb:n lisäyksestä plasmidin monikoonauskohtaan. Samalla geelillä ajettiin muitakin digestioita, mutta niitä ei käsitellä tässä raportissa.

46 kb 10 kb 7 kb 5 kb 3 kb 2 kb Kuva 13. HCpro-330mA:sta tehtyjen plasmidi-dna:en digestion jälkeinen tarkistusgeeli. Kaivossa 1 pgadt7, kaivossa 2 HCpro (pesäke 7), kaivossa 3 HCpro (pesäke 9) ja kaivossa 4 GenRuler 1 kb DNA-ladder. Kuvassa on myös kaksi muuta näytettä, muuta ne eivät ole olennaisia tämän työn kannalta. 4.4 Hiivan transformaatio ja proteiinien väliset interaktiot hiivassa Kasvatusmaljat Kasvatusmaljan tarkoituksena on kasvattaa transformoituneet hiivasolut pesäkkeiksi selektioalustalla. Pesäkkeitä käytetään interaktio-testiin interaktiosektioalustalla ja proteiininäytteiden valmistukseen. Taulukoista 11 ja 12 voidaan havaita VPg:n sekä HCpro:n hiivapesäkkeiden määrät transformaation ja plasmidiselektioalustalla kasvatuksen jälkeen. Viivalla merkityllä kohdalla ei ole tehty vastaavaa AD/BD -maljaa. Merkintä paljon ilmaisee pesäkkeiden määrän olleen yli 300 kpl, joten niitä ei laskettu tarkalleen.

47 39 Taulukko 11. Hiivan transformaation VPg -interaktioselektiomaljojen tulokset. Kontrollit: 102/104 ja 102/108. Muut merkinnät: WT = mutatoimaton VPg, XPO-N = XPO-proteiinin N-terminaalinen pää, C /103 = kloonatut VPg:t. Pystysuoraan menevät transformaation AD-domeenissa olevat selektiot ja vaakasuoraan BD-domeenissa olevat. Pesäkkeiden lukumäärä hiivatransformaatiossa AD BD WT XPO-N (29) C 1 (4) C 2 (9) Tyhjä 103 WT C 1 (1) C XPO-N (7) Tyhjä kontrolli kontrolli Taulukko 12. Hiivan transformaation HCpro -interaktioselektiomaljojen tulokset. Kontrollit: 102/104 ja 102/108. Muut merkinnät: StH 2 = HIP2 perunasta, NtH 2 = HIP2 tupakasta, WT = mutatoimaton HCpro. A, B, C ja ABC = HCpro:n mutantteja. HCpro:n itseinteraktio HCpro:n interaktio kasvin HIP2-proteiinia vastaan HCpro- HCpro/ StH 2 StH 2 NtH 2 NtH 2 muodot HCpro (AD) (BD) (AD) (BD) A B paljon C paljon paljon 168 ABC Tyhjä kontrolli 91 paljon - kontrolli

48 40 Taulukon 12 perusteella voitiin todeta, että interaktiotestaus onnistui hyvin, sillä jokaisella maljalla oli havaittavissa pesäkkeitä. HCpro:n ja ABC:n interaktiossa olevien pesäkkeiden määrät ovat pienemmät kuin muiden. Sen perusteella todettiin transformaatiossa käytetyn AD-ABC plasmidipuhdisteen DNA-konsentraation olleen oletettu pienempi Interaktioselektiomaljat Tässä osuudessa keskitytään interaktioselektioalustalla tehdyistä maljauksista saatuihin tuloksiin. VPg:n ja erään kasviproteiinin (XPO) proteiini-proteiini-kombinaatioiden kasvutulokset on nähtävissä taulukossa 13. Mainitun taulukon tulokset ovat viimeisimmän tarkastelun tuloksia, eikä sen jälkeen ole enää havaittu muutoksia maljojen kasvussa. VPg:stä ja sen mutanteista testattiin autoaktivaatio tyhjää plasmidia vastaan. Tulos oli negatiivinen, kuten pitäisikin, sillä VPg:n eikä sen mutanttien ei kuulu autoaktivoida tyhjiä plasmideja. Taulukko 13. VPg:n interselektiokasvatuksen tulokset. Pystysuoraan menevät transformaation AD-domeenissa olevat selektiot ja vaakasuoraan BD-domeenissa olevat. VPg:n interaktio kasvin XPO-proteiinia vastaan BD WT XPO-N (29) C 1 (4) C 2 (9) Tyhjä 103 AD WT ET ET ET - C 1 (1) ET ET ET - C 1 (2) ET ET ET - XPO-N (7) - ET - - ET Tyhjä ET - - ET

49 41 Taulukossa 13 ja 14 käytetyt merkinnät tarkoittavat seuraavaa: nopea kasvu + + hidas kasvu - hyvin heikko kasvu tai ei kasvua ET ei tehtyä transformaatiota Työssä käytettyjen proteiini-proteiini-kombinaatioiden kasvutulokset HCpro:n ja HIP2 välillä ovat taulukossa 14. Mainitun taulukon tulokset ovat viimeisimmän tarkastelun tuloksia, eikä sen jälkeen ole enää havaittu muutoksia maljojen kasvussa. Taulukko 14. HCpro:n ja HIP2:n interselektiokasvatuksen tulokset HCpro:n itseinteraktio HCpro:n interaktio kasvin HIP2-proteiinia vastaan HCpro- HCpro/HCpro StH 2 StH 2 NtH 2 NtH 2 muodot (AD) (BD) (AD) (BD) WT ABC A B C HCpro:sta tiedetään jo, ettei se autoaktivoi hiivan kaksihybridisysteemissä [21], joten sitä ei testattu tyhjiä vektorikontrolleja vastaan uudelleen. Kuvassa 14 on HCpro:n interaktioista tehdyt maljat. Maljan jokaiselle sektorille on piirretty 3 rinnakkaisviivaa, kukin eri pesäkkeistä, jotta kasvunopeus pystyttiin määrittämään luotettavasti.

50 42 Kuva 14. HCpro:n interaktio-maljat. Jokaisella maljalla on positiivinen ja negatiivinen kontrolli sekä yksi tyhjä sektori. 4.5 Western Blot HCpro-fuusioproteiinien havaitsemiseksi Western Blot -ajon tarkoituksena tarkistaa, että työssä käytetyt HCprokonstruktit, mutatoimaton ja mutatoidut muodot AD- ja BD-vektorissa, ilmenevät hiivassa ja ovat oletetun kokoisia. Membraaneilta detektoitiin AD- ja BD-vasta-aineiden avulla AD- ja BDfuusio-osat. Molemmilla membraaneilla oli nähtävissä selkeät standardibändit. Sekä AD- että BD -membraaneista otetuista röntgenkuvista näkyy selkeästi useita bändejä. Röntgenkuvia otettiin useampia kappaleita, mutta todettiin, että AD-membraanista otetun 1 s ja 60 s (kuvat 16 ja 17) sekä BDmembraanista otetun 1 s (kuva 18) valotusajan jälkeen otetuissa kuvissa oli

51 43 selkeimmät bändit. Membraanien kaivojen pipetointijärjestykset ovat nähtävissä taulukossa 15. Taulukko 15. AD- ja BD- membraanien kaivojen pipetointijärjestys. Molemmilla membraaneilla on A- ja B-domeeneissa olevia näytteitä, jotka on jaettu kauttaviivalla. Kauttaviivan oikealla puolella oleva näyte on A-domeenissa ja viivan vasemmalla taas B-domeenissa. Kaivo AD- BD- Kaivo AD- BD- membraani membraani membraani membraani 1 Ladder AH109 8 A/A II A/A II 2 AH109 Ladder 9 B/B I B/B I 3 WT/WT I WT/WT I 10 B/B II B/B II 4 WT/WT II WT/WT II 11 C/C I C/C I 5 ABC/ABC I ABC/ABC I 12 C/C II C/C II 6 ABC/ABC II ABC/ABC II 13 + kontrolli + kontrolli 7 A/A I A/A I 14 Ladder Ladder Hiivaproteiiniprepit näytteistä, jotka sisälsivät kunkin HCpro-muodon sekä AD- että BD-vektoreista tuotettuina (HCpro-itseinteraktiotesti) ajettiin kahdella geelillä (kuva 15). Toinen geeli oli varattu AD- ja toinen BD-fuusioiden detektiota varten. Membraanille blottauksen jälkeen geelille jäljelle jääneet proteiinit värjättiin. Kuvasta 15 nähdään, että kaikki näytteet ovat ajautuneet kokonaan loppuun asti.

52 44 Kuva 15. HCpro:n Western Blot -geelien kuvat Kuvassa 16 on nähtävissä näytteiden 3-5 sekä 7-12 juosteet. Positiivinen kontrolli ei näy näin lyhyen valotusajan jälkeen. HCpro:n tiedetään olevan 51,3 kda:n kokoinen ja kun siihen lisää AD-fuusio-osan koon 24 kda:n, bändien pitäisi olla 75,3 kda:n kohdalla. Osa proteiineista on tällä kohdalla, joten voidaan todeta sen olevan HCpro. Proteiineissa on näkyvissä kaksi bändiä, koska siellä on post-translaationaalisia modifikaatioita.

53 Kuva 16. HCpro-proteiinien bändit AD-membraanista sekunnin valotuksen jälkeen Kuva 17 otettiin mukaan, koska siinä näkyvät paremmin joittenkin proteiinien useammat bändit sekä positiivisen kontrollin heikosti ilmenevän ADfuusioproteiinin häilyvät rajat kaivossa 13 (n. 50 kda) Kuva 17. HCpro-proteiinien bändit AD-membraanista minuutin valotuksen jälkeen. Kuvassa 18 on havaittavissa kaikki bändit selkeästi. Negatiivisen kontrollin ei kuulukaan näkyä, joten kaivon 1 kohdalla ei ole havaittavissa bändiä. Kaistan 13 kohdalla on voimakkaasti ilmenevä positiivinen kontrolli. Positiivinen kontrolli ilmenee vahvasti BD-fuusiossa, sillä hiiva tuottaa sitä voimakkaasti. [21]. BD-fuusio-osan koko on 22 kda ja se yhdessä HCpro:n kanssa asettaisi

54 46 proteiinit 72,3 kda:n kohdalle. Kuvan proteiinien koot sijoittuvat tasaisesti n. 72 kda:n kohdalle, mikä vastaa odotettua kokoa Kuva 18. HCpro proteiinien bändit BD-membraanilla sekunnin valotuksen jälkeen. 5 YHTEENVETO Tämän opinnäytetyön tarkoituksena oli tutkia PVA:n ja kasvin vuorovaikutusta proteiini-proteiini-vuorovaikutusten tasolla, sekä selvittää leviääkö virus Solanaceae-heimon kasvissa, joka on sukua perunalle. Työ aloitettiin kloonaamalla mutatoituja geenejä hiivan kaksihybrisysteemiin. Kloonaus onnistui aktivaatio- ja kiinnitysdomeenivektoreihin, minkä jälkeen plasmidit saatiin transformoitua hiivaan. Interaktiotestin mukaan oli havaittavissa eroja HCpro-mutanttien välillä. VPg-muotojen välillä edellä mainittuja eroja ei ollut havaittavissa. HCpro-mutanttiproteiinien tuotto kyettiin tarkistamaan Western blot -menetelmällä. Mutanttiproteiinien koot vastasivat tunnettuja kokoja sekä AD- että BD-fuusiona. Vuonna 2003 on löydetty kaksi PVA:n HCpro:n kanssa vuorovaikutuksessa olevaa perunan proteiinia, HIP1 ja HIP2, joista tämän tutkimuksen yhteydessä tutkittiin HIP2:ta. HIP2-proteiinin tiedetään liittyvän solun tukirankaan. Proteiinia alun perin testattaessa ei käytetty koko geeniä, joten se kloonattiin myöhemmin uudelleen kokonaisena hiivavektoriin ja testattiin HCpro:n vuorovaikutuksella. Saatujen tulosten perusteella voitiin todeta vuorovaikutuksen