Biosensori-hiivasolujen kasvatus bioreaktorissa

Transkriptio

1 Biosensori-hiivasolujen kasvatus bioreaktorissa Organismin tiedot: - laji: Saccharomyces cerevisiae, kanta: BMA64-1A ominaisuudet ja mutaatiot: MAT α, ura 3-52, trp 1 2, leu 2-3_112 his3-11. ade2-1, can sovellustarkoitus: voidaan käyttää ympäristödiagnostiikassa endokriinijärjestelmään vaikuttavien hormonin kaltaisten yhdisteiden seurantaan ja mittaukseen - geneettisesti muunneltu BMA64-1A eli ERE-Luc, joka ekspressoi (nisäkässolun) estrogeenihormonireseptoria (EHR). Hormonin tai analogimolekyylin sitoutuessa reseptoriin, kombinaatio kiinnittyy hiivasoluun siirrettyyn response elementtiinsä (ERE) ja aktivoi kohde promoottorinsa tuottamaan lusiferaasi-entsyymiä. Hiivasolussa tapahtunut hormonivaste voidaan mitata kun lusiferaasi entsyymille lisätään sille spesifistä substraattia; lusiferiiniä ja mitataan valotuotto luminometrillä - estrogeeni-reseptoria ja lusiferaasi-entsyymiä ekspressoivan hiivamutantin DNA rekombinaatiossa on käytetty kahta eri plasmidia: genomiin integroituvaa (1.) ja eksokromosomaaliseksi (episomal) jäävää (2.) 1. YIp - hiivavektori (Integrative plasmid) MCS alueella: ERE -MELα-Luc Hiivan MELα (α-galaktosidaasi) promoottorin alueelle siirretty estrogeenireseptorin vasteelementti (ERE) joka aktivoi lusiferaasi-geenin (Luc) ekspressiota. (Lusiferaasin geeniä on muunneltu siten ettei se ohjaudu hiivasolun peroksisomeihin) URA3: komplementoi urasiili auksotrofian (tehden siitä jälleen prototrofin urasiilin suhteen) amp: resistessigeeni E.coli transformaatiossa 1

2 2. YRp - hiivavektori (autonomously replicating plasmid) MCS alueella: GPD-EHR Estrogeenihormonin reseptori GPD-(glyceraldehydi fosfaatti dehydrogenaasi) promoottorin (konstitutiivinen) alla. ARS: autonomously replicating sequences CEN: centromere sequences TRP1: komplementoi tryptofaani auksotrofian amp: resistessigeeni E.coli transformaatiossa Mahdollisen diagnostisen biosensori-määrityskitin kaupallistaminen vaatisi kylmäkuivaustekniikan käyttöä hiivasolujen säilömisessä. Tarkoituksena on tuottaa suurempi määrä kyseistä rekombinanttihiivaa bioreaktorikasvatuksena kylmäkuivauskokeita varten. Solut pyritään kasvattamaan niin suureen tiheyteen kuin sen käytettävällä SDelatusliuoksella (synthetic dextrose minimal medium) on mahdollista tunnin aikana. Kasvatuksen aikana otetaan näytteitä ja solumassan kasvua seurataan laskemalla hiivasolujen tiheys. Otetuista näytteistä ajetaan SDS-PAGE, jossa nähdään mahdollinen perustason lusiferaasi-ekspressio (basal level; estrogeenireseptori voi kiinnittyä ERE:hen myös ilman hormoniaktivaatiota, tosin promoottoriaktivaation pitäisi olla kuitenkin heikkoa). Lusiferaasi (60 kda) tunnistetaan immunoblotista vasta-aineella (mouse) ja APA-anti-mouse immunovärjäyksellä. Kussilla kokeillaan hiivoille sovellettua kylmäkuivausmenetelmää, jossa solususpensioon lisätään % tehaloosi sokeria (+ lämpöshokki) säilyvyyden parantamiseksi. Pieniä koeeriä (400 µl) siirretään Eppendorf-putkiin ja nestehaihdutus tehdään kylmäkuivauseksikaattorissa. Kuivauksen jälkeen solut pyritään aktivoimaan kasvuun ja estrogeenivasteen toimivuutta kokeillaan β-estradiolilla ja mittaamalla valotuotto luminometrillä. 2

3 Feed batch-kasvatus: Hiivasoluympin kasvatus bioreaktoria varten: 800 ml kasvatus (SD-medium + glukoosi + aminohapot) 3 L Erlenmeyer-pullossa, +30 C, 200 rpm, Infors-shaker), yön yli ml kasvatus siirrostetaan S.cerevisiae 4 ml suspensiokasvatuksesta ( joka puolestaan on siirrostettu maljatulta hiivasolupesäkkeeltä) - Yön yli kasvatuksen jälkeen mitataan OD 600 nm spektrofotometrillä Bioreaktorikasvatus: 800 ml ymppi ml SD-mediumia 1. Varmista, että bioreaktorikammio on puhdas edellisen käytön jälkeen. Pese tarvittaessa ja huuhtele hyvin nanopure-vedellä. 2. Mittaa kammioon elatusliuoksen vesi. Punnitse ja lisää yeast nitrogen base-jauhe. 1 L SD- (synthetic dectrose minimal medium) elatusliuoksen (ph 5,5) valmistukseen käytetty: 6,7 g yeast nitrogen base (without aminoacids) 910 ml H2O autoklavoi (esim. bioreaktorin autoklavoinnin yhteydessä) lisää sokeri ja aminohappoliuokset (suodatettu: 0,2 µm filtterillä): 50 ml/l glucose (40% v/w) 10 ml/l histidine (stokki: 2g/L) 20 ml/l adenine (stokki: 2,5g/L) 10 ml/l leucine (stokki: 10g/L) 3. Sulje kansi, kytke tarvittavat osat ja letkut. Aktivoi sekoitus, jotta jauhe liukenisi veteen mahdollisimman hyvin ja anna pyöriä n. 10 min. Käynnistä laitteen autom. autoklavointi. Muista kalibroida autoklavoinnin aikana happianturi 0 %- tasolle ja höyrystää laitteen hanat. 3

4 4. Ymppi siirrostetaan laminaarista käsin, käyttämällä peristalttista pumppua, letkua ja inokulaationeulaa. Letku+neula on steriloituna pussissa, joka avataan laminaarissa. Letkun vapaa pää pidetään laminaarissa (älä kontaminoi!) ja neulapää viedään bioreaktorille. Neulan pää steriloidaan liekillä ja kytketään kansiportiin (työnnä neula septumin läpi). Steriloi ja kiinitä samalla periaatteella myös 3-kanavainen neula kansiporttiin (neulan kautta syötetään glukoosia ja mahd. säädellään ph emäksellä). 5. Siirrosta aminohappoliuokset ensin bioreaktoriin ja tämän jälkeen 800 ml solususpensio. Lisää n. 100 ml glukoosia 3-kanavaneulan avulla (käytä bioreaktorin omaa peristalttista pumppua). Käynnistä kasvatus laitteen MFCS-ohjelmalla ja säädä parametrit kohdalleen. Lämpötila: + 30 C, sekoitus: 275 rpm, hapetus: 30 % ja glukoosinsyöttö. 6. Ota ensimmäinen näyte solujen alkutiheyden määrittämiseksi (säilytä otetut näytteet 0 C). Ota seuraava näyte kahden tunnin kuluttua ja sen jälkeen 1 tunnin välein. Seuraa kasvua mittaamalla solutiheys spektrofometrillä (OD 600nm ). 7. Jos ph laskee voimakkaasti kasvatuksen aikana, se kannattaa palauttaa NaOH:lla lähtötasoonsa. Kasvata soluja h ja kerää solut steriilisti siirtämällä kasvatusliuos letkun avulla laminaariin, jossa se voidaan kerätä senrifuugipulloihin (750 ml) sentrifugointia (1500 x g, 7 min, + 4 C) varten. 8. Kylmäkuivauskokeita varten pipetoi 400 µl solususpensiota 17:sta Eppendorfputkeen.Sentrifugoi solut pohjaan (1500xg, 4 min). Poista SD-medium ja lisää 15 % trehaloosi-liuosta. Seitsemälle sokeri+hiivasuspensiolle putkelle annetaan 1 tunnin + 40 C lämpöshokkikäsittely (tehostanee sokerin siirt ymistä solun sisään) Vie näytteet lopuksi kylmäkuivuriin ja seuraa haihtumisen etenemistä. 9. Kuivauksen jälkeen solut pyritään aktivoimaan kasvuun siirtämällä kuivattua jauhetta 4ml:n suspensiokasvatukseen (SD GLU+ade+his+leu -medium, + 30 C, 275 rpm, yön yli). 10. Jos solut ovat kasvaneet mitataan OD 600nm spektrofotometrillä. Laimenna solutiheys 0,4 SD -viljelymediumilla ja anna solujen kasvaa tiheyteen 0,6-0, Tee β-estradioli laimennossarja M. Estradiolistokin alkupitoisuus on 10 mm 100 %:ssa etanolissa. Siirrä 90 µl hiivasolususpensiota 96-mikrotiitterilevyn kuopille, jotta voit testata jokaisen pitoisuusalueen. Solujen päälle pipetoidaan 10 µl estradiolilaimennosta. Tee rinnakkaiset kokeet sekä suoraan kylmäkuivatuista että lämpöshokkikäsitellyistä hiivasoluista. Soluja inkuboidaan 2,5 tuntia + 30 C lämpökaapissa. Muista kontrollit! neg. EtOH laimennossarja ilman estradiolia pos. kontrolli 1: konstitutiivisesti lusiferaasia tuottava BMA64-1A mutantti; prs316luc pos. kontrolli 2: kylmäkuivaamattomat ERE-Luc solut 4

5 12. Luminosenssimittaus: Lisää jokaiseen kuoppaan 100 µl 1 mm lusiferiiniä. Ravistele levyä! Mittaa valontuotto luminometrillä (Hidex, Chameleon) SDS-PAGE (Western blot) ja lusiferaasin immunovärjäys: 1. Näytteen valmistusohje ajoa varten: menetelmä A: rapid protein prep which just involves boiling (+95 C, 5 min) yeast in SDS PAGE buffer. menetelmä B: Yeast mini whole cell extract using glass beads for western analysis Steve Hahn Last modified Fri, Oct 16, Grow 100 ml yeast to A600 ~1.0. If the yeast are overgrown, use proportionally less cells for the prep. 2. Collect cells by centrifugation and wash in 20 ml cold extraction buffer (containing DTT and protease inhibitors). Keep everything cold from this point on. 3. Resuspend cells in 600 microliters extraction buffer and transfer to 13 x 100 mm glass test tubes on ice. Add 400 microliters glass beads. 4. In the cold room, vortex for 1 min on ice and keep on ice for at least 1 min while vortexing other tubes. 5. Repeat the vortexing step (step 4) for a total of 5 times. 6. Spin cells in pre cooled clinical centrifuge for 3 min at top speed. 7. Using a 1 ml pipetman, remove the supernatant, leaving most of the glass beads behind (transferring some of the yeast is OK). Transfer to a microcentrifuge tube. 8. In the cold room, spin at top speed in the microfuge for 30 min. Remove supernatant to a new tube being careful not to carry over any cell debris. 5

6 9. Measure protein concentration using BioRad assay and freeze in aliquots. Load micrograms on protein gel for western analysis. käytetyt liuokset: Extraction Buffer: 200 mm Tris ph mm Ammonium sulfate 10% glycerol 1 mm EDTA + Protease inhibitors (for long term storage) 0.1 M PMSF (100x) 16 mg/ml Ethanol Store at -20 degrees 0.2M DTT (100x) 32 mg/ml H2O Store frozen at -20 degrees Otetuista bioreaktorinäytteistä valitaan sopiva määrä näytteitä Western ajoon. 2. Immunovärjäys: SDS-PAGE geeliajon jälkeen näytteet siirretään nitroselluloosakalvolle elektroforeettisesti 100 V, 1h). Blotit blokataan 5 % maitoliuoksella (1 x TBS) vasta-aineen epäspesifisen sitoutumisen estämiseksi (o.n.,keinussa, +4 C). 1. membraanin pesut: TBS-Tween 3 x 5 min. 2. primaari vasta-aine: anti-lusiferaasi (mouse, 12ml, 1:4000 in TBS-Tween), 1 tunti. 3. membraanin pesut: TBS-Tween 3 x 5 min. 4. sekundaari vasta-aine: APA-antimouse (1:5000 in TBS-Tween), 1 tunti. 5. membraanin pesut: TBS-Tween 3 x 5 min. 6. detektio: 10 mm APA puskuri (33 µl BCIP, 66 µl NBT) 6

7 immunoblotting: Alkaline phosphatase detection BCIP = 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate NBT = nitroblue tetrazolium Principle of enzyme-linked detection using the reagents in our NBT/BCIP Reagent Kit. Phosphatase hydrolysis of BCIP is coupled to reduction of NBT, yielding a formazan and an indigo dye that together form a black-purple colored precipitate. 7