Virtaussytometrian perusteet

Transkriptio

1 Virtaussytometrian perusteet Sorella Ilveskero LT, erikoislääkäri

2 Virtaussytometrian perusteet ja käyttö kliinisessä laboratoriossa virtaussytometrian periaate virtaussytometrinen immunofenotyypitys akuuteissa leukemioissa kroonisissa lymfoproliferatiivisissa taudeissa plasmasolutaudeissa jäännöstautianalytiikka

3 VIRTAUSSYTOMETRIA Menetelmä, jossa fluoresoivalla aineella merkittyihin soluihin (tai muihin partikkeleihin) kohdistetaan lasersäde ja mitataan solujen siroamaa valoa ja virittyneen merkkiaineen lähettämää valoa. Solupopulaatiot voidaan erottaa toisistaan solujen koon, rakenteen ja merkkiaineiden tunnistamien pinta- tai intrasytoplasmisten antigeenien perusteella.

4 Virtaussytometrinen immunofenotyypitys (valkosolut ja verta muodostavat solut) Solujen ilmentämien antigeenien perusteella määritetään solujen erilaistumislinja ja erilaistumisen aste Solujen rakenteet tunnistetaan monoklonaalisten vasta-aineiden avulla (CD-luokitus, cluster of differentiation) Vasta-aineet on leimattu fluoresoivilla aineilla (esim. PE, FITC, PerCP, APC, PE-Cy7, APC-Cy7) menetelmän etuina mahdollisuus analysoida useita ominaisuuksia yhtä aikaa, nopeus ja suurten solumäärien analysointi diagnostiikassa esim solua jäännöstautianalytiikassa solua ongelmina mm. malignien solujen huono aspiroituvuus ja näytteen mahdollinen verikontaminaatio harvoin yksinään diagnostinen

5 Solususpensio: veri, luuydinaspiraatti, likvor, pleura-/askitesneste, lasiaisneste, suspendoitu kudosnäyte

6 Solut analysoidaan valon sirontaominaisuuksien ja merkkiaineiden fluoresenssin perusteella. Valon sirontaa mitataan kahdesta eri suunnasta: pienen kulman sironta (Forward Scatter, FSC) kuvaa solun kokoa sivusironta (Side Scatter, SSC) kuvaa solun granulaarisuutta

7 Valonsirontaa mitataan kahdesta eri suunnasta: pienen kulman sironta (Forward Scatter, FSC) kuvaa solun kokoa sivusironta (Side Scatter, SSC) kuvaa solun granulaarisuutta Granulosyytit Monosyytit Lymfosyytit

8 Solut analysoidaan valon sirontaominaisuuksien ja merkkiaineiden fluoresenssin perusteella. Solujen ilmentämien antigeenien perusteella määritetään solujen erilaistumislinja ja erilaistumisen aste Solujen rakenteet tunnistetaan monoklonaalisten vasta-aineiden avulla (CD-luokitus, cluster of differentiation) Vasta-aineet on leimattu fluoresoivilla aineilla (esim. PE, FITC, PerCP, APC, PE-Cy7, APC-Cy7)

9 Fluorokromeja

10 Värikompensaatio Eri fluorokromien emissiospektrejä

11 Analysointiohjelma

12 Solupopulaatiot erotellaan CD45-ilmentymän ja valon sivusironnan (SSC) perusteella: Lymfosyytit Monosyytit Granulopoieesi Erytropoieesi

13 Lymfosyyttien alaluokat 6% CD19+ B-soluja 26% CD3neg,CD16/56+ NK-soluja 68% CD3+ T-soluja

14 Akuutin leukemian diagnostiikka Auerin sauva Akuutti promyelosyyttileukemia (APL)

15 Akuutin leukemian diagnostiikka?

16 Akuutin leukemian luokittelu immunofenotyypin perusteella (WHO 2008) Akuutti myelooinen leukemia (AML) myelooisia antigeeneja: cympo, CD13, CD33, CD117, CD65 monosyyttilinjan antigeeneja: CD4, CD11b, CD11c, CD14, CD36, CD64, cycd68 erytrooisia antigeeneja: GPA, CD71, CD105, CD36 megakaryoblastien antigeeneja: CD41, CD42, CD61 Akuutti lymfaattinen leukemia (ALL) B-soluinen: CD19 + CD10, CD22, cycd79a T-soluinen: cycd3

17 Akuutin leukemian luokittelu immunofenotyypin perusteella (WHO 2008) Sekalinjainen akuutti leukemia (MPAL) Myel + B, Myel + T, B + T, Myel + B + T Myel = cympo+ tai monosyyttilinjan antigeenit T = cycd3+ B = CD19+ ja CD10+/CD22+/CD79a+ TAI CD19dim+ ja kaksi em. B-soluantigeeneistä positiivisia Erilaistumaton akuutti leukemia (AUL) Ei ilmennä linjaspesifisisiä antigeenejä: cympo-, cycd3-, CD19-/dim, cycd22-, cycd79a- Ilmentää yleensä varhaisia ei-linjaspesifisiä antigeeneja, esim. CD34, CD38, HLA-DR, ntdt ja mahd. CD45

18 Akuutin leukemian virtaussytometrinen diagnostiikka erilaistumislinja jäännöstaudin seurantaan sopivat poikkeavuudet ennuste esim. assosiaatio genetiikan poikkeavuuksiin, mm. NG2, CRLF2 hoito

19 B-solulinjan akuutti lymfoblastileukemia T-solulinjan akuutti lymfoblastileukemia

20 Akuutti myelooinen leukemia (AML)

21 Seurantaan sopivat antigeeni-ilmentymät B-ALL CD10++, CD38dim CD123+, CD66c+/- CD45neg/dim T-ALL CD34+ CD1a+ osin ntdt+

22 Seurantaan sopivat antigeeni-ilmentymät AML CD7+, CD96dim CD38neg/dim CD133neg

23 ETP-ALL = CD1a-,CD8-,CD5dim + kantasolu tai myelooinen antigeeni positiivisuus Overall survival Lancet Oncology 2009; 10:

24 Akuutti B-lymfoblastileukemia: neuroleukemia Li-Leuk 3 x 10E6/l Li-Leuk 92 x 10E6/l Li-Leuk 1 x 10E6/l 85% 15%

25 Immunofenotyypitys lymfoomissa / kroonisissa lymfoproliferatiivisissa taudeissa Diagnostiikka perustuu pääsääntöisesti histologiseen ja/tai sytologiseen morfologiaan ja immunofenotyyppiin Mikään yksittäinen antigeeni ei ole tautispesifinen Useimmilla B-solutaudeilla on tyypillinen immunofenotyyppi, joka auttaa erotusidagnostiikassa / luokituksessa B-solujen klonaalinen kevytketjuilmentymä pienen luuydininfiltraation toteaminen T- ja NK-solutautien luokituksessa immunofenotyypitys ei ole ollut niin hyödyllinen

26 B-solulinjan kroonisten lymfoproliferatiivien tautien diagnostiikassa käytettäviä antigeeneja European LeukemiaNet suositus, Leukemia 2011; 25: KLL MCL Manttelisolulymfooma FL Follikulaarinen lymfooma DLBCL Suurisoluinen lymfooma Burkitt HCL Karvasolulymfooma HCLv Karvasolulymf. variantti SMZL/SLVL Pernan marginaalivyöhykkeen/ Villoosi lymfooma CD / CD22 / CD20 + / + + +/(-) /(-) CD /(+) CD79b /- + / CD /(+) /(+) CD /- + ± - - CD ± -/(+) CD11c -/(+) ± ± CD25 -/(+) - - -/(+) ±

27 B-solujen kevytketjuilmentymä Normaalit kypsät B-solut Lambdaklonaalinen B-solulymfooma

28 T-solujen klonaliteetti IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire Kit T-solujen TCR Vβ-ketjujen jakauman virtaussytometrinen määritys tarkoitettu verinäytteille tunnistaa 24 eri Vβ-ketjuja (noin 70% kaikista Vβ-ketjuista) 8 putkea (jokaisessa 3 eri Vβ-ketjua) > 1 yhdistetty seulontaputki Normaali, kaikki vasta-aineet samassa putkessa

29 Klonaalinen T-solupopulaatio CD3+CD5neg T-solut CD3+CD5+ T-solut

30 Immunofenotyypitys plasmasolutaudeissa Report of the European Myeloma Network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders Haematologica 2008;93:401

31 Immunofenotyypitys plasmasolutaudeissa Normaali ja klonaalinen CD38+CD138+ plasmasolupopulaatio

32 Jäännöstautianalytiikka Menetelmä Herkkyys Morfologia 1/20 Sytogenetiikka, metafaasi 1/20 FISH 1/ Monivärivirtaussytometria 1/ PCR pohjaiset menetelmät 1/

33 Normaalista poikkeavat antigeeni-ilmentymät, leukemia-associated (immuno)phenotypes, LA(I)Ps Ristilinjainen / asynkroninen /ektooppinen antigeeniilmentymä Antigeenin normaalia voimakkaampi tai heikompi / puuttuva ilmentyminen Tietyn antigeeni-ilmentymän omaavan solupopulaation poikkeava valosirontaominaisuus Seurantaan sopiva poikkeavuus löytyy: >95%:ssa ALL-tapauksista 50-95%:ssa AML:sta

34 Normaalit varhaiset, kypsyvät ja kypsät B-solut Precursor-B-ALL

35 B-ALL 50% Dg 0,3% d15 0,02% d79

36 Virtaussytometrinen jäännöstautianalytiikka: haasteita Blastipopulaation heterogeenisyys, subpopulaatioiden esiintyminen (>70% AML; <25% ALL) Fenotyypin muuntuminen / muuttuminen Yleistä (20-70%) Vaatii kokemusta (mm. normaaleiden ja regeneratiivisten luuytimien tuntemusta) Standardoinnin puute Näytteeseen ja näytteenottoon liittyvät ongelmat

37 Virtaussytometrian kehitysnäkymiä Laitteet > 8-10-väri Lajitteleva virtaussytometri Uudet fluorokromit ja vasta-aineet Uudet analysointiohjelmat Uudet tutkimusindikaatiot myelodysplasia immunologia HbF fetomaternaalivuodossa trombosyytit ja mikropartikkelit

38 Yhteenveto virtaussytometrinen immunofenotyypitys Immunofenotyypitys on keskeinen osa akuutin leukemian diagnostiikkaa: kroonisissa lymfoproliferatiivisssa taudeissa immunfenotyypityksestä on apua erityisesti B-solutautien osoittamisessa, luokituksessa ja levinneisyysselvittelyssä menetelmän etuina mahdollisuus analysoida useita ominaisuuksia yhtä aikaa, suurten solumäärien analysointi ja nopeus (vastaus tarvittaessa näytteenottopäivänä) harvoin yksinään diagnostinen, täydentää morfologisia ja sytomolekyyligeneettisiä tutkimuksia