II KROMOSOMIT JA SYTOGENETIIKKA

Transkriptio

1 II KROMOSOMIT JA SYTOGENETIIKKA A. Esihistoriaa: Kromosomien löytäminen ja tutkimus on ollut sidoksissa mikroskooppien ja preparointitekniikan kehitykseen. Varhaisilla mikroskoopeilla voitiin tutkia vain soluja: Robert Hooke esitteli korkkisolun 1665, R. de Graaf löysi Graafin follikkelit 1672, A. van Leeuwenhoek näki 270x suurentaneella mikroskoopillaan spermatozooit, protozooit ja bakteerit. J. Swammerdam 1679 seurasi hyönteisen kehitystä ja Camerarius 1694 kuvasi kasvien pölytyksen ja hedelmöityksen. Seuraava edistysvaihe oli vasta 1800-luvulla; Robert Brown löysi solun tuman , M.J. Schleiden ja Th. Schwann 1838 esittivät yleisen soluteorian. Gregor Mendel löysi perintötekijät 1866, ja Friedrich Miescher nukleiinin B. Kromosomit ja kromatiini. Ensimmäiset kuvaukset kromosomeista jakautuvissa liljakasvien soluissa julkaisivat C. Nägeli ja W. Hofmeister 1840-luvulla. Nukleiinin, kromatiinin ja kromosomien yhteyttä tutkivat mm. E. Zacharias, W. Roux, W. Flemming ym luvulta lähtien. Strasburger, Zacharias ym.) Nimitykset: kromatiini, mitoosi (Flemming), (ja mitoosin vaiheet; pro-, meta-, ana-, telo- ja interfaasi) vakiintuivat Mikroskooppien optiikka parani ratkaisevasti 1886, kun Ernst Abbe ja Otto Schott kehittivät Jena-lasin ja apokromaattiset öljyimmersio-objektiivit tulivat käyttöön. Kromosomi termin esitteli W. Waldeyer 1888, ja kromosomien fiksointi- ja värjäysmenetelmiä kehitettiin (W. Flemming, E. Strasburger, M. Heidenhain ym.), van Beneden kuvasi meioosin päävaiheet suolinkaiselta Lamppuharjakromosomeja tutkivat 1882 lähtien mm. Flemming ja J.Rückert, joka löysi niistä kiasmat (überkreutzung) 1892, Baranetzky kuvasi metafaasikromosomien kierteisyyden ja E. Balbiani löysi sääsken toukan sylkirauhassolujen juovikkaat jättiläisrihmat H. Henking huomasi kromosomiluvun n-2n-n-2n jne. vuorottelun ja löysi parittoman X-kromosomin Häcker kuvasi diakineesin 1897 ja meioosin profaasin varhaisvaiheidenkin järjestys selvisi (H.v.Winiwarter, V. Gregoire). Meioosi nimen keksivät Farmer ja Moore luvulta lähtien kromatiini ja kromosomit yhdistettiin solujen perinnöllisyysilmiöihin (E.B.Wilson 1896). Kromosomit ja niiden jakautuminen (mitoosi) kuvattiin tarkasti vaiheineen eläimillä (W. Flemming, Theodor Boveri Walter Stanborough Sutton E. van Beneden, Oscar Hertwig ym.) sekä kasveilla (Eduard C.

2 Sytogenetiikan alku. Theodor Boveri, joka tutki mm. hevossuolinkaisen kromosomeja 1870-luvulta lätien huomasi kromosomien esiintyvän pareina 2nvaiheessa meioosissa. Varsinaisen kromosomipari-geenipari-teorian mendelismin selitykseksi esitti Walter Stanborough Sutton ( ), sekä Boveri Sutton tutki Brachystola magna heinäsirkan kromosomeja, joita aiemmin selvitti jo Wilsonin oppilas Elisabeth Montgomery. Sutton löysi vastinkromosomiparit, jotka segregoituvat vapaasti meioosissa. Suttonin kirjoitus The Chromosomes in Heredity Biol. Bull. 4, ei saanut ansaitsemaansa huomiota. Jopa hänen opettajansa Edmund Beecher Wilson ( ), joka kirjoissaan jo 1896 ja 1900 yhdistää kromosomit, nukleiinin ja perinnöllisyyden, ei näyttänyt ymmärtävän geenipari-kromosomipariteorian merkitystä, vaikka toteaa, että geenit ovat pienempiä kuin kromosomit luvun alun julkaisuissaan muutkaan geneetikot eivät yleensä mainitse Suttonin teoriaa. (Esim. Kytkentäteorian esittäjä R.H. Lock 1906, de Vries eräs mendelismin uudelleenlöytäjä esitelmissään 1905, tai Darbishire 1910, joka teki laajat toistot Mendelin kokeista, Punnett: Mendelism 1911, Bateson: Mendel s principles of heredity 1913, Castle: Heredity, 1911 eivät mainitse Suttonin selitystä mendelismille). Thomas Hunt Morgan, jonka tarkoituksena oli etsiä mutaatioita kehitysteorian todistukseksi ei ehkä ollut lainkaan kiinnostunut mendelis-mistä ja kromosomeista, mutta alkoi uskoa Suttonin selitykseen mendelismistä elokuussa 1910, kun muutamia saman kromosomin geenejä oli löydetty banaanikärpäsestä. Banaanikärpäsen mitoosikromosomeja tutkivat 1914 mm. Nettie Stevens, C.B. Bridges ja Metz leikevalmisteista, mutta vasta Bellingin Squash-menetelmän soveltaminen aivorakkulamitooseihin (Frolova) 1926 toi esiin muutamia yksityiskohtia kuten deleetioita (Dobzhansky), joilla saatiin edes sentromeerien paikat kytkentäkarttoihin alkanut sylkirauhaskromosomien kartoitus muutti tilanteen täysin Drosophila-sytogenetiikassa. Edmund Beecher Wilson Thomas Hunt Morgan 1907 Sukupuolikromosomit. D. Hermann Henking löysi X-kromosomin 1891 Pyrrhocaris-luteesta. Sama systeemi XO löydettiin myös muista hyönteisistä, mutta sen ymmärrettiin liittyvän naarassukupuolen määräytymiseen vasta, kun Nettie M. Stevens ja E.B. Wilson 1905 löysivät Tenebriosta Y-kromosomin Doncaster ja Raynor havaitsivat sukupuoleen sitoutuvan periytymisen, Durham ja Marryat löysivät naaraspuolisen heterogametian perhosista ja linnuista. Eleanor Carothers seurasi 1913 Brachystola magnan

3 X-kromosomin ja tunnistettavan autosomin segregaatiota ja huomasi, että X ja tietty A joutuvat 50% samaan tytärsoluun, näin hän vahvisti sukupuolen kromosomaalisen määräytymisen, sekä myös Suttonin idean perustan kromosomien vapaasta orientaatiosta meioosissa. Drosophilan XY-tyyppinen määräytyminen selvitettiin vähitellen Melandriumin XY-tyyppi selvitettiin 1938 (Westergaard, Warmke & Blakeslee). Ihmisen XYtyypin yksityiskohdat selvisivät myöhemmin. E. Ihmisen kromosomiluku ja mitoosikromosomitutkimus. Sajiro Makinon Kromosomiatlas 1951 kirjaa ihmisen kromosomilukujen määrityksiä aina luvulta saakka. Leiketekniikalla vuosina saatiin hyvin vaihtelevia lukuja 8-50, usein kuitenkin luvun 12 kerrannaisia; 24, 48. Hans von Winiwarter 1912 sai luvuksi 2n=47 spermatogooniosoluista ja 2n=48 oogooniosoluista (XO-tyyppi) Vasta J. Belling in 1921 kehittämä squash-menetelmä antoi mahdollisuuden tarkennuksiin: T.S. Painter (,joka paremmin tunnetaan sylkirauhaskromosomien selittämisestä) sai squash-tekniikalla muutamista valmisteista 1922 esille kromosomiluvun 46, mutta ei ollut varma, ja myöntyi 1923 vanhaan käsitykseen 2n=48. Uudet parannetut menetelmät, kuten hypotoniakäsittely (Eleanor Slifer 1934, Hughes 1952, T.C. Hsu 1952, Makino ja Nishimura 1952, Hsu ja Pomerat 1953,) kolkisiinin käyttö (Avery 1937, Levan 1938 ym.) ja kudosviljely (Kemp 1929, Chrustschoff ja Berlin 1935, Andres ja Navashin 1936,) sekä näiden menetelmien sopiva yhdistely johtivat oikeaan määritykseen Lundissa. Joe Hin Tjio ja Albert Levan saivat embryosoluviljelmästä luvun 2n=46, jonka pian osoittivat oikeaksi mm. Charles Ford ja John Hamerton ym Tästä alkoi myös nopea kehitys kromosomilukupoikkeamien selvittämisessä; Downin syndrooma (Jerome Lejeune 1957) yms. ja samalla alkoi ihmisen normaalin karyogrammin tarkentaminen ja sen pienempienkin muutosten analysointi. Mary F. Lyon ja L.B. Russell 1961 keksivät selityksen Barrin bodylle; toisen X:n heterokromatisaatio naisilla. Suuri vaikeus oli Albert Levan ja Joe Hin Tjio Charles Ford Jerome Lejeune

4 1960-luvulla, että vain kromosomit 1,2,3,16 ja Y voitiin aina varmuudella identifioida karyotyypissä ns. traditionaalisin menetelmin. Mary F. Lyon F. Raitavärjäystekniikat luvun lopulla Sidney Farber (Children Cancer Research Foundation, USA) kutsui avustajaksi Torbjörn Casperssonin Tukholmasta. Caspersson totesi, että oli välttämätöntä kehittää, jokin uusi värjäys tuomaan mitoosin metafaasi-kromosomeihin lisää yksityiskohtia. C. halusi kehittää värin, joka ilmaisee kromosomien GC ja AT-rikkaat alueet yhdistämällä fluoresenssiväriin alkyloivan komponentin, jonka hän uskoi värjäävän erityisesti GC-alueet. CCRF:n biokemisti Ed Modest syntetoi QM (quinacrine mustard) yhdisteen. Tukholmassa sitä kokeiltiin Casperssonin ja Lore Zechin johdolla Scillan, Vician ym. kromosomeihin, jolloin saatiin samoihin kromosomeihin aina sama poikkiraitakuvio. Sovellutus ihmiskromosomeihin antoi myös toivotun tuloksen, raitavärjäysten nopea kehitys alkoi. Kun Bernard Weisblom, de Haseth, Hänssler ym kokeilivat eri väriaineita synteettisiin AT- ja GC-rikkaisiin valmisteisiin, he huomasivat että QM aiheuttaakin voimakkaan fluoresenssin AT-rikkaassa DNA:ssa. Pearson et. al. 1970, Alfred Gropp ja I. Hilwig 1972 huomasivat, että dibenzimidatsoli = HOECHST antaa paremman ja hitaammin häviävän fluoresenssin kuin QM ja Q (quinacrine hydrochloride = atebriini). Nopeaan tahtiin kehiteltiin 1970-luvun alussa joukko raitavärjäyksiä, joille Pariisin konferenssissa määritettiin luokittelu ja nimistö: QM-banding; Caspersson, Farber, Foley, Kudynowsky, Modest, Simonsson, Wagh & Zech Q- : Hilwig & Gropp 1972, R- ; Sehested -74, T- ; Dutrillaux -73, F- ; Rodman et al. 1973, C- ; Arrighi, Hsu et. al. 1971, Sumner 1972, josta variaatioita mm. Yunis et al. 1971, M. Bobrow et al. 1972, Eiberg 1974, Wyandt et al. -76 jne. N- ; Matsui & Sasaki 1973, NOR- silverstain; muita mm. Goodpasture & Bloom 1975, G- (Giemsa); Maximo Dreds & Margery Shaw 1971, A.T. Sumner ym. 1971, Schnedl 1971, sekä G:n variaatioita eri esikäsittelyillä mm. Dutrillaux ym. 1971, Seabright Giemsa- väri on muunnelma saksal. tropiikkilääkärin Gustav Giemsan hemato-logisesta malaria-loisvärjäyksestä ( alunperin sovellettu Romanowskyn värjäys; metyylisini+eosiini, josta Giemsa huomasi, että varsinainen kromatiini väri on Torbjörn Caspersson Gustav Giemsa

5 metyleeniazuuri= azuuri+eosiini+glyseroli +metanoli). Giemsa värjäys tuli uudelleen tunnetuksi verisoluviljelmien kehittämisen yhteydessä ( Peter Nowell ja Paul Moorhead ym.1969 ) ja varsinkin senjälkeen kun Frances Arrighi ja T.C. Hsu kehittivät C- banding-värjäyksen (Colorado Springsin kokous -70) julkaisu C-banding värjäyksen idean he saivat työskennellessään Yalen yliopistossa Mary Lou Parduen ja Joseph Gall in kehittäessä RNA-DNA hybridisaatiomenetelmää, jolla sittemmin paikannettiin mm. NOR alueita hiirellä (Pardue & Gall) ja ihmisellä (John Evans Joseph Gall & ML. Pardue 1973) sekä monilla nisäkkäillä (Pardue & Hsu). BUdr- +Giemsa; Zaharov ja Egolina 1972 huomasivat värjäytymiseron tytärkromosomeissa, josta Samuel Latt kehitti edelleen SCEharlekiinivärjäyksen : BUdr+Giemsa tai Hoechst. Raitavärjäys- ym. uudet tekniikat ovat tulleet erityisesti käyttöön myös syöpäsolututkimuksessa ja nisäkkäiden kromosomievoluution selvittämisessä. Esim. sveitsiläinen geneetikko Robert Matthey on laajalti selvittänyt nisäkäspopulaatioiden kromosomivaihtelua. Ruotsal. geneetikko Arne Müntzing osoitti jo 1932 myös kromosomitutkimuksen avulla uuden lajin syntymisen aiempien risteyminä, islantil. Askell Löve ja monet muut tutkijat ovat selvittäneet polyploidian levinneisyyttä ja merkitystä kasvilajien evoluutiossa. Kromosomitutkimusten määrästä ja laajuudesta saa käsityksen esim. kromosomilukuja esittelevistä kirjoista, joista mainittakoon esim. Makinon toimittama kromosomiatlas, Darlingtonin ja Wylien atlas kasvikromosomeista, sekä Darlingtonin laajat yhteenvedot sytogenetiikasta mm Uudemman sytogenetiikan tärkeitä aloja ovat olleet mm. interfaasisolujen tutkimus, erisyklisten solujen fuusiot, eri solukantojen fuusiot l. soluhybridisaatio jne. Mary Lou Pardue G. Yleistä henkilö- ja tapahtumahistoriaa Mendelin lait uudelleenlöydetään Sutton-Boverin geeniparikromosomipariteoria 1903 Waldeyer määritteli sentromeerien tehtävän Arne Müntzing ja Robert Matthey

6 1906 R.H.Lock esitti kytkentäteorian 1909 F.A. Janssens esitti kiasmatyyppiteoriansa 1910 Morganin ryhmä löysi ensimmäiset mutaatiot Drosophilasta 1911 W.R.B. Robertson löysi ensimmäiset kromosomifuusiot, R:in translokaatiot Drosophilan crossover-kartoitus alkaa kaikissa kromosomeissa 1914 C.B. Bridges huomasi nondisjunktion 1914 Robert Feulgen keksi DNA-värjäyksen, josta kehitettiin kromosomiväri (Feulgen ja Rossenbeck 1924) 1915 Maissin geenien ja kromosomien kartoitus alkoi Cornell in yliopistossa (Emerson, Shull,Beadle, Rhoades,MacClintock,Creighton ym.) Morgan,Bridges,Sturtevant & Muller: Mechanism of Mendelian Heredity 1919 T.H. Morgan: kytkentäryhmien luku on sama kuin haploidi kromosomiluku 1919 Bridges löysi Drosophilan kromosomeista duplikaatioita 1920 Blakeslee,Belling ja Farnham löysivät trisomian Daturasta 1923 Bridges löysi Drosophilan kromosomeista translokaation Winge havaitsi monosomian vehnästä Svedberg rakensi ensimmäisen ultrasentrifuugin