«1» Uusi PCR-määritys klamydian diagnosoimiseen. Etvi Juntunen. Ohjaajat: FM Lasse Välimaa, LuK Juuso Huusko

Transkriptio

1 «1» Uusi PCR-määritys klamydian diagnosoimiseen Etvi Juntunen Ohjaajat: FM Lasse Välimaa, LuK Juuso Huusko Chlamydia trachomatis on yleisintä sukupuolitautia klamydiaa aiheuttava intrasellulaarinen bakteeri, joka nykyisin tunnistetaan kliinisistä näytteistä nukleiinihappo tai ELISA-määrityksillä. Klamydiatartunta voi hoitamattomana johtaa vakaviin kroonisiin tulehdussairauksiin, kuten sokeuttavaan trakoomaan tai munajohtimien arpeutumisesta johtuvaan lapsettomuuteen. Erikoistyön tarkoituksena oli kehittää helppokäyttöinen, herkkä ja spesifinen, aikaerotteista fluorometriaa hyödyntävä PCR-määritys Chlamydia trachomatis -bakteerin tunnistamiseen. Määritys kehitettiin osaksi PanSense-määrityskonseptia, joka perustuu useiden erilaisten näytteiden analysoimiseen uudenlaisella mittauslaitteella. Työssä suunniteltiin uudet PCR-alukkeet ja koetin tunnistamaan spesifisesti Chlamydia trachomatiksen kryptistä plasmidia, jonka koko on 7,5 kb ja kopioluku solussa 4 6. Monistettava alue on 110 emäsparia pitkä plasmidin ensimmäisen lukukehyksen (ORF1) sekvenssi. Oligonukleotidit suunniteltiin toimimaan niin korkeassa lämpötilassa, että alukkeiden kiinnittyminen ja pidentyminen voidaan tehdä samassa lämpötilassa. Määritys suunniteltiin tehtäväksi kuivatuilla reagensseilla 30 µl:n reaktiotilavuudessa polypropeenilastuilla, jotka toimivat uudessa analysaattorilaitteessa. Samassa reaktioseoksessa käytettiin myös sisäistä standardia, jonka monistumisella kontrolloidaan PCR-reaktion toimivuutta. Määritys on optimoitu puhtaalla DNA:lla käyttäen perinteistä PCR-laitetta ja siirretty uudelle mittausalustalle, jossa optimointia on tarkennettu. Määrityksen teoreettiseksi herkkyydeksi mitattiin puhtaalla DNA:lla 495 fg, joka vastaa 417 solua. Signaali taustasuhteiksi 47 minuuttia kestävällä määrityksellä saatiin positiivisilla näytteillä 4. Uudella määrityksellä analysoitiin potilasnäytteitä, jotka oli kerätty vanupuikoilla sukupuoliteiden limakalvolta. Määrityksen spesifisyyden havaittiin olevaan täysin yhtenäinen lipopolysakkaridimäärityksen tulosten kanssa. Myöskin herkkyys riitti tunnistamaan kaikki positiiviset näytteet ja määrityksen havaittiin olevan tarpeeksi herkkä toimimaan ilman näytteen rikastamista, jolloin analyytiksi riitti PBS-puskuriin suspentoidut ja keitetyt limakalvonäytteet. Uusi määritys mahdollistaa klamydian nopean diagnosoimisen määrityskonseptin helppokäyttöisyyden ja suorituskyvyn ansiosta. Asiasanat: PCR, klamydia, Chlamydia trachomatis, kliininen mikrobiologia

2 «2» Fragiili X oireyhtymän (CGG) n toistojakson määrittäminen Mikael Hjort 1 Ohjaaja: dos, FT Alice Ylikoski 2 1 Biokemian ja elintarvikekemian laitos, Turun yliopisto 2 PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac Oy, Turku Fragiili X oireyhtymä on yleisin yhden geenin mutaatiosta johtuva kehitysvammaisuutta ja henkistä jälkeenjääneisyyttä aiheuttava sairaus. Oireyhtymä johtuu X-kromosomin FMR1 -geeniä koodittavan geenialueen ulkopuolella olevan (CGG) n toistojakson suurentumisesta, joka aiheuttaa FMR1 - geenin inaktivoitumisen. Sairaus periytyy X-kromosomin kautta, ja oireyhtymän yleisyys on 1/2500 miehillä ja 1/5000 naisilla. Normaalin stabiilin toistojakson koko vaihtelee viidestä 40 toistoon. Epästabiilien esimutaatioiden toistojaksojen määrä vaihtelee 60 ja 200 välillä, jota suuremmat toistojaksot määritellään täysmutaatioiksi. Normaalin ja esimutaation alueiden välille jää nk. harmaa alue. Esimutaatiot saattavat suurentua täysmutaatioiksi periytyessään äidiltä jälkeläiselle. Suurin osa (99 %) esimutaatioista on kooltaan alle 95 toistojaksoa. Esimutaatio voi aiheuttaa naisilla sekundaariamenorreaa (engl. premature ovarian failure, POF) ja molemmilla sukupuolilla FXTASsyndroomaa (Fragile-X-associated tremor/ataxia syndrome). Pojilla täysmutaatio johtaa aina fragiili X oireyhtymään, kun taas tytöistä vain noin puolet sairastuvat. Toistojaksoja määritetään tyypillisesti esimutaation kantajien seulonnassa ja täysmutaatiotapauksien diagnosoinnissa. Määrityksiä tehdään Southernhybridisaation, PCR:n ja geelielektroforeesin kombinaatioiden avulla. Tämän erikoistyön tavoitteena oli kehittää menetelmä (CGG) n toistojakson luotettavaan monistukseen sekä monistustuotteen tarkkaan koonmääritykseen. Kehitetyllä monistusmenetelmällä kyettiin monistamaan DNA-näytteestä 118 toistojaksoa. Monistustuotteet havainnoitiin PAGE:a ja kapillaarigeelielektroforeesia käyttäen. Menetelmällä voidaan havainnoida DNA-näytteestä normaalin ja harmaan alueen toistojaksot sekä vähintään 99 % esimutaatioista. Kehitettyä menetelmää voidaan seuraavaksi käyttää kliinisten näytteiden sisältämien toistojaksojen tutkimiseen. Määritys soveltuu tulevaisuudessa käytettäväksi esimutaatiotapauksien seulontaan. Asiasanat: Fragiili X, PCR, toistojakso, PAGE, kapillaarigeelielektroforeesi

3 «3» Vasta-ainemääritys hepatiitti C virukselle Teppo Salminen Ohjaajat: FM Ville Väisänen, FT Tero Soukka ja FT Kim Pettersson RNA-viruksille tyypillisesti hepatiitti-c viruksen (HCV) genomi on hyvin heterogeeninen. Maailmanlaajuisesti tunnetaan ainakin kuusi erilaista genotyyppiä. Tämän vuoksi anti-hcv vasta-aineita tunnistavat immunomääritykset käyttävät antigeeneinä useita peptidejä HCV:n eri proteiineista. Lisäksi genotyyppien maantieteellisestä jakaantumisesta johtuen immunomääritykset saattavat toimia heikommin eri alueilla. Nämä ongelmat huomioon ottaen on suunniteltu rekombinanttinen multiepitooppiproteiini (MEP), joka koostuu useista immunodominanteista, lineaarisista ja konservoituneista HCVspesifisistä epitoopeista. Tutkimuksen tavoitteena oli kehittää MEP:iin perustuva vasta-ainemääritys, joka tunnistaa veressä olevia anti-hcv vasta-aineita. MEP:a käytettiin immunomäärityksessä sekä solid-faasissa, että tracerina, jolloin vasta-aine muodostaa sillan solid-faasin ja tracerin välille. Lisäksi toisessa määrityksessä MEP:a käytettiin solid-faasissa ja tracerina toimi Eu-leimattu antihumaani vasta-aine. Näytteinä käytettiin sekä monoklonaalisia anti-hcv vasta-aineita että 10 näytteen kaupallisilla määrityksillä varmistettua HCV-paneelia. Vaikka monoklonaalisella IgG anti-hcv vasta-aineella oli hyvä affiniteetti MEP:iin, tämä vasta-aine ei kuitenkaan pystynyt muodostamaan siltaa MEP-MEP immunomäärityksessä. Sen sijaan positiiviset potilasnäytteet muodostivat sillan ja aiheuttivat positiivisen signaalin MEP-MEP määrityksessä. Positiivinen signaali saattoi muodostua polyvalenteista IgM vasta-aineista, jotka ehkä pystyivät sitoutumaan tehokkaammin useampaan antigeeniin yhtä aikaa. Toinen vaihtoehto on seerumissa olevat tekijät, jotka aiheuttavat polyklonaalisen IgG-vasteen muodostumisen kompleksoimalla IgG-vasta-aineita. MEP-MEP siltamäärityksen etuna on vasta-aineiden epäspesifisen sitoutumisen aiheuttaman taustan minimoiminen, mutta signaali/tausta suhteet olivat kuitenkin parempia MEP antihuman-eu määrityksessä. Tutkimuksessa onnistuttiin kehittämään HCVmultiepitooppiproteiiniin ja Eu-kelaattileimoihin perustuva alustava vastaainemääritys hepatiitti C virukselle. Asiasanat: Hepatiitti C, vasta-ainemääritys

4 «4» Spot-määritys PAPP-A:lle Heidi Hyytiä Ohjaajat: FM Saara Wittfooth ja DI Johanna Ylikotila Raskauteen liittyvä plasman proteiini A, eli PAPP-A (engl. pregnancy-associated plasma protein A) on isokokoinen proteiini, jonka on havaittu vapautuvan verenkiertoon sepelvaltimotautikohtauksen yhteydessä, ja jonka käyttöä sepelvaltimotautikohtauksen diagnostiikassa tutkitaan parhaillaan. Immunomäärityksissä käytetään yleisesti määrityskaivoja, joiden sisäpinta on päällystetty streptavidiinillä kauttaaltaan. Spot-päällystyksessä streptavidiini on pienellä alueella kaivon pohjalla ja menetelmän on havaittu parantavan immunomääritysten herkkyyttä testatuilla analyyteillä. Työn tarkoituksena oli spotteknologiaa apuna käyttäen kehittää PAPP-A:lle nopea ja nykyistä määritystä herkempi määritys. Työssä päällystettiin määrityskaivoja spot-teknologialla käyttäen natiivia streptavidiinia ja aktivoitua streptavidiinia sekä sitomiskapasiteettia parantavaa lisäainetta. Eri päällystyspintoja tutkittiin tavallisten immunomääritysten ja immunokompleksimääritysten avulla. Tavallisissa immunomäärityksissä biotinyloitu vasta-aine sidottiin spotin pintaan ja leimavasta-ainetta sekä PAPP-A:ta inkuboitiin kaivossa haluttu aika. Immunokompleksimäärityksessä biotinyloidun ja leimavasta-aineen annettiin sitoutua PAPP-A:han liuoksessa ennen määrityksen suoritusta. Määrityksissä spesifiset signaalit olivat kaikilla spot-pinnoilla huomattavasti vertailuikaivoja korkeammat. Toisaalta etenkin muilla analyyteillä hyväksi havaitun aktivoitua streptavidiinia ja lisäainetta sisältävän pinnan taustasignaalit olivat korkeat. Lisäksi havaittiin, että riippumatta käytetystä spot-pinnasta kinetiikat olivat hitaita - signaalitasot tasoittuivat vasta neljän tunnin inkuboinnin jälkeen. Immunokompleksin muodostamisen avulla saatiin kinetiikkoja nopeutettua mutta herkkyyttä ei saatu parannettua. Spot-teknologialla päästään 15 minuutin PAPP-A-määrityksissä samoihin herkkyyksiin kuin vertailumäärityksellä käyttämällä huomattavasti vähemmän reagensseja. Hitaan kinetiikan vuoksi pidemmällä määritysajalla spotmäärityksillä olisi mahdollista parantaa herkkyyttä merkittävästi. Asiasanat: PAPP-A, spot, sepelvaltimotautikohtaus

5 «5» Vasta-aineiden eritys Bcl6-poistogeenisissä B-soluissa Minna Ylihärsilä Ohjaajat: FM Jukka Alinikula, prof. Olli Lassila BIOKEMIA B-solujen kehitystä hematopoieettisista kantasoluista vasta-aineita erittäviksi plasmasoluiksi säädellään monien eri transkriptiofaktoreiden avulla. Transkriptiofaktorit Pax5, IRF-4, XBP1, BLIMP1 ja Bcl6 osallistuvat B-solun kehityksen viimeisten vaiheiden säätelyyn. Bcl6 (B-cell lymphoma 6)-proteiinia tarvitaan imusolmukkeiden itukeskuksien muodostumiseen, joissa tapahtuu immunoglobuliinigeenien somaattinen hypermutaatio sekä vasta-aineiden luokanvaihto. Bcl6 estää myös plasmasolugeeni Blimp-1:n ilmenemistä. Virheet B-solun kehityksessä voivat johtaa autoimmuunitautien ja syöpien kehittymiseen. B- solujen kehityksen ja toiminnan ymmärtämisen kannalta on tärkeää selvittää B- lymfosyyttien kehitykseen osallistuvien transkriptiofaktoreiden toiminta. Tutkimusta varten on tehty Bcl6-poistogeeninen DT40 B-solulinja homologista rekombinaatiota hyväksi käyttäen. Työn tavoitteena oli selvittää Bcl6- poistogeenisten solujen vasta-aineiden sekreetioon liittyvää fenotyyppiä. Bcl6- poistogeenisten solujen geenien ilmentymismuutokset (mikrosiruanalyysi) osoittivat plasmasoluille tyypillisten geenien aktivoituneen. Geenilastukokeet paljastivat XBP1:n kohdegeenien lisääntyneen ilmenemisen. Työn tarkoituksena oli selvittää eksosytoosiin, proteiinien ja vesikkelien solunsisäiseen kuljetukseen liittyvien geenien ekspression muutos ja määrittää muutoksien suuruus. Bcl6- poistogeenisten solujen RNA käänteiskopioitiin cdna:ksi ja geenien ekspressio määritettiin kvantitatiivisella PCR:llä. Elektronimikroskopialla selvitetään onko Bcl6-poistogeenisissä soluissa havaittavissa rakenteellisia muutoksia verrattuna villintyypin soluihin. Työssä kloonattiin kanan XBP1, jotta sen osuutta Bcl6- poistogeeniseen fenotyyppiin voidaan tutkia. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR osoitti XBP1-, rab40b-, rab27a-, syntaxin6- sekä sec24d-geenien ilmenemisen lisääntyneen villintyyppiin ja Bcl6 takaisin transfektoituihin soluihin verrattuna. Nämä löydökset viittaavat vahvasti siihen, että Bcl6-geenin poisto lisää proteiinisekreetiota soluissa. Tulosten perusteella Bcl6 näyttää säätelevän sekreetiokoneistoa säätelevän transkriptiofaktori XBP1 tuottoa. Bcl6-geeni näyttäisi estävän B-solun kehitystä vasta-aineita erittäväksi plasmasoluksi. Asiasanat: Bcl6, kvantitatiivinen PCR, DT40-solulinja

6 «6» ErbB4-reseptorin isomuotojen onkogeenisyys Kari Kurppa Ohjaajat: LL Maria Sundvall ja prof. Klaus Elenius BIOKEMIA ErbB4-kasvutekijäreseptori kuuluu EGFR (ErbB1) reseptoriperheeseen. Perheen jäsenistä ErbB1 ja ErbB2 ovat tunnettuja onkogeenejä ja niitä vastaan kohdistettuja syöpälääkkeitä on jo kliinisessä käytössä. ErbB4-reseptorin on havaittu olevan yli-ilmentynyt ja mutatoitunut useissa syövissä, mutta tähänastiset tutkimustulokset ErbB4:n roolista syövän kehityksessä ovat ristiriitaisia. ErbB4 eroaa muista ErbB-perheen jäsenistä siinä, että se esiintyy luonnollisesti neljänä eri isomuotona. Isomuotojen on havaittu eroavan signaalinvälityskyvyiltään ja ne voivat siten aiheuttaa erilaisia vasteita solutasolla. Työni tarkoituksena oli luoda retrovirusvälitteisellä geeninsiirrolla pysyvästi eri ErbB4 isomuotoja yli-ilmentävät solulinjat ja tarkastella miten eri isomuodot vaikuttavat solujen muuntumiseen pahanlaatuisiksi (transformaatioon). Käytin työssäni hiiren rintasyövän solulinjaa Shionogi 115 (S115), jonka solut voidaan halutessa transformoida altistamalla solut testosteronille. S115-solut tarjosivat tutkimukselle solumallin, jossa samalla geneettisellä solutaustalla voidaan tutkia eri ErbB4 isomuotojen yli-ilmentymisen vaikutuksia normaaleihin ja transformoituneisiin soluihin sekä solujen muuntumiseen normaaleista transformoituneeseen fenotyyppiin. Tarkastelin työssäni ErbB4 isomuotojen yliilmentymisen vaikutuksia solujen proliferaatioon, morfologiaan, syndekaani-1:n ilmentymiseen, aktiinifilamenttirakenteeseen ja kasvamiseen pehmeäagarissa, jotka kaikki ovat hyvin karakterisoituja transformaatioon liittyviä solutason muutoksia tässä solumallissa. Erikoistyöni aikana sain optimoitua retrovirustransfektio menetelmän ja luotua kahta ErbB4 isomuotoa pysyvästi yli-ilmentävät solulinjat. Karaterisoin isomuotojen vaikutuksia luoduissa solulinjoissa käyttäen kaikkia yllämainittuja menetelmiä. Tulosten perusteella toinen isomuodoista vaikuttaisi kiihdyttävän transformaatiota, mutta toinen ei. Jatkossa tarkoituksena on luoda kahta jäljelle jäänyttä isomuotoa pysyvästi yli-ilmentävät solulinjat ja karakterisoida niiden vaikutukset solujen transformaatioon. Asiasanat: kasvutekijäreseptori, EGFR-reseptoriperhe, syöpä

7 «7» CLEVER-1 tarttumismolekyylin toimintamekanismin selvittäminen Sari Hernesniemi Ohjaajat: dos. Kati Elima ja immunologian prof. Sirpa Jalkanen BIOKEMIA Valkosolut ovat välttämättömiä elimistön puolustuskyvylle. Ne ovat jatkuvassa liikenteessä veren ja imukudosten välillä etsien taudinaiheuttajia. Valkosolujen ja verisuonen endoteelin pinnalla tähän tapahtumasarjaan osallistuvat useat eri molekyylit, joiden toiminta on jo melko hyvin tunnettua, kun taas valkosolujen liikenne imukudoksissa tunnetaan huonommin. Muutamia tähän tapahtumasarjaan vaikuttavia molekyylejä on kuitenkin löydetty, joista esimerkiksi CLEVER-1 (common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1) välittää lymfosyyttien liikennettä imusuonissa. CLEVER-1:n tutkimisessa on ongelmana proteiinin suuri, noin 250 kda koko ja siten huono transfektiotehokkuus nisäkässoluissa. Tätä varten CLEVER-1 on päätetty pilkkoa pienempiin paloihin. Tehtävänäni erikoistyössä on näitä proteiinipaloja koodaavien cdna-palojen kloonaus, kloonien transfektiot nisäkässoluihin sekä tuotetun proteiinin eristys, puhdistus ja analysointi. Yritän myös kartoittaa inhibitorisien anti-clever-1 vasta-aineiden 372:n ja 266:n tunnistamia epitooppeja ja testata eri integriinien sitoutumista CLEVER-1:n fasciclin-domeeneihin immunosaostuksella. Olen kloonannut viisi eri palaa CLEVER-1:stä pcdna3.1 Myc/his vektoriin kolmen jo valmiina olleen kloonin lisäksi ja transfektoinut konstrukteja Hek 293-soluihin sekä puhdistanut näin tuotettuja proteiineja affiniteettikromatografialla. Solujen transfektiotehokkuudet olen tarkistanut FACS-värjäyksen jälkeen virtaussytometrillä. Proteiineja olen analysoinut Western-blottauksella, hopeavärjätyllä SDS-PAGE-geelillä sekä massapektrometrisesti. Vaikkakin CLEVER-1 cdna on pilkottu pienempiin palasiin, eivät transfektiotehokkuudet ole olleet haluttua tasoa ja siten proteiinipuhdistusten saannot ovat jääneet vähäisiksi. Inhibitorisen 372-vasta-aineen epitoopin olen pystynyt kartoittamaan ensimmäisten 3000 emäsparin alueelle. Toivon uusilla, vielä testaamattomilla klooneilla saavani 372-epitoopin kartoitettua vielä pienemmälle alueelle ja löytäväni 266-epitoopin geenin loppupäästä. Seuraavana vuorossa on kloonaamieni fasciclin-domeenikloonien sitoutumisen testaaminen eri integriineihin immunosaostuksella sekä palasten tuottokokeilut E.colissa. Asiasanat: Valkosolu, lymfosyytti, CLEVER-1, vasta-aine

8 «8» Dioksygenaasien rooli Smad3:n defosforylaation säätelyssä Marika Nummela Ohjaaja: FM Pekka Heikkinen Transformoiva kasvutekijä β (TGF-β) säätelee useita solun toimintoja, kuten kasvua, erilaistumista, vaeltamista ja kuolemaa. TGF-β ylläpitää solunsisäistä tasapainoa, kun taas häiriöitä signaalinvälitystiessä esiintyy tautitiloissa, kuten syövässä, fibroosissa ja autoimmuunisairauksissa. Signaalin kuljettajina solukalvon reseptorilta tumaan toimivat fosforyloidut Smad-proteiinit, jotka tumassa toimivat transkriptiofaktoreina. Hapen puutteen (hypoksian) on osoitettu aiheuttavan Smad3:n defosforylaation eli inaktivaation. Hapesta riippuvaiset entsyymit, dioksygenaasit, saattaisivat siis olla osallisena tapahtumassa. Tämän erikoistyön tarkoituksena oli selvittää dioksygenaasien vaikutusta TGF-β signalointiin ja erityisesti Smad3:n defosforylaatioon. Työ tehtiin humaanisoluviljelymalleissa. Immortalisoituja, mutta ei pahanlaatuisia, ihmisen ihon keratinosyyttejä (HaCaT) käsiteltiin dioksygenaasien kemiallisilla inhibiittoreilla, dimetyylioksalyyliglysiinillä (DMOG) ja kobolttikloridilla (CoCl 2 ), yhdessä TGF-β:n kanssa. Käsittelyjen vaikutusta Smad3:n defosforylaatioon seurattiin western-blot-analyysillä. Inhibiittorien vaikutusta solujen fenotyyppiin tutkittiin tekemällä umpinaiseen solukasvustoon haava ja seuraamalla etenevien solujen morfologiaa ja solu-solukontakteja faasikontrastimikroskopian ja immunofluorometrian avulla. Solujen pahanlaatuisuutta ja invasiivisyyttä tutkittiin seuraamalla niiden kulkeutumista solujen ympäristöä jäljittelevän matrigeelin läpi. Defosforylaatiota säätelevän dioksygenaasin etsimiseksi valmiina olemassa olevia mikrosirudatoja analysoitiin, ja tulokseksi saatujen dioksygenaasien tehtävistä ja vuorovaikutuksista haettiin tietoa proteiinitietokannoista. Smad3:n defosforylaation ja DMOG-pitoisuuden välillä todettiin selvä konsentraatioriippuvainen yhteys, mistä voidaan päätellä, että dioksygenaaseilla olisi rooli Smad3:n defosforylaatiossa. Yhdessä TGF-β:n kanssa dioksygenaasiinhibiittorit aiheuttivat soluille morfologiamuutoksia ja solu-solukontaktien havaittiin vähentyneen, mikä saattaisi antaa viitteitä solujen muuttumisesta pahanlaatuisiksi. Mikrosirudatan analysoinnin tuloksena yksi entsyymi, JHD1A, tuli esiin todennäköisenä kandidaattina Smad3:n defosforylaation säätelijäksi. Asiasanat: dioksygenaasientsyymi, TGF-β signaalitie, defosforylaatio, syöpäbiologia

9 «9» Angusykliinibiosynteesiin osallistuvien entsyymien PgaE ja PgaM muokkaus ja karakterisointi Hanna Korhonen Ohjaajat: FM Pauli Kallio, FT Jarmo Niemi ja prof. emeritus Pekka Mäntsälä BIOKEMIA Monet mikro-organismit tuottavat ja erittävät ympäristöönsä bioaktiivisia aineita suojatakseen elinympäristöään muilta mikrobeilta. Tällaisia ovat muun muassa erilaiset aromaattiset polyketidiyhdisteet, joista monet ovat maaperässä elävien gram-positiivisten Streptomyces-bakteerien tuottamia metaboliitteja. Muutamia tämän ryhmän yhdisteistä on käytety laajalti syöpälääkkeinä (mm. antrasykliinit daunorubisiini ja doksorubisiini), sekä bakteeri-infektioiden hoitoon (mm. tetrasykliini). Erikoistyötutkimukseni liittyy aromaattisten polyketidien ryhmään kuuluviin angusykliiniyhdisteisiin ja erityisesti niiden biosynteesissä toimiviin entsyymeihin. Biosynteettisten entsyymien ja niiden katalysoimien reaktioiden tarkka tuntemus antaa uusia mahdollisuuksia ja työkaluja uusien yhdisteiden muokkaamiseen ja suunnitteluun. Pga on angusykliini-tyypin geeniklusteri, joka on peräisin Streptomyces-kannasta PGA64. PgaE ja PgaM ovat Pga-biosynteesitien geenituotteita, jotka osallistuvat angusykliinin aromaattisen hiilirungon muokkaukseen. Erikoistyössäni tutkin, spesifisten pistemutaatioiden ja deleetioiden vaikutusta PgaM ja PgaE entsyymien ilmenemiseen, aktiivisuuteen ja pysyvyyteen. Muokatut entsyymit tuotettiin E.coli:ssa, puhdistettiin ja karakterisoitiin vertaamalla niiden ominaisuuksia natiiveihin entsyymeihin. Tulokset antavat tietoa aktiivisen keskuksen ominaisuuksista, substraatin sitoutumisesta, sekä entsyymin rakenteeseen ja pysyvyyteen vaikuttavista tekijöistä. Muokattujen proteiinien suunnittelussa käytettyjä menetelmiä olivat PCR ja muut molekyylibiologian tekniikat. Proteiiniekspressiossa ja puhdistuksessa sovellettiin erilaisia kasvatustekniikoita, kromatografisia menetelmiä (FPLC affiniteettikromatografia ja -geelisuodatus) ja analyyttista PAGE-elektroforeesia. Entsyymien aktiivisuusmittaukset tehtiin spektrofotometrisesti ja HPLCmenetelmien avulla. Asiasanat: polyketidiantibiootti, angusykliini, PgaE, PgaM, proteiinin muokkaus

10 «10» Ihmisen neutraalin α-mannosidaasin kolmen eri rekombinanttiproteiinin kloonaus, niiden tuotto Pichia pastoriksessa ja puhdistus Iida Salminen Ohjaajat: FM Elina Kuokkanen ja FT Pirkko Heikinheimo BIOKEMIA Glykosidihydrolaasit jaetaan aminohapposekvenssien perusteella 108 perheeseen. Nisäkkäiden GH38 perheen entsyymit ovat noin 1000 aminohapon suuruisia, usein oligomeerisia α-mannosidaaseja. Yksi näistä on solulimassa yleisesti esiintyvä neutraali α-mannosidaasi (NAM), joka toimii sokeriketjujen hajotuksessa pilkkoen mannoosien välisiä sidoksia. Tutkimusryhmän tarkoitus on selvittää NAM:n rakenne ja sen toimintaa, joista vielä tiedetään melko vähän. Työssäni monistin pcr R 2.1-TOPO-kloonausvektorista NAM:in N-terminaalisesta päästä lyhennettyinä kolmena eripituisena versiona. Natiivikonstruktista poistettiin vain edellisistä kloonausvaiheista mukaan tulleet kuusi ylimääräistä aminohappoa, kun taas toisen konstruktin N-terminaalisesta päästä poistettiin noin 200 ja viimeisestä noin 250 aminohappoa. Tarkoitus oli säilyttää NAM:n konservoitunut A-domeeni, jonka tiedetään vaikuttavan proteiinin laskostumiseen. Tuotteet liitettiin ppic3.5/hknam-vektoriin ja transformoitiin P. pastoris-hiivaan. Aktiivisuutta mitattiin tuottokasvatuksissa ja aktiivisimmat kannat fermentoitiin. Tuotettuja proteiineja puhdistettiin ammoniumsulfaattisaostuksella ja Co 2+ - affiniteettikromatografialla. Natiiville konstruktille tehtiin tobacco etching virus (rtev)-proteaasilla digestio, jossa N-terminaalinen histidiinihäntä leikattiin pois, jonka jälkeen ajettiin uusi Co 2+ -affiniteettikromatografia. Natiivin konstruktin tuottama α-mannosidaasiaktiivisuus oli tuottokasvatuksissa ja fermentoinnissa odotetusti korkea. Ammoniumsulfaattisaostuksessa ja Co 2+ - pylväsajossa päästiin eroon suuresta osasta epäpuhtauksia mutta samalla menetettiin kaksi kolmasosaa aktiivisuudesta ja loput aktiivisuudesta katosi rtevdigestiossa ja toisessa Co 2+ -pylväsajossa. Puhdasta proteiinia ei saatu talteen. Kaksi muuta konstruktia tuottivat myös α-mannosidaasiaktiivisuutta, mutta puhdistuksissa aktiivisuus oli niin alhainen, ettei Co 2+ -affiniteettikromatografian tuloksista voitu varmuudella sanoa, olivatko ne sitoutuneet pylvääseen. Puhdistukseen jäi siis paljon parannettavaa, erityisesti lyhimmän konstruktin ammoniumsulfaattisaostuksessa menetettiin tavallista enemmän aktiivisuutta. Asiasanat: glykosidihydrolaasi, neutraali α-mannosidaasi, Pichia pastoris

11 «11» Rapamysiinin tuottotason parantaminen Streptomyces hygroscopicus - kannalla Miina Lehestö Ohjaaja: FM (väit.) Jaana Kantola BIOKEMIA Rapamysiini eli sirolimus on erityisesti munuaissiirtojen ja pallolaajennusten yhteydessä kudosten hylkimisreaktioiden estämiseen käytetty immunosuppressantti (kauppanimi Rapamune ). Yhdiste on tunnettu jo 1970-luvulta, ja rakenteeltaan se on makrosyklinen laktoni. Rapamysiiniä tuottavan bakteerikannan (S. hygroscopicus) kehitystä kaupallisesti kannattavaksi (tuottotasotavoite 500 mg/l) on aloitettu Galilaeus Oy:ssä. Ennen erikoistyöni aloittamista kanta oli kertaalleen mutatoitu, mutta kannan geenitekninen muokkaaminen ei ollut onnistunut perinteisen protoplastitransformaation avulla. Tuottokasvatuksiin käytetty kasvuliuos sisälsi myös bioproteiinia, jonka valmistaminen on lopetettu. Erikoistyöni tarkoituksena oli jatkaa kannan kehitystä edelleen mutatoimalla tähän mennessä löydetty paras mutantti (B265), sekä yrittää geeniteknistä muokkaamista konjugaation avulla. Myös kasvuliuoksen sisältämän bioproteiinin korvaaminen jollain saatavissa olevalla yhdisteellä oli yksi erikoistyöni tavoitteista. S. hygroscopicus B265 mutatoitiin kemiallisesti N-metyyli-N-nitro-N-nitroso-guanidiinin (NTG) ja gentamisiinin avulla. Saatuja mutantteja kasvatettiin ensin 3 ml:n liuoskasvatuksissa, joista rapamysiinin tuottotasoa arvioitiin TLC:n avulla. Rapamysiiniä parhaiten tuottaneet mutantit kasvatettiin uudelleen 50 ml:n pullokasvatuksissa, joista uutetun rapamysiinin määrä analysoitiin HPLC:n avulla. Konjugaatiossa B265 itiösuspensioon yhdistettiin E. coli ET12567/pUZ8002 kannan soluja, joihin oli siirretty rapamysiinin tuottoon osallistuvia säätely-, resistenttiys- ja transportterigeenejä kloonattuina pset152 -vektoriin. Konjugaatiotehokkuutta pyrittiin parantamaan itiöille annettujen lämpö- tai ultraäänishokkien avulla. Konjugantit seulottiin mutanttien tavoin. Bioproteiinin korvaamiseksi testattiin kasvuliuoksia, jotka sisälsivät eri määriä mm. hiivauutteen, soijajauhon, farmamedian ja ammoniumsulfaatin eri yhdistelmiä. Suunnittelussa ja tulosten analysoinnissa käytettiin Minitab-koesuunnitteluohjelmaa. Mutantteja seulottiin kaiken kaikkiaan 500. Uusintakasvatuksiin valittiin yhteensä 28 mutanttia, joista parhaan (C155) tuottotaso oli 1,4-kertainen kontrolliin verrattuna. Konjugaatiomenetelmä saatiin toimimaan hyvin, mutta konjugoiduista geeneistä ainoastaan orfg (helix-turn-helix DNA-binding protein) paransi rapamysiinin tuottoa. Myös bioproteiinin korvaamisessa onnistuttiin soijajauhoa, hiivauutetta ja tärkkelystä sisältämällä kasvuliuoksella. Kuitenkin saavutetut tuottotasot (~60 mg/l) ovat vielä kaukana kokonaistavoitteesta, joten kannan kehitystä ja tuotto-olosuhteiden optimointia pitää vielä jatkaa. Asiasanat: rapamysiini, S. hygroscopicus, kemiallinen mutatointi, konjugaatio, TLC, HPLC

12 «12» Halvaannuttavia simpukkatoksiineja tunnistavan monovalentisen Fabfragmentin ristireaktiivisuuden parantaminen Merja Mustonen Ohjaaja: FM Markus Vehniäinen Vasta-aineiden ja vasta-ainefragmenttien muokkaaminen affiniteetin ja spesifisyyden osalta on yksi keskeisistä biotekniikan sovelluksista. Muokkaamista varten on lukuisia eri menetelmiä, jotka voidaan karkeasti jaotella satunnaisia tai kohdennettuja mutaatioita tuottaviksi. Mutageneesilla pyritään tuottamaan antigeenin tunnistukselle keskeiseltä alueelta toisistaan eroavia vasta-aineita, jotka ovat uniikkeja ja yhteismäärältään jopa miljardeja. Tästä joukosta vain muutaman affiniteetti ja spesifisyys kohdeantigeeniin on parantunut merkittävästi, joten mutantteja ei voida karakterisoida yksitellen. Tehokas kollektiivinen seulontatapa on faaginäyttö-tekniikka, jossa mutanttien geno- ja fenotyyppi ovat yhdessä, sillä faagi sisältää mutantin geneettisen koodin sekä ilmentää pinnallaan mutantin proteiinina. Tämä mahdollistaa seulonnan lopussa yksittäismutanttien tarkastelun geneettiselläkin tasolla. Halvaannuttavia simpukkatoksiineja tuottavat tietyt levälajit, joita simpukat käyttävät ravintonaan ja siten kontaminoituvat. Toksiineilla on sama perusrakenne, mutta neljä erilaista sivuryhmää, jotka aiheuttavat toksiinin ominaisuudet. Yhteensä rakenteita on ainakin 21 erilaista. Myrkyllisimpänä pidetään saksitoksiinia, joka on luokiteltu voimakkaana hermomyrkkynä bioterroriaseeksi. Nykyisin toksiinipitoisuus analysoidaan standardoitulla hiirimäärityksellä, jonka käyttöön liittyy mm. eettisiä ongelmia. Immunomäärityksellä analyysia voisi parantaa, mutta sen ongelmana ovat mm. vastaaineet, jotka eivät tunnista kaikkia eri toksiineja samalla affiniteetilla. Tämän vuoksi erikoistyön tarkoituksena olikin muokata Kunkelin kohdennetulla mutageneesimenetelmällä villityypin Fab-fragmenttia ristireaktiivisemmaksi eli useampaa kuin yhtä antigeenia hyvin tunnistavaksi. Mutanttien seulomiseen oli tarkoitus käyttää faaginäyttötekniikkaa. Työn tuloksena Fab-fragmentin hypoteettinen kolmiulotteinen rakenne selvitettiin homologiamallituksella ja toksiinin sitomiskohta paikallistettiin. Mallin avulla suunniteltiin mutaatiot, jotka on tarkoitus tehdä Kunkelin menetelmällä, mutta mutageneesia ei erikoistyön aikana ehditty toteuttaa. Faaginäytössä käytettävät kohdeantigeenjohdannaiset saatiin kuitenkin valmistettua ja karakterisoitua. Asiasanat: halvaannuttavat simpukkatoksiinit, Kunkel-mutageneesi, faaginäyttö

13 «13» Kunkel-mutageneesin optimointi ja menetelmän hyödyntäminen vastaaineiden affiniteettimaturaatiossa Tanja Savukoski Ohjaajat: FM Eeva-Christine Brockmann ja FT Urpo Lamminmäki Faaginäyttötekniikkaa on sovellettu paljon spesifisten sitojaproteiinien seulomiseen erilaisista rekombinanttivasta-ainekirjastoista. Tekniikalla voidaan kytkeä vasta-aineen genotyyppi ja fenotyyppi toisiinsa, mikä mahdollistaa halutun sitomisominaisuuden omaavan vasta-aineen geenien eristämisen seulonnan yhteydessä. Faaginäyttötekniikalla voidaan tehokkaasti seuloa sitojaa sisältävä kirjasto, josta ei kuitenkaan aina saada tiettyihin sovelluksiin sitomisominaisuuksiltaan riittävän hyviä vasta-aineita. Primaarikirjastosta saatujen sitojien ominaisuuksia voidaankin selektion jälkeen muokata erilaisilla affiniteettimaturaatiomenetelmillä, joissa tyypillisesti vasta-aineisiin tehdään satunnaismutaatioita ja seulonta suoritetaan uudestaan olosuhteissa, jotka suosivat entistä korkea-affiniteettisempia sitojia. Kunkel-mutageneesi on yksi tapa tehdä satunnaismutaatioita kirjastoista eristettyihin sitojiin. Sen etuna on suuri transformaatiotehokkuus, mutta ongelmana on usein korkea mutatoimattomien kloonien aiheuttama tausta. Menetelmässä mutaation sisältävä fosforyloitu aluke hybridisoidaan templaattina käytettävään yksinauhaiseen uridinyloituun DNA:han. Templaatti monistetaan ja syntyvän juosteen päät liitetään yhteen ligaasilla. Tämän jälkeen tuote transformoidaan E.coli ung+ -kantaan, jolloin in vitro -syntetisoitu juoste valikoituu solussa. Tässä työssä on tarkoitus vähentää taustaa optimoimalla menetelmää mm. pidentämällä aluketta DNA-polymeraasilla sekä käsittelemällä tuote erilaisilla entsyymeillä ennen transformaatiota. DNA-polymeraasireaktio on optimoitu tuottamaan riittävästi pidennettyä aluketta Kunkel-reaktioon. Pidennetty aluke näyttää vähentävän Kunkel-reaktiossa toisen juosteen syrjäytymisestä syntyvän epäspesifisen tuotteen määrää (engl. strand displaced). Alukkeen vaikutusta taustan määrään pitää vielä tutkia vertaamalla sitä vastaavaan lyhyellä alukkeella tehtyyn reaktioon. Lisäksi urasiili-dna:n glykosylaasi (UDG)- ja metylaasikäsittelyt transformaatiota ennen vähentävät taustan määrää oleellisesti. Erikoistyöni aikana on tarkoitus vielä soveltaa optimoitua Kunkel-reaktiota vasta-ainekirjaston affiniteettimaturaatioon. Asiasanat: Faaginäyttötekniikka, Kunkel-mutageneesi, affiniteettimaturaatio

14 «14» Pilkkoutuneen PSA:n immunomäärityksen parantaminen Kristiina Raunio Ohjaaja: FM Mari Peltola Eturauhassyöpä on teollistuneissa maissa miesten yleisin syöpäsairaus. Eturauhasen epiteelisolujen erittämä seriiniproteaasi, prostata-spesifinen antigeeni (PSA), on tällä hetkellä paras ja eniten käytetty merkkiaine eturauhassyövän toteamiseksi. PSA:ta esiintyy kuitenkin verenkierrossa myös muissa eturauhasen sairauksissa kuten eturauhasen hyvänlaatuisessa liikakasvussa, ja tästä syystä pelkästään kohonnutta PSA-pitoisuutta ei voida yksinään pitää luotettavana merkkinä eturauhassyövästä. PSA:n tiedetään esiintyvän verenkierrossa sekä vapaana muotona että kompleksoituneena muiden proteiinien kanssa. Vapaa PSA voidaan jakaa kahteen ryhmään: sisäisesti pilkkoutuneeseen muotoon sekä sisäisesti pilkkoutumattomaan, intaktiin muotoon. Viimeaikaisissa tutkimuksissa onkin keskitytty juuri näiden eri PSA-muotojen mahdolliseen käyttöön eturauhassyövän tarkemassa diagnosoinnissa. Erikoistyön tavoitteena oli parantaa intaktin PSA:n tunnistavan rekombinanttisen 4D4-vasta-ainefragmentin affiniteettia hyödyntämällä ohjattua evoluutiota. Tätä tarkoitusta varten 4D4-Fab-fragmentin raskaan ketjun vaihtelevalle (V H ) alueelle tuotettiin sattumanvaraisia mutaatioita virhealttiilla PCR-reaktiolla. Valmis vastaainekirjasto oli tarkoitus seuloa faaginäyttötekniikalla. Työssä tuotettiin mutantti-4d4-fab-fragmenttikirjasto pak100- ja pixpak100- fagemidivektoreissa, joissa rekombinanttiproteiini fuusioituu joko vaihtoehtoisesti filamenttifaagin p3- (pak100) tai p9-kuoriproteiiniin (pixpak100). Sitojakirjaston mutaatiofrekvenssin keskiarvoksi saatiin 4 nukleotidimuutosta/v H -alue. pak100-fagemidivektorissa tuotetun vasta-ainekirjaston laajuudeksi määritettiin 2,9 x 10 7 kloonia ja vastaavasti pixpak100-fagemidivektorissa 2,5 x 10 7 kloonia. Kirjaston diversiteettiä voidaan pitää varsin riittävänä potentiaalisten sitojien kartoittamiseen. Vasta-ainekirjaston seulontaa ei ole vielä ehditty aloittaa. Tämän vuoksi onkin vielä epäselvää, pystytäänkö parhaita sitojia rikastamalla löytämään affiniteetiltaan villityyppiä parempi mutantti-4d4-fab-fragmentti, jolla olisi yhä kyky tunnistaa spesifisesti intakti-psa. Asiasanat: PSA, Eturauhassyöpä, virhealtis PCR, faaginäyttötekniikka

15 «15» Rekombinantti-kystatiini C:n katepsiinikompleksit Päivikki Alatalo Ohjaajat: FT Jukka Hellman, FM Noora Ristiniemi ja Prof. Kim Pettersson Kystatiini C on pienimolekyylinen (13,4 kda) kysteiiniproteaasien inhibiittori, jota on kaikissa kehon nesteissä. Sen pääasiallisena tehtävänä on säädellä kuolleista soluista vapautuvien ja sairaiden solujen erittämien lysosomaalisten kysteiiniproteaasien aktiivisuutta. Aktiivisuuden kasvun ja proteaasi inhibiittoritasapainon häiriöiden on osoitettu liittyvän moniin sairauksiin, mahdollisesti myös MS-tautiin, jonka toteamiseksi ei vielä ole yksinkertaista ja luotettavaa testiä. Lisäksi kystatiini C:n lyhentynyttä muotoa (12,5 kda) on tutkittu MS-taudin merkkiaineena, mutta myös aivoselkäydinnestenäytteiden säilytyksen sivutuotteena. Työn tavoitteena oli tuottaa ja puhdistaa kystatiini C:tä ja vertailla vasta-aineiden kykyä tunnistaa proteiinin eri muotoja sekä kehittää immunomääritys kystatiini C:n ja kysteiiniproteaaseihin kuuluvien katepsiinien B ja L komplekseille. Kystatiini C:tä tuotettiin Escherichia coli -bakteerissa sen kodonin käytön suhteen optimoidusta geenistä. Puhdistus suoritettiin affiniteettikromatografian avulla hyödyntäen vektorista proteiiniin tuottunutta kuuden histidiinin häntää. Jatkopuhdistus ja muotojen erottelu toteutettiin anioninvaihtokromatografialla ph:ssa 9,8. Yhdeksän monoklonaalisen kystatiini C -vasta-aineen muotospesifisyyttä tarkasteltiin heterogeenisillä immunomäärityksillä, joissa kystatiini C kiinnitettiin biotinyloidulla ja havainnoitiin europium-leimatulla vasta-aineella. Lopuksi selvitettiin kystatiini C -vasta-aineiden sekä yhden katepsiini B ja yhden katepsiini L -vasta-aineen kyky tunnistaa katepsiineista ja europium-leimatusta kystatiini C:stä muodostettuja komplekseja. Osa työn tavoitteista täyttyi, sillä kystatiini C tuottui hyvin ja 13,4 ja 12,5 kda:n lopputuotteet olivat puhtaita. Muotojen erottuminen mahdollisti lisäksi vastaaineiden vertailun: tunnistusvoimakkuudessa havaittiin vaihtelua, mutta yksikään vasta-aineista ei tunnistanut vain toista muotoa. Sen sijaan kystatiini C katepsiini B ja L -kompleksien immunomäärityksiä ei saatu toimimaan. Osoittautui, että kompleksien muodostuessa ainakin kystatiini C -vasta-aineiden tunnistamat epitoopit peittyivät tai muuntuivat, niin että sitoutuminen estyi. Työssä käytetyillä katepsiini B ja L -vasta-aineilla syynä saattoi olla myös heikko affiniteetti. Asiasanat: kystatiini C, katepsiini B, katepsiini L, kompleksi, vasta-aine

16 «16» Fluoresenssienergiansiirtoon perustuva kolmileimamääritys proteaasi-inhibiittorien tehoseulontaan Päivi Malmi Ohjaaja: FM Antti Valanne Ohjelmoitu solukuolema eli apoptoosi on monisoluisten organismien tapa muun muassa poistaa elimistöstä vaurioituneita soluja ilman tulehdusvastetta. Apoptoottista reaktiotietä ohjaavat kysteiiniproteaasiperheeseen kuuluvat kaspaasit, joista keskeisin on kaspaasi 3. Suuri apoptoottinen aktiivisuus joissain sairauksissa ja aivovammoissa on haitallista, ja siksi kaspaasi-inhibiittorit ovat kiinnostavia kohteita lääketeollisuudelle. Erikoistyön tavoitteena oli kehittää fluoresenssiresonanssienergiansiirtoon perustuva homogeeninen määritys kaspaasi 3 -entsyymin inhibiittorien tehoseulontaan. Fluoresenssienergiansiirrossa donorina käytettiin pitkän fluoresenssieliniän omaavia europium(iii)-nanopartikkeleja, jotka oli päällystetty streptavidiinilla. Akseptorina työssä oli biotinyloitu kaspaasi 3 -entsyymin substraattipeptidi, joka oli paikkaspesifisesti muokattu fluoresoivalla Alexa Fluor 680 -värillä sekä BBQ-650-vaimentajaleimalla (bio-c[alexa680]devdk-[bbq- 650]). Nanopartikkelit ja substraattipeptidi sitoutuvat toisiinsa biotiinin ja streptavidiinin vuorovaikutuksesta. Kun inhibiittoria ei ole määrityksessä läsnä, kaspaasientsyymi pilkkoo substraatti-peptidin ja vapauttaa BBQ-650-leiman liuokseen. Europiumia viritettäessä (340 nm) energia siirtyy virittäen lähellä olevan Alexa Fluor 680 -värin, jonka emissio voidaan mitata aikaerotteisesti 730 nm:ssä. Mikäli määrityksessä on läsnä entsyymiä inhiboiva yhdiste, substraattipeptidi ei pilkkoudu ja Alexa Fluor 680- ja BBQ-650-leimat pysyvät lähellä toisiaan. Europiumia viritettäessä energia siirtyy Alexa Fluor 680 -värille, jonka emissiota 730 nm:ssä ei havaita BBQ-650-vaimentajan vaikutuksesta. Erikoistyössä onnistuttiin kehittämään fluoresenssiresonanssienergiansiirtoon perustuva kolmileimamääritys, jossa inhibiittorin (Z-DEVD-FMK) määrän kasvaessa mitattavan fluoresenssin määrä pieneni. Määrityksen avulla pystyttiin havaitsemaan parhaimmillaan alle pikomoolin määriä inhibiittoria IC 50 -arvon ollessa 12 nm. Määrityksen suorituskykyä ja soveltuvuutta tehoseulontaan voidaan edelleen parantaa muuttamalla substraatin leimakombinaatioita. Asiasanat: fluoresenssiresonanssienergiansiirto, homogeeninen määritys, Eunanopartikkelit, kaspaasi 3, tehoseulonta

17 «17» Up-konvertoivat fosforit ja vasta-ainefragmentit homogeenisessa immunomäärityksessä Johanna Vuojola Ohjaajat: FT Tero Soukka ja FM Terhi Rantanen Vasta-aineiden kykyä tunnistaa kohteensa spesifisesti hyödynnetään yleisesti diagnostisissa määrityksissä. Kokonaisia vasta-aineita voidaan edelleen parantaa geneettisen muokkauksen avulla tuottamalla rekombinanttisia vastaainefragmentteja, joista varteenotettavimpia ovat Fab- ja scfv-fragmentit. Näiden pieni koko saattaa olla hyödyksi esimerkiksi fluoresenssin resonanssienergiansiirtoa (FRET) hyödyntävissä määrityksissä, joissa luovuttaja- ja vastaanottajaleiman välisen etäisyyden on oltava lyhyt. Erikoistyön tavoitteena oli pystyttää FRETiin perustuva homogeeninen eli erotusvapaa immunomääritys mallianalyyttinä toimineelle TSH-hormonille. Erikoistyössä tutkittiin lisäksi, onko pienemmistä sitojamolekyyleistä, kuten vasta-ainefragmenteista, todellista etua määrityksissä. Tässä työssä TSH:n tunnistavia kokonaisia vasta-aineita sekä näistä muokattuja Fab- ja scfv-fragmentteja konjugoitiin up-konvertoiviin fosforipartikkeleihin. Upkonvertoivat fosforit ovat uudenlaisia epäorgaanisia merkkiaineita, joilla on ainutlaatuinen kyky virittyä matalaenergisillä infrapuna-aallonpituuksilla, mutta joiden viritystila purkautuu korkeampienergisillä näkyvän valon aallonpituuksilla. Valmistettuja konjugaatteja käytettiin sekä ei-kilpailevassa että kilpailevassa FRETiin perustuvassa homogeenisessa määrityksessä, jossa luovuttajana toimi upkonvertoiva fosforipartikkeli. Vastaanottajana ei-kilpailevassa konseptissa toimi Alexa Fluor 680 -pienmolekyylivärillä leimattu TSH-vasta-aine ja kilpailevassa konseptissa samalla värillä leimattu TSH. Työssä havaittiin, että luovuttajan ja vastaanottajan välinen etäisyys sekä fosforipartikkelien pinnoituskemia olivat määritysten kannalta kriittisiä tekijöitä. Jotta ei-kilpailevan määrityksen suorituskyky oltaisiin saatu käyttökelpoiseksi, olisi partikkelien täytynyt olla pienempiä tai niiden sitomiskapasiteetin suurempi. Käytetyillä komponenteilla vasta-ainefragmenttien koosta saatava hyöty jäi näin ollen pieneksi. Kilpailevassa määrityksessä pienimmän taustasignaalin antaneet scfv-pintaiset fosforit toimivat parhaiten, vaikka niiden sitomiskapasiteetti jäi odotusten vastaisesti pienimmäksi. Asiasanat: Up-konvertoivat fosforit, vasta-ainefragmentit, homogeeninen immunomääritys, TSH

18 «18» Entsyymiaktiivisuusmääritys kokoverinäytteestä Marja-Leena Järvenpää Ohjaaja FT Tero Soukka Kliinisesti tärkeiden kokoverinäytteiden käyttöä homogeenisissa fotoluminesenssiin perustuvissa määrityksissä rajoittavat veren autofluoresenssi ja voimakas absorptio UV- ja näkyvän valon aallonpituuksilla. Ongelmat voidaan ratkaista käyttämällä fluoresenssin resonanssienergiansiirrossa luovuttajaleimana epäorgaanisia up-konvertoivia fosforipartikkeleita (UPC-fosfori), joilla on ainutlaatuinen kyky virittyä matalaenergisellä infrapunavalolla ja emittoida korkeaenergisemmän vihreän (550 nm) tai punaisen (660 nm) valon alueella (anti- Stokes fotoluminesenssi). Koska biologinen materiaali ei up-konvertoi, voidaan vastaanottajaleiman signaali mitata ilman häiritsevää taustafluoresenssia eikä viritysvalon absorptiokaan ole ongelmana. Erikoistyön tavoitteena oli toteuttaa entsyymiaktiivisuutta kokoverestä mittaava mallimääritys hyödyntämällä UPC-fosforeita ja niiden anti-stokes fotoluminesenssin resonanssienergiansiirtoa. Endonukleaasientsyymin substraattina käytettiin 10 emäksen pituista oligonukleotidia, joka oli leimattu kolmella eri molekyylillä: 5 -päässä oli sekä biotiini että vastaanottajafluorofori ja 3 -päässä ei-fluoresoiva vaimentaja. Entsyymiaktiivisuus havaittiin sitomalla pilkkoutunut substraatti streptavidiinilla päällystetyn UPC-fosforin pintaan ja mittaamalla energiansiirron seurauksena virittyneen vastaanottajafluoroforin vaimentumaton emissio 730 nm:ssä samalla, kun fosforia viritettiin 980 nm:ssä. Entsyymiaktiivisuuden vaste nähtiin fluoroforin vaimentumattoman emission lisääntymisenä. Ehjän ja täysin pilkkoutuneen substraatin (2 nmol/l) signaalien suhde sekä puskurista että 20 % kokoverestä mitattuna oli noin 25. Signaalitaso oli kuitenkin korkeampi puskurissa kuin veressä. Tämä voi johtua veren punasolujen aiheuttamasta valon siroamisesta ja intensiteetin heikkenemisestä tai ympäristön vaikutuksesta käytetyn vastaanottajan fluoresenssiin. Edellä kuvatun kolmileimatun substraatin käyttäminen mahdollistaa entsyymiaktiivisuusmäärityksen toteuttamisen partikkeleilla, joiden emissiosta vain pieni osa voi osallistua energiansiirtoon. Määritys on aiemmin tehty europium-nanopartikkeleilla ja tässä työssä sen osoitettiin toimivan myös UPC-fosforeilla. Asiasanat: up-konvertoiva fosfori, entsyymiaktiivisuus, kokoveri

19 «19» Arvojen vaikutus koulutetun arvioijaraadin suoriutumiseen Anne Rantala Ohjaajat: FM Pohjanheimo Terhi ja FT Sandell Mari ELINTARVIKEKEMIA Kuvailevat menetelmät ovat tehokkaita analyyttisia keinoja elintarvikkeiden aistittavien ominaisuuksien määrittämiseen. Elintarvikkeen aistittava laatu on tärkeä tuotteiden valintoihin vaikuttava tekijä. Aiempien tutkimusten mukaan myös ihmisten henkilökohtaiset arvot saattavat vaikuttaa elintarvikkeiden koettuun miellyttävyyteen tai valintaan. Arvoilla tarkoitetaan yleisesti yksilön tärkeänä pitämiä päämääriä sekä valintakäyttäytymistä ohjaavia periaatteita. Työssä tarkasteltiin henkilökohtaisten arvojen vaikutusta arvioijan suoriutumiseen aistinvaraiseen objektiiviseen arviointiin koulutetussa raadissa. Perinteisen sokkoarvioinnin lisäksi työssä tutkittiin tuoteryhmästä annetun informaation ja väittämien vaikutusta arviointituloksiin. Työssä koulutettiin kaksi esitestattua raatia määrittämään kvantitatiivisesti kahden eri tuoteryhmän, hyvinvointijuomat ja juotavat jogurtit, tärkeimmät aistittavat ominaisuudet sekä näytekohtaiset tuoteprofiilit. Hyvinvointijuomaraati (n= 30) muodosti koulutusjaksolla oman sanaston, jogurttiraati (n= 10) koulutettiin valmiin sanaston kautta. Jogurttiraadin suoriutumista verrattiin tutkimuksen aikana myös ammattilaisraadin suorittamiin arviointeihin. Koulutuksen lisäksi arvioijien arvotaustan vaikutusta tarkasteltiin Schwartzin universaalia, 45 väittämästä koostuvaa arvoteoriaa noudattaen. Tuoteprofiilin perusteella näytteiden ominaisuuksien voimakkuuksissa oli havaittavissa tilastollisesti merkitseviä eroja eli näytteet voitiin erotella toisistaan tutkittavien ominaisuuksien perusteella. Koulutetun jogurttiraadin arviointitulokset olivat yhdenmukaisia ammattilaisraadin tulosten kanssa. Tuoteinformaatio tai tuotteista esitetyt väittämät eivät vaikuttaneet merkittävästi profiiliin ja voimakkuusarviointeihin. Arvoteorian mukaan arvioijaraadin sisälle muodostettiin kolme arvoluokkaa: itseohjautuvuus, turvallisuus ja hyväntahtoisuus. Yhdessä arvotarkastelun kanssa suoritettu näytteiden profiilinmuodostus paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja arvioinneissa eri arvoluokkien välillä kummassakin tuoteryhmässä. Näiden tulosten perusteella arvioijan henkilökohtaisilla arvoilla näyttäisi olevan vaikutusta ominaisuuksien voimakkuusarviointeihin. Asiasanat: kuvailevat menetelmät, arvot, Schwartzin arvoteoria

20 «20» Prosessoinnin vaikutus mustaherukan aistittavaan laatuun Oskar Laaksonen Ohjaajat: FM Terhi Pohjanheimo, FT Katja Tiitinen ja Prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Mustaherukka (Ribes nigrum) on terveellinen pensasmarja, jota käytetään esimerkiksi mehujen ja viinien raaka-aineena. Herukassa on paljon C-vitamiinia ja sen siementen rasvahappokoostumus on edullinen ihmiselle. Mustaherukka sisältää myös paljon erilaisia fenolisia yhdisteitä, kuten flavonoideja, joilla on terveyttä edistäviä vaikutuksia antioksidatiivisten ominaisuuksien ansiosta. Tämän työn tarkoituksena oli selvittää, miten mustaherukan prosessointi vaikuttaa sen aistittavaan makuun. Teollisuudessa mustaherukasta hyödynnetään pääasiassa vain mehua. Prosessoinnilla voitaisiin hyödyntää myös puristejäännöstä ja muita prosessoinnin tuotteita. Mustaherukasta puristettiin mehua ja puristejäännöstä uutettiin elintarvikekelpoisella etanolilla neljä kertaa. Uuttojen jälkeen etanoli haihdutettiin pois ja uutteet liuotettiin veteen. Eristettyjä näytteitä oli yhdeksän, joista jokaiselle muodostettiin makuprofiili kuvailevien menetelmien avulla. Arvioijia oli yhteensä 15 ja heidät koulutettiin ennen varsinaisia arviointeja. Koulutuksen perusteella arvioitavat ominaisuudet olivat näytteiden kokonaisvoimakkuus, täyteläisyys, makeus, marjaisuus, happamuus, karvaus, kirpeys ja astringoivuus. Työ tehtiin aistittavan laadun laboratoriossa. Kuvailtuja ominaisuuksia arvioitiin janaasteikolla käyttämällä apuna vertailunäytteitä. Mehu erosi muista näytteistä tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,05) karvautta ja astringoivuutta lukuun ottamatta kaikissa ominaisuuksissa ollen näissä voimakkain. Uutejäännös erosi muista tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,05) ollen puolestaan heikoin vastaavissa ominaisuuksissa. Uuttokertoja lisäämällä arvioitujen makuominaisuuksien voimakkuus heikkenee. Puristejäännös ei eroa etanolilla käsitellystä puristejäännöksestä. Arviointien perusteella suurin osa mustaherukan mausta jää mehuun. Asiasanat: mustaherukka, aistinvarainen arviointi, etanoliuutto, fenoliset yhdisteet

21 «21» Marjojen flavonoidien analysointi plasmasta HPLC-ESI-MS/MSmenetelmällä Henna-Maria Lehtonen Ohjaajat: FT Jukka-Pekka Suomela ja Prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Marjat ovat pieniä pyöreitä pohjoisilla leveysasteilla menestyviä hedelmiä, joita pidetään yleisesti terveellisinä. Kiinnostus marjojen bioaktiivisten yhdisteiden sekä monien sairauksien välisiin vuorovaikutuksiin on kuitenkin noussut nykyisiin mittoihinsa vasta viime vuosina. Eräs bioaktiivisten yhdisteiden ryhmä on flavonoidit, joita marjoissa esiintyy huomattavia määriä. Marjojen flavonoidit toimivat sekä antioksidantteina että erilaisissa säätelytehtävissä. Flavonoidien terveysvaikutuksia on tutkittu runsaasti mm. in vitro-menetelmin. Kattavan käsityksen saamiseksi flavonoidien metaboliasta on kuitenkin siirryttävä yhä enenevissä määrin flavonoidien in vivo imeytymiseen ja reaktioihin keskittyvään tutkimukseen. Tämän erikoistyön tavoitteena oli kehittää herkkä ja selektiivinen nestekromatografiaan (HPLC) sekä tandemmassaspektrometriaan (MS/MS) perustuva menetelmä marjojen kuuden flavonoidien analysoimiseksi plasmasta. Erikoistyössä optimoitiin esikäsittely-, HPLC- sekä MS/MS-menetelmät neljän flavonolin (isoramnetiini, kversetiini, myrisetiini ja kemferoli) sekä kahden katekiinin ((+)-katekiini ja (-)-epikatekiini) yhtäaikaiseksi analysoimiseksi plasmasta. Lisäksi mainittujen flavonoidien pitoisuudet analysoitiin plasmasta neljästä pohjoisesta marjasta koostuvan marja-annoksen nauttimisen jälkeen. Isoramnetiinin, kversetiinin ja kemferolin kohdalla menetelmän herkkyys saatiin tasolle, joka luultavimmin mahdollistaa kvantitatiivisen analysoinnin myös pienemmillä plasman flavonoidipitoisuuksilla kuin mitä optimoinnissa käytettyjen postprandiaalisten näytteiden pitoisuudet olivat. Myrisetiini ja molempien katekiinien kvantitointirajat jäivät kuitenkin liian korkealle johtuen lähinnä intensiivisen tytärionin puuttumisesta käytetyissä ionisointiolosuhteissa, mikä vaikeutti MSMS-menetelmän optimointia. Plasman isoramnetiini- ja kversetiinipitoisuudet kasvoivat marjojen syönnin seurauksena, mutta muiden flavonoidien kohdalla selvää eroa ei ollut havaittavissa. Kemferolin kohdalla tämä johtunee sen rajallisesta esiintymisestä tutkittavissa marjoissa, muilla flavonoideilla liian korkeista kvantitointirajoista. Asiasanat: marjat, flavonoidit, massaspektrometria

22 «22» Maitohappopitoisuuden määrittäminen ananas- ja omenatäysmehutiivisteistä Eija Isokangas Ohjaajat: Anal. H. Nurminen, FT E. Järvenpää ja Prof. R. Huopalahti ELINTARVIKEKEMIA Elintarvikkeita valmistavassa yrityksessä laadunvarmistuksen tärkeimpiin alueisiin kuuluu raaka-aineiden vastaanottotarkastus. Tarkastuksessa tutkitaan prosessointiin tulevien ainesten kemiallinen, fysikaalinen, mikrobiologinen ja aistinvarainen laatu. Marjat ja hedelmät pilaantuvat helposti happotoleranttien bakteerien, hiivojen ja homeiden vaikutuksesta. Mikrobien kasvu näkyy mm. maitohappopitoisuuden nousuna. Tämän työn tarkoituksena on valita Oy Marli Ab:n laboratorioon sopiva kvantitatiivinen maitohappopitoisuuden määritysmenetelmä. Tässä työssä verrattiin kirjallisuudesta valitun menetelmän pohjalta muokattua HPLC-menetelmää ja entsymaattista A.I.J.N:n suosittelemaa D-/L-maitohappojen analyysimenetelmää. Aistittavaa laatua tutkittiin erotustestillä ja kuvailevalla menetelmällä. Ananastäysmehuun lisättiin kemiallisesti valmistettua maitohappoa tunnetut pitoisuudet ja analysoitiin molemmilla menetelmillä. Täysmehun sisältämä maitohappopitoisuus mitattiin nollanäytteenä. Pitoisuusaluella 0,1 0,5 g/l HPLC:llä saatiin pienempi ero teoreettiseen määrään nähden kuin entsymaattisesti. Pitoisuusalueella 0,7 0,9 g/l tilanne oli päinvastoin. Aistinvaraisten testien perusteella luotiin sanasto vastaanottotarkastuskäyttöön. Nestekromatografinen menetelmä on käytössä miellyttävämpi, edullisempi käyttökustannuksiltaan ja aikaa säästävämpi kuin entsymaattinen menetelmä. Analysoijan muodostama epävarmuustekijä on suurempi entsymaattisessa kuin HPLC- menetelmässä. HPLC-analytiikka osoittautui toistettavaksi ja nopeaksi. Matriisin vaikutus menetelmän saantoon on merkittävä. Jatkossa on tarpeen kehittää näytteiden esikäsittelyä, ja siten eliminoida häiritseviä komponentteja. Aistinvaraisesti todettiin, että varsinainen kemiallisesti valmistetun maitohapon vaikutus aistittavaan laatuun oli olematon verrattuna mikrobien fermentoiman maitohappopitoisuuden nousun vaikutukseen aistittavassa laadussa. Ilmeisesti mikrobit tuottavat muita haihtuvia yhdisteitä, jotka tosiasiassa aiheuttavat aistittavien ominaisuuksien laadun heikkenemisen. Tätä olisi mielenkiintoista tutkia esim. HS-SPME-GC-menetelmällä. Laadunvarmistuksessa HPLCmenetelmän voi ottaa käyttöön, mutta eri raaka-aineille tulee määrittää matriisista johtuva epävarmuustekijä. Riitatapauksissa kannattaa näytteet analysoida molemmilla menetelmillä. Asiasanat: maitohappo, ananastäysmehutiiviste, analyysimenetelmävertailu