NEUTROFIILISTEN GRANULOSYYTTIEN KÄYTTÖ TERVEYSHAITAN ARVIOINNISSA. Janne Atosuo FT Biokemian laitos Immunokemia Kliininen tutkimusyksikkö TROSSI 2018

Transkriptio

1 NEUTROFIILISTEN GRANULOSYYTTIEN KÄYTTÖ TERVEYSHAITAN ARVIOINNISSA FT Biokemian laitos Immunokemia Kliininen tutkimusyksikkö TROSSI 218

2

3 NEUTROFIILIT Granylosyyttiset neutrofiilit ovat yleisin valkosolutyyppi Käytännössä ne tuhoavat ja poistavat fagosytoimalla kaikki järjestelmää ja kudosta uhkaavat tunkeutujat, siis mikrobit tai vieraspartikkelit Klebanoff et al. 213 Hurst 212 Thrasher, Segal 211 Roos, Winterbourn 22

4 NEUTROFIILIT Neutrofiilit toimivat immuunijärjestelmän ensimmäisenä solupuolustuslinjana ja ovat merkittävä osa synnynnäisen immuniteetin toimintaa. Neutrofiilit osallistuvat olennaisina tekijöinä myös adaptiivisen immuunivasteen indusoitumiseen ja koko systeemin homeostaasin ylläpitoon ja säätelyyn. Klebanoff et al. 213 Hurst 212 Thrasher, Segal 211 Roos, Winterbourn 22

5 O 2 Glukoosi MPO 3. Hengitysryöpsähdys NADPH- Oksidaasi O 2 - MPO MPO 2. Tunnistus, Adheesio, Ingestio Vasta-aineet IgG, (IgA, IgM) Fc reseptorit Komplementin komponentit Komplementtireseptorit H 2 O 2. O 2 OH - Elektronien viritystila Patogeeni 1. Opsonisaatio HOCl 4. Tappo, Hajoitus Kemiluminesenssi Klebanoff et al. 213 Hurst 212 Atosuo et al. 211 Thrasher, Segal 211 Segal 25 Reeves et al. 22 Roos, Winterbourn 22

6 Kemiluminesenssi (CPS) 3 25 Ingestio Herkkä kemikaaleille Adheesio min Vilén et al. 217 Atosuo 215 Ciz et al 212 Pedata et al. 212 Jantan et al. 211 Lilius, Nuutila 26 Marnila et al 1995 Lilius et al. 1987

7 Kemiluminesenssi (CPS) 3 Ingestio Adheesio min

8 Kemiluminesenssi (CPS) 3 Adheesio Ingestio min

9 Kemiluminesenssi (CPS) 3 Adheesio Ingestio min

10 Kemiluminesenssi (KL) IN VITRO TOKSISUUSMITTAUS Neutrofiilejä voidaan käyttää toksisuuskoettimin joko eristettynä tai kokoverilaimennoksena esim. sormenpääverinäytteestä Toksisuus havaitaan kemiluminesenssin laskuna! A µg/ml,1 µg/ml,1µg/ml 1 µg/ml 1 µg/ml Atosuo. 215 ja 217 Vilén. et al. 217 Ciz et al 212 Lilius, Nuutila. 26 Marnila. et al 1995 Lilius et al min Mitokondriomyrkky antimysiini A:n vaikutus ihmisen sormenpääveren neutrofiilien fagosytoosiaktiivisuuteen. Kuvassa vaikutus KL kinetiikkaan. Arvot kolmen mittauskaivon keskiarvo ja STDV. Kuvassa B Antimysiini A:n annosvasteet. Annosvaste µg/ml, eli pelkkien neutrofiilien vaste, määriteltiin 1 %:ksi.

11 Piikkiarvon lasku (%) 1 IN VITRO TOKSISUUSMITTAUS PÖLYNÄYTTEET Standardi (EI-TOKSINEN) Standardi (TOKSINEN) Vilén Et al. 217 Cecinato et al. 217 La Guardia et al. 217 Atosuo Standardi ( g/ml)

12 IN VIVO TOKSISUUSMITTAUS Kirjolohi: Paperiteollisuuden valkaisuun käyttämät kloridipitoiset valkaisuaineet laskivat merkittävästi kirjolohien neutrofiiliaktiivisuutta huuhdevesialtaissa Lilius et. al Rotta: 28 päivän altistus (ravinnossa) moniliformiinille laski merkittävästi rottien neutrofiiliaktiivisuutta Jonsson et. al. 214

13 (%) IN VIVO TOKSISUUSMITTAUS Ihminen: Vauriorakennuksista mahdollisesti altistuneiden neutrofiilivasteita mitataan. Oireettomia ja oireellisia verrataan. Vilén. et al. 217 Atosuo. 215, 217 Ciz et al 212 Lilius et al. 1987, 1992, 28 Marnila. et al V3 C1 Oire (n=17) matala aktiivisuus B Terve (n=18) Testattujen henkilöiden neutrofiilien soluspesifiset fagosytoosiaktiivisuudet. Kontrolliryhmän (n=18), eli terveiden henkilöiden keskiarvo määritettiin 1 %:ksi. Vaurioryhmän (n=17) kohdalla erottui alhaisen aktiivisuuden omaava ryhmä, joka on kuvassa ympyröity.

14 ALTISTUKSEN MITTAUS SEERUMINÄYTTEISTÄ IgG on seerumin pääopsoniini ja itiöspesifiset fagosytoosiaktiivisuudet korreloivat itiöspesifisten ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay) - tulosten kanssa. Mitä suurempi määrä vasta-ainetta sitä tehokkaampi fagosytoosiaktiivisuus. Voidaan käyttää sormenpääverinäytettä, joka mahdollistaa pikatestien suunnittelun Vilén et al. 217 Atosuo. 215 ja 217 Ciz. et al. 212 Lilius. et. al ja 1992

15 2. Tunnistus, Adheesio, Ingestio Spesifiset vasta-aineet (IgG) MPO O 2 Glukoosi MPO 3. Hengitysryöpsähdys NADPH- Oksidaasi O 2 - MPO H 2 O 2. O 2 OH - Elektronien viritystila 1. Opsonisaatio HOCl 4. Tappo, Hajoitus Kemiluminesenssi Vilén L. et al. 217 Atosuo J. 215 ja 217 Lilius EM. et. al ja 1992

16 2,5 5 7,5 1 12, ,5 2 22, ,5 3 32, ,5 4 42, ,5 5 52, ,5 6 2,5 5 7,5 1 12, ,5 2 22, ,5 3 32, ,5 4 42, ,5 5 52, ,5 6 ALTISTUKSEN MITTAUS Seerumi josta mitattu korkea Itiöspesifinen (Streptomyces albus) IgG Seerumi josta mitattu matala Itiöspesifinen (Streptomyces albus) IgG 45 Seerumissa inkuboitu itiö aiheuttaa korkean fagosytoosi vasteen Tehokas opsonisaatio Seerumissa inkuboitu itiö aiheuttaa matalamman fagosytoosi vasteen Hekompi opsonisaatio

17 Referenssi Itiöspesifinen ELISA Itiöspesifinen fagosytoosi

18 LEUKOSYYTTIEN PINTARESEPTOREIDEN FENOTYYPITYS Leukosyyttien pintareseptorien fenotyypitys perustuu valkosolujen pintareseptoreiden analyysiin virtaussytometrillä. Leukosyyttipopulaatiosta mitataan tiettyjen pitareseptoreiden expressioita (mm. CD35, CD46, CD55, CD59, CD28, CD64, CD11b ja MHC I). Analyysi tapahtuu statistisesti, erilaisten reseptorien ja reseptoriryhmien ilmenemisen suhteista Bakteeri- ja virusinfektioissa leukosyyteillä on oma toisistaan ja terveistä yksilöistä eroava pintareseptorifenotyyppinsä ja ne pystytään nopeasti tällä menetelmällä differentioimaan. Menetelmällä on testattu suuri määrä infektiopotilaita (n >12) ja sillä pystytään hyvin korkeaan spesifisyyteen ja sensitiivisyyteen bakteeri/virusdifferentiaalidiagnostiikassa. Menetelmä on käytössä Turun yliopistollisen keskussairaalassa. Nuutila et al. 28, 29, 21, 211, 212, 213, 216 Lilius et. al. 212

19 LEUKOSYYTTIEN PINTARESEPTOREIDEN FENOTYYPITYS Kosteusmikrobialtistuksen aiheuttamat muutokset muodostavat oletettavasti oman fenotyyppinsä, joka eroaa vastaavista bakteeri- ja virusinfektioista sekä terveistä kontrolleista. Vilén et al. 217 Nuutila et al. 28, 29, 21, 211, 212, 213 ja 216 Lilius et. al. 212

20 Hyvä patofysiologisen tilan mittari! Herkkä toksiineille! Koetinsolu toksisuusmittuksiin! IN VITRO-testaus IN VIVO-testaus Toksiinille altistunut systeemi Altistuksen mittaus Seerumin antigeenispesifinen IgG Leukosyyttien fenotyypitys virtaussytometyrillä Soluja tarvitaan vähän ja testi voidaan tehdä esim. sormenpääverestä! Mahdollistaa pikatestien kehittämisen

21 Kliininen tutkimusyksikkö TROSSI Prof MD Tuula Putus (LKT) Dos MD Jussi Kantele (LKT) FT (Biokemia) Tohtorikoulutettava TtM Liisa Vilen (LKT) Tohtorikoulutettava FM Eetu Suominen (LKT, Biokemia) Maisteriopiskelija LuK Juho Myllymäki (Biokemia) LuK Eemil Aalto-Setälä (Biokemia) Bachelor student Veronika Skockova (Masaryk University, Czech Republic) (Biokemia) Biokemian laitos Dos Jari Nuutila Dos Esa-Matti Lilius University of Turku Työsuojelurahasto