In vivo -kuvantaminen eturauhassyövän hiirimallissa. Helena Ahtinen. Ohjaajat: FT Saija Savolainen ja prof. Anne Roivainen BIOKEMIA

Transkriptio

1 In vivo -kuvantaminen eturauhassyövän hiirimallissa Helena Ahtinen Ohjaajat: FT Saija Savolainen ja prof. Anne Roivainen BIOKEMIA Eturauhassyöpä (PC) on yleisin syöpä länsimaisilla miehillä. Lääkekehityksessä kasvaimen kasvun seuranta sekä lääkeaineen kohdehakuisuus on keskeisessä osassa. Optinen in vivo -kuvantaminen perustuu valoa tuottavilla (bioluminesoivilla tai fluoresoivilla) raportoijilla transfektoitujen solujen käyttöön. Positroniemissiotomografia (PET) perustuu radionuklidin lähettämään positronisäteilyyn. Positronin ja elektronin törmätessä molemmat korvautuvat täysin toisistaan päinvastaiseen suuntaan lähtevällä gammasäteilyllä, jonka perusteella radionuklidin sijainti saadaan selville hyvin tarkasti. PETkuvantaminen on leikekuvausmenetelmä ja sen yhdistäminen tietokonetomografiaan (TT) mahdollistaa myös kohteen anatomisen tarkastelun. Tämän erikoistyön tarkoituksena oli seurata eturauhaskasvaimen kasvua optisen kuvantamisen sekä PET/TT in vivo -kuvantamisen avulla. Kasvaimet aikaansaatiin injisoimalla immuunipuutteisille hiirille miljoona lusiferaasilla tai fluoresoivalla proteiinilla (RFP) transfektoitua ihmisen eturauhassyöpäsolua (PC- 3) joko ihonalaisesti niskaan tai ortotooppisesti eturauhaseen. Kasvainten kasvua seurattiin neljä viikkoa, jona aikana kukin eläin kuvattiin kolme kertaa sekä optisen kuvantamisen laitteella (IVIS Lumina II) että PET/TT:llä. Ihonalaisten kasvainten PET-kuvantamiseen käytettiin gastriinia vapauttavan hormonin reseptoriin (eng. gastrin releasing peptide receptor, GRPR) sitoutuvaa 68 Gabombesiinia ja ortotooppisten kasvainten kuvantamiseen transferriinireseptoriin (TfR) sitoutuvaa 68 Ga-kloridia. Viimeisen kuvantamisen päätteeksi hiiret lopetettiin ja kudoksiin kertynyt radioaktiivisuus mitattiin myös gammamittauslaitteella. Tuumorinäytteet otettin talteen ja tehtiin GRPR ja TfR proteiinien immunohistokemialliset määritykset. Optisen kuvantamisen suure korreloi hyvin tuumoreiden tilavuuteen sekä painoon. 68 Ga-bombesiini kerääntyi ihonalaisiin tuumoreihin ja ne olivat selvästi erotettavissa taustasta. 68 Ga-kloridia erittyi virtsaan, jolloin virtsarakon korkea radioaktiivisuus hankaloitti ortotooppisten kasvainten in vivo-kuvantamista. Asiasanat: eturauhassyöpä, optinen kuvantaminen, positroniemissiotomografia, tietokonetomografia

2 Sika ihmisen mallina lihavuustutkimuksessa Thomas Byrne Ohjaajat: FM Baoru Yang ELINTARVIKEKEMIA Tutkimus on esikoe tutkimushankkeelle, jossa tarkoituksena on selvittää altistaako äidin ylipainoisuus ja runsasrasvainen ruokavalio lapsensa lihavuudelle. Esikokeessa tutkitaan voidaanko rasvattomaan tuotantoon jalostettuja sikoja lihottaa ruokavaliolla, joka yleisesti muistuttaa ihmisten ylipainoon johtavaa runsasrasvaista ja -sokerista ruokavaliota. Sikojen nahan alle ja sisäelinten ympärille kertyvää rasvasta analysoidaan rasvahappoja, jotta saadaan selville sikojen lihomisen fysiologia ihmisen ravintoa muistuttavalla ravinnolla. Kokeessa on neljä ruokintaryhmää, joihin jokaiseen kuuluu 10 sikaa. 1. ruokintaryhmä on täysin siitossikojen ravintoainesuosituksien mukainen. Ryhmän 2 rehuissa on alempi rasvapitoisuus kuin 3. ja 4. ryhmän rehuissa, joissa tavoitellaan painoprosenttia rasvan osuudeksi. Ryhmien 2-4 rehuissa on myös sokeria 15 painoprosenttia ja 4. ryhmän rehussa on mukana myös vehnälesettä kuitulähteenä. Naarassikoja kasvatetaan sukukypsyysikään, jonka jälkeen ne teurastetaan. Teurastetuista ruhoista otetaan ihonalaisrasvakudosnäytteet sekä elinrasvakudosnäytteet, joista uutetaan rasvahapot kloroformi-metanoli 2:1 seoksella. Eristetyt rasvahapot metyloitiin rasvahappojen metyyliestereiksi booritrifluoridilla (BF 3 ) ja tolueenilla. Rasvahappoprofiilia analysoidaan kaasukromatografilla. Saaduista tuloksista on nähtävissä ruokintaryhmien vaikutukset rasvakudosten suhteelliseen rasvahappo koostumukseen. Tutkimus on vielä näytteiden kaasukromatografia-analyysi -vaiheessa. Saadut tulokset näyttävät kuitenkin lupaavilta varsinaisten tutkimustulosten tarkastelua varten. Asiasanat: kaasukromatografia, rasvahappoprofiili, sianrasva

3 Asetaldehydin määrittäminen SPME-GC-MS menetelmällä Oili Hult Ohjaajat: FT Marika Jestoi, professori Rainer Huopalahti, professori Kimmo Peltonen ELINTARVIKEKEMIA Asetaldehydi (AcA) on helposti haihtuva pienimolekyylinen (MW=44,05) yhdiste. Sitä käytetään aromiaineena elintarviketeollisuudessa, mutta asetaldehydiä esiintyy myös luontaisesti elintarvikkeissa. Esimerkiksi maitotaloustuotteissa syntyy luonnostaan asetaldehydiä. Elintarvikkeiden asetaldehydipitoisuuksista on toistaiseksi hyvin vähän tietoa eikä sen määrittämiseen ole olemassa vakiintunutta menetelmää. Kiinnostus elintarvikkeiden asetaldehydin määrittämiseen kasvoi sen menetettyä turvallisena pidetyn yhdisteen arvonsa (GRAS) vuonna 2009 ja IACR:n arvioitua sen ryhmän 1 karsinogeeniksi. AcA:n määrittämiseen käytettiin kaasukromatografi-massaspektrometri (GC- MS) menetelmää, jossa kiinteäfaasimikrouuttoa (SPME) käytetään elintarvikenäytteen esikäsittelyssä. Kiinteäfaasimikrouutossa tutkittava yhdiste konsentroidaan polymeeripäällysteiseen silikakuituun, josta se voidaan irrottaa kaasukromatografin injektorissa ja analysoida. Asetaldehydin kvantitointiin valittiin sisäisen standardin menetelmä. Sisäisenä standardina käytettiin deuteroitua asetaldehydiä (AcA d 4 ). Erikoistyössä kehitettiin automaattinen SPME-GC-MS menetelmä asetaldehydin määrittämiseen elintarvikkeista. Kehitetty menetelmä validoitiin vedelle ja yhdelle hedelmämehulle. Validointiparametreiksi valittiin spesifisyys, selektiivisyys, lineaarisuus, toistettavuus, uusittavuus, oikeellisuus, havaitsemisraja, määritysraja ja takaisinsaanto. Validoinnin jälkeen menetelmää sovellettiin Suomessa markkinoilla olevien hedelmätäysmehujen analysointiin. Validointi osoitti menetelmän soveltuvan hyvin AcA:n määrittämiseen mehunäytteistä. Vasteen todettiin olevan spesifinen eikä nk. matriisiefektiä havaittu (selektiivisyys). Menetelmä oli toistettava ja uusittava, suhteellisen keskihajonnan ollessa päivän sisällä 0,6-2 % ja päivien välillä 5-12 %. AcA:n takaisinsaanto oli erinomainen (ka.105 %). Menetelmän havaitsemis- ja määritysrajoiksi saatiin 50 ja 100 µg/kg. Mehunäytteistä määritettiin niiden AcApitoisuus, jonka muutosta mitattiin myös ajan funktiona myös suositellun säilytysajan jälkeen. Asiasanat: asetaldehydi, SPME, GS-MS, validointi, hedelmämehut

4 Paranevan haavan proteomiikka-analyysi Noora Jaakkola Ohjaajat: Prof. Hannu Larjava, Prof. Lari Häkkinen, Prof. Jyrki Heino, FT Anne Rokka, FT Garry Corthals BIOKEMIA Kun iholle tulee haava, jää siihen yleensä paranemisen seurauksena jonkinlainen arpi. Arpi saattaa häiritä kantajaansa esteettiseltä kannalta, mutta joissakin tapauksissa aiheuttaa myös fysikaalista haittaa esimerkiksi heikentämällä nivelen liikkuvuutta. Tutkimuksissa on todettu suun limakalvon haavojen paranevan ihon haavoja nopeammin ja haavan parantuessa arven muodostuksen olevan huomattavasti vähäisempää. Asiaa on tähän saakka tutkittu enimmäkseen jyrsijöillä, mutta näitä tuloksia ei jyrsijöiden erilaisen ihon rakenteen takia voida soveltaa ihmiseen. Jyrsijää paremmin asiaa pystytään sen sijaan tutkimaan sialla, jonka iho muistuttaa enemmän ihmisen ihoa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena on löytää ihon ja suun limakalvon väliltä sellaisia proteiinitason eroja, jotka aiheuttavat kudosten väliset eroavaisuudet haavan paranemisessa. Tutkimusta varten oli kerätty biopsianäytteitä sikojen suun limakalvolle, sekä selän iholle tehdyistä haavoista paranemisen eri vaiheissa. Näytteet oli ajettu SDS-PAGE geelille proteiinien suurpiirteiseksi erottamiseksi, josta ne uutettiin irti ja digestoitiin peptideiksi massa-analyysiä varten. Analyysiin käytettiin nestekromatografiin kytkettyä massaspektrometria (LC-MS), ja saatua spektriä vastaavat proteiinit etsittiin tietokannasta hakuohjelmistolla. Tätä dataa käsiteltiin edelleen erilaisia evaluaatio- ja annotaatiomenetelmiä käyttäen, jolloin saatiin tietoa eri aikapisteissä rikastuneista reaktioteistä. Jatkossa näytteiden välillä eniten eroavia proteiineja pyritään tunnistamaan haavanäytteistä esim. immunovärjäyksellä ja varmistamaan siten erot näiden proteiinien ilmentymisessa kudosten välillä. Tähän astiset tulokset tukevat aiemmin tehtyjä havaintoja siitä, että suussa paranemisprosessi on kokonaisuudessaan nopeampi, kun taas iholla tulehdusreaktio on hyvin voimakasta pitkään ja paraneminen hitaampaa. Menetelmän toimivuus ollaan nyt pystytty varmistamaan, mutta varsinaisten tulosten saaminen vaatii vielä paljon työtä. Tällä hetkellä arven muodostumisen estämiseksi ei ole olemassa hoitoa, mutta tämän kaltainen tutkimus ja sen myötä haavan paranemiseen, sekä arvenmuodostukseen vaikuttavien proteiinien löytyminen auttaisi mahdollisesti myös hoitokeinojen kehityksessä. Asiasanat: haava, arvenmuodostus, massaspektrometria, proteiini

5 Uudenlainen immunokromatografinen troponiini I vieritesti Katriina Juhola Ohjaajat: FM Tiina Myyryläinen ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Immunokromatografiset määritykset eli lateraalivirtausmääritykset (engl. lateral flow assay, LF-määritys) ovat tyypillisiä vieritestaukseen sopivia pikatestejä. Perinteisten LF-määritysten ongelmana on riittämätön herkkyys, joka johtuu käytetyistä leimoista kuten visuaalisesti tulkittavista värillisistä kulta- ja lateksipartikkeleista. Erikoistyön tavoitteena oli pystyttää kaksipuoleisen immunokompleksin muodostumiseen perustuva LF-määritys sydänperäisen troponiini I:n (engl. cardiac-specific troponin I, ctni) havaitsemiseksi seeruminäytteistä. Akuutin sydäninfarktin merkkiaineen ctni:n vieritestaus on tärkeää sydänkohtauspotilaiden nopean jatkohoidon takaamiseksi. LF-määritystä pyrittiin kehittämään käyttämällä leimana paremman herkkyyden mahdollistavia Eu(III)-kelaatilla täytettyjä 107 nm polystyreeninanopartikkeleita. Lisäksi tutkittiin, voidaanko testiviivan sitojapinnan kapasiteettia kasvattaa käyttämällä sitojapintana streptavidiinia ja siihen sidottua biotinyloitua anti-ctni-vastaainetta. Lateraalivirtauslastun testiviivana käytettiin joko passiivisesti sidottua anti-ctnivasta-ainetta tai streptavidiinin ja biotinyloidun anti-ctni-vasta-aineen muodostamaa kompleksia. ctni havaittiin anti-ctni-vasta-aineella päällystetyillä Eu-nanopartikkeleilla. Herkkyyden parantamiseksi analyytti-nanopartikkeliseosta inkuboitiin ennen imeyttämistä lateraalivirtauslastulle. Testiviivaan sitoutumattomat Eu-nanopartikkelit sitoutuivat kontrolliviivaan, joka oli joko sekundaarista vasta-ainetta tai stabiloitua ctni:a. Eu(III)-kelaatin fluoresenssi mitattiin aikaerotteisella skannaavalla mittaustavalla. Erikoistyössä kehitetyn uudenlaisen immunokromatografisen ctni-vieritestin herkkyydeksi saatiin 0,01 ng/ml, joka on parempi kuin useiden kaupallisten ctni-pikatestien herkkyys. Streptavidiinisitojapinnan havaittiin mahdollistavan pienemmällä vasta-ainemäärällä parempi herkkyys, kun eri sitojapintoja verrattiin toisiinsa. Vaikka vastaava mikrotiitterikaivossa tehtävä määritys on edelleen herkkyydeltään ja kapasiteetiltaan parempi, on edellä kuvattu LFmääritys nopeampi ja soveltuvampi vieritestaukseen. Avainsanat: lateraalivirtausmääritys, sydänperäinen troponiini I, Eunanopartikkelit

6 Homogeeninen alfa-trombiinimääritys aptameerejä ja fluoresoiviksi täydentyviä lantanidileimoja käyttäen Kari Kopra Ohjaajat: LuK Sami Blom ja FM Henna Päkkilä MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Homogeenisissa määrityksissä käytetään paljon fluoresoivia leimoja, mutta ongelmana on autofluoresenssista ja epäspesifisestä sitoutumisesta aiheutuva taustasignaali. Kelaattikomplementaatio on uusi lantanidi-ioneita hyödyntävä leimateknologia. Se perustuu kahden fluoresoimattoman osan (ioninkantajakelaatti ja valoa absorboivan ligandi) täydentymiseen fluoresoivaksi kompleksiksi. Menetelmässä autofluoresenssi vältetään aikaerotteisella mittauksella ja taustasignaali jaetulla leimamolekyylillä. Useissa määritysmenetelmissä tunnistuselementteinä toimivat vasta-aineet, joiden ongelmana on heikko stabiilisuus, tuotto ja kemiallisen muokkauksen vaikeus. Aptameerit ovat lyhyitä DNA- tai RNA-nauhoja, joilla on vasta-aineiden kaltainen kyky sitoutua spesifiseen kohdemolekyyliin muuttamalla muotoaan. Oligonukleotidiluonteensa vuoksi aptameereillä voidaan välttää vasta-aineiden ongelmat. Erikoistyössä tutkittiin kelaattikomplementaation soveltuvuutta homogeeniseen ihmisen alfa-trombiinimääritykseen, käyttäen tunnistuselementteinä aptameerejä. Määritystä varten toiseen aptameeriin (15 nt) konjugoitiin ioninkantajakelaatti ja toiseen aptameeriin (29 nt) valoa absorboiva ligandi, joka siirtää viritysenergian lantanidi-ionille vain leimakompleksin muodostuessa. Aptameerien sitoutuessa trombiiniin, fluoresoivan kompleksin muodostuminen aikaansaatiin aptameereihin liitetyllä kuuden nukleotidin mittaisella pariutuvalla sekvenssillä. Määrityksessä molemmat aptameerit ja alfa-trombiini sekoitettiin määrityspuskurissa ja fluoresenssi mitattiin aikaerotteisesti viiden minuutin inkuboinnin jälkeen. Työssä osoitettiin kelaattikomplementaation soveltuvuus proteiinimäärityksiin. Määritys toimi parhaiten käytettäessä 5 nm aptameerejä, jolloin trombiinin havaintoraja oli 50 pm. Uuden leimateknologian avulla minimoitiin homogeenisen määrityksen taustafluoresenssi, jolloin signaali-taustasuhde oli parhaimmillaan yli 70. Määrityksen lineaarinen alue oli 0,05 10 nm. Erikoistyössä kehitetty määritys on herkkä, yksinkertainen ja nopea suorittaa. Määritysteknologia soveltuu myös muille molekyyleille, joissa on kaksi tunnistusmolekyylin sitoutumiskohtaa. Asiasanat: aptameeri, kelaattikomplementaatio, trombiini, fluoresenssi

7 Upkonvertoivat loisteainepartikkelit reporttereina reaaliaikaisessa PCR:ssä Essi Kulta Ohjaajat: LuK Riikka Arppe, FM Johanna Vuojola, FM Ari Lehmusvuori ja FT Tero Soukka MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Upkonvertoivat loisteainepartikkelit (engl. upconverting phosphors, UCP) ovat lantanidi-ioneja sisältäviä epäorgaanisia nanokiteitä. Niillä on ainutlaatuinen kyky virittyä infrapunavalolla ja emittoida korkeamman energian näkyvää valoa. UCP-partikkeli voi luovuttaa virittyneen tilan energiaa edelleen toiselle molekyylille, kuten orgaaniselle fluoroforille, upkonversioresonanssienergiansiirroksi (UC-RET) kutsutulla mekanismilla. Erikoistyön tavoitteena oli soveltaa UC-RET-teknologiaa reaaliaikaiseen PCR:ään käyttäen TaqMan-tyyppistä koetinta. Mallisekvenssinä käytettiin Chlamydia trachomatis -bakteerin DNA:ta. Määritystä varten UCP-partikkeli kapseloitiin ensin silikapolymeerilla, jonka jälkeen pintaan konjugoitiin sopiva oligonukleotidi (keräyssekvenssi). Määrityksessä käytettiin TaqMan-tyyppistä koetinta, joka koostui kahdesta osasta: keräyssekvenssille komplementaarisesta häntäsekvenssistä, johon oli konjugoitu Alexa Fluor 680 (AF680) -fluorofori, ja monistettavalle kohde- DNA:lle komplementaarisesta osasta, johon oli konjugoitu Blackberry Quencher 650 -sammuttaja. Reaaliaikaisen PCR:n monistusvaiheen aikana 5-3 -eksonukleaasiaktiivinen polymeraasi pilkkoi koettimen kohde- DNA:lle komplementaarisen osan jättäen häntäsekvenssin ehjäksi. Mittaustilanteessa keräyssekvenssi ja koettimen häntäsekvenssi hybridisoituivat, jolloin energia siirtyi infrapunalaserilla (980 nm) viritettyltä UCP-partikkelilta AF680-fluoroforille, jonka emissiosignaali (740 nm) mitattiin. Määritys pystyi erottelemaan eri kohde-dna-pitoisuuden omaavat näytteet, eikä UCP-partikkelien havaittu inhiboivan PCR:ää. Työn avulla voitiin näin ollen osoittaa, että UCP-partikkeleita on mahdollista käyttää reporttereina PCRmäärityksissä. Signaali-taustasuhteet jäivät mataliksi määrityksessä käytettyjen UCP-partikkelien (halkaisija >100 nm) aiheuttamasta taustasignaalista johtuen. Menetelmää on tarkoitus kehittää edelleen käyttäen pienikokoisempia UCPpartikkeleita. Asiasanat: upkonversio, resonanssienergiansiirto, reaaliaikainen PCR

8 Sharpiini α 2 β 1 -integriinin ja echovirus 1:den vuorovaikutuksessa Laura Laaksonen Ohjaajat: FT Johanna Jokinen, FM Maria Salmela ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Integriinit ovat solupinnan heterodimeerisiä adheesioreseptoreita, jotka ankkuroivat solutukirangan soluväliaineen komponentteihin. Aktiivisessa konformaatiossaan integriini sitoo luonnollista ligandiaan suurella affiniteetilla. Ligandin sitoutuminen muuttaa integriinin konformaatiota edelleen, ja tämä aiheuttaa integriinille ominaisen signaalin välittymisen. Integriinit ovat välttämättömiä myös monien patogeenien infektiossa. Tavallisesti patogeeni matkii luonnollisen ligandin sitoutumista, mutta tuore tutkimus osoitti, että α 2 β 1 - integriiniin sitoutuva ihmisen echovirus 1 (EV1) sitoutuukin inaktiiviseen integriiniin, ja infektion mahdollistava signaali etenee proteiinikinaasi C:n (PKC) aloittamana. Erikoistyön tarkoituksena on tutkia sitä, miten sharpiini-proteiini vaikuttaa EV1:n kykyyn infektoida kohdesolu. Sharpiini on pieni, monissa eri kudoksissa esiintyvä proteiini, jonka toiminta on huonosti tunnettua. Sen on kuitenkin havaittu inaktivoivan α 2 β 1 -integriini. Sharpiinin osuutta α 2 -integriinin toiminnassa tutkittiin koeasetelmalla, jossa magneettisiin helmiin kiinnitettiin EV1:tä, α 2 -vasta-ainetta, kollageenia ja IgG:tä. Helmien annettiin tarttua sekä Saos-soluihin, joihin oli transfektoitu villityyppinen tai mutaatiolla inaktivoitu α 2, että villityypin Saos-soluihin. α 2 β 1 - integriiniin kiinnittynyt signalointiproteiineista muodostunut kompleksi eristettiin solusta ja analysoitiin Western-blottauksella. Toisessa koeasetelmassa sharpiini vaimennettiin RNA-interferenssillä ennen helmikoetta. Lisäksi tullaan tarkastelemaan EV1:den infektiota sharpiinia yli- ja aliekspressoivissa soluissa konfokaalimikroskopialla. Myöhempiä toiminnallisia kokeita varten valmistetaan lisäksi sharpiinia yliekspressoivia CHO-soluja. Eri solulinjoista pyritään valitsemaan parhaat käyttämällä virtaussytometriaa. Alustavien tulosten mukaan sharpiinin inaktivoima α 2 -integriini ei lisää EV1:den infektiota. Tämä johtuu mahdollisesti siitä, että sharpiini estää PKC:n sitoutumisen β 1 -integriinin sytoplasmiseen osaan. Sharpiinin tarkemman merkityksen selvittämistä EV1:den infektiotapahtumassa tullaan jatkamaan erilaisilla toiminnallisilla ja infektiokokeilla. Asiasanat: α 2 β 1 -integriini, sharpiini, EV1

9 Mikropartikkelit vaihtoehtoisina kiintokantajina lateraalivirtaustesteissä Satu Lahtinen Ohjaajat: FM Henna Päkkilä ja FM Tiina Myyryläinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Lateraalivirtaustestit eli immunokromatografiset määritykset perustuvat nestemäisen näytteen etenemiseen reaktiomembraanilla kapillaarivirtauksen avulla. Nykyiset lateraalivirtaustestit ovat nopeita ja helppokäyttöisiä, mutta niiden valmistus on työlästä, koska ne koostuvat useista eri osista. Määritykset eivät myöskään ole riittävän herkkiä kaikkiin sovelluksiin. Työn tavoitteena oli tutkia mikropartikkeleja kiintokantajina lateraalivirtaustesteissä. Proteiinipintaisten mikropartikkelien käyttö testiviivana mahdollistaa suuren sitomiskapasiteetin pienessä tilavuudessa, minkä oletettiin lisäävän testin herkkyyttä. Työssä tutkittiin myös Fusion5-membraanimateriaalin soveltuvuutta yhdestä osasta koostuvan lateraalivirtaustestin valmistukseen. Karboksyylipintaisiin polystyreenipartikkeleihin konjugoitiin streptavidiinia (SA) ja SA-pintaiset mikropartikkelit printattiin Fusion5-membraanille testiviivaksi. Testiviivan sitomiskapasiteetti määritettiin imeyttämällä europiumilla leimattua biotiinia membraanille. Kontrollina määrityksissä käytettiin SA-testiviivaa. Mikropartikkelien soveltuvuutta immunokromatografisiin määrityksiin tutkittiin tyreotroponiinimäärityksen avulla, missä membraaniin imeytettiin biotinyloitu tyreotroponiinin tunnistava vasta-aine ja antigeeni ( ng/ml). Tyreotroponiini detektoitiin imeyttämällä membraaniin tyreotroponiinin tunnistavalla vasta-aineella pinnoitettuja europium-nanopartikkeleita, joiden signaali mitattiin skannaamalla membraani aikaerotteisella mittaustekniikalla. Sitomiskapasiteettimäärityksen perusteella mikropartikkelitestiviiva pystyy sitomaan kaksi kertaa enemmän biotiinia kuin kontrollina käytetty SA-testiviiva. Tyreotroponiinimäärityksellä pystyttiin havaitsemaan alle nanomolaarisia pitoisuuksia. Määrityksessä SA-testiviivan signaalitaso oli kuitenkin suurempi kuin mikropartikkelitestiviivan, joten SA-testiviiva mahdollistaa herkemmän määrityksen. Erikoistyön tulosten perusteella mikropartikkelien suurempaa sitomiskapasiteettia ei pystytä hyödyntämään lateraalivirtaukseen perustuvissa immunomäärityksissä. Fusion5-membraanin käyttö mahdollisti nykyistä yksinkertaisemman lateraalivirtaustestiin valmistuksen. Asiasanat: mikropartikkeli, kiintokantaja, lateraalivirtaustesti, immunomääritys

10 Genotyypin, leveyspiirin, korkeuden ja ympäristötekijöiden vaikutus fenolisiin yhdisteisiin tyrnissä Matti Leino Ohjaajat: FM Jie Zheng, FT Baoru Yang, Prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Tyrniä syödään Suomessa, koska sen tiedetään sisältävän terveyttä edistäviä ainesosia. Yksi tällaisista aineosista ovat fenoliset yhdisteet. Fenoliset yhdisteet ovat sekundäärimetaboliitteja, joita syntyy kasveissa erilaisten stressitekijöiden (esim. kuivuus ja ohut ilmanala) vaikutuksesta auttaen kasvia kestämään erilaisia stressejä. Työn tarkoituksena on tutkia fenolisten yhdisteiden määrää ja laatua tutkimalla eri lajikkeiden, eri puolilta maapalloa, korkeuksilta ja leveysasteilta poimittuja marjoja monen vuoden ajalta. Näihin tuloksiin yhdistetään kerätty säätieto marjojen kasvun ajalta ja vertaillaan fenolisten yhdisteiden koostumusta ja määrää marjoissa. Fenoliset yhdisteet erotettiin murskatuista kokomarjoista etikkahappometanoliliuoksella liuottamalla kolme kertaa käyttäen sekoitusta ja sentrifugia. Tämän jälkeen saatu supernatantti haihdutettiin kuivaksi ja liuotettiin 10 millilitraan vettä. Liuotettu supernatanttti fraktioitiin kiinteäfaasiuutolla, jotta siitä saatiin marjasta tulleet hapot pois. Fenoliset yhdisteet saatiin kiinteäfaasiuutosta eluoimalla 20 millilitralla metanolia, joka haihdutettiin kuivaksi. Lopullinen näyte liuotettiin 3 millilitraan metanolia, suodatettiin ja säilöttiin säilöpulloon HPLC analyysia varten. Jokaisesta näytteestä tehtiin kolme rinnakkaista näytettä. HPLC laitteistolla näytteet (injektiotilavuus 10 µl) ajettiin gradienttiajolla käyttäen ajoliuoksina asetonitriiliä ja vesi:tetrahydrofuran:trifluorietikkahappoa seosta. Kolonnina käytettiin Phebomex ODS 5u (250 x 4,6 mm, partikkelikoko 5 µm) ja detektorina SPD- M10AVP diodirividetektori (viivanleveys 270 µm) injektiotilavuuden ollessa 10 µl. Isoa osaa tuloksista ei ole vielä saatu ja tässä vaiheessa on todella vaikeaa vielä antaa minkäänlaista arviota tuloksista tai tehdä päätelmiä, sillä sen pohjana olevaa materiaalia on liian vähän. Odotettavissa olevina tuloksina voidaan pitää sitä, että korkealla ja kuivassa kasvaneet tyrnit sisältävät enemmän fenolisia yhdisteitä niiden joutuessa stressitilaan. Se kuinka paljon ja minkä tyyppisiä fenolisia yhdisteitä kasvi tuottaa jää nähtäväksi, kun tulokset ja tilastollinen analyysi valmistuvat. Asiasanat: fenoliset yhdisteet, HPLC, tyrni

11 Dengue-viruksen tunnistaviin vasta-aineisiin sitoutuvien peptidien identifiointi Julius Manninen Ohjaajat: FT Gaurav Batra, FT Urpo Lamminmäki MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Flaviviruksiin lukeutuvan dengue-viruksen neljä eri serotyyppiä aiheuttavat kuumetautia, joka voi edetä hengenvaaralliseksi verenvuototaudiksi tai shokkitilaksi. Tartunnan saaneita on vuosittain maailmanlaajuisesti jopa 100 miljoonaa yli sadassa maassa. Taudin eri muotojen hoidossa on tärkeää aloittaa hoito mahdollisimman aikaisin. Tämä edellyttää nopeaa ja tarkkaa diagnosointia, joka tällä hetkellä on puutteellista testien ristireagoidessa muiden flavivirusten kanssa. Dengue-virusinfektion seurauksena potilaan elimistö muodostaa vasta-aineita viruksen proteiineja vastaan. Työssä yritettiin löytää satunnaispeptidikirjastosta dengue-viruksen tunnistaviin vasta-aineisiin sitoutuvia peptidisekvenssejä faaginäyttötekniikan avulla. Vasta-aineet olivat potilasnäytteistä ennen ja jälkeen infektion. Faagin rungon tunnistavat vasta-aineet poistettiin näytteistä inaktivoiduilla faageilla päällystettyjen magneettipartikkelien avulla. Lisäksi kirjastosta poistettiin ne peptidit, jotka sitoutuivat dengue-infektiota edeltävän potilasnäytteen vasta-aineisiin. Näin esikäsitelty faagikirjasto altistettiin lopuksi saman potilaan infektion jälkeiselle vasta-ainenäytteelle. Viimeisestä sitoutumisreaktiosta eluoitujen faagien annettiin infektoitua E. coli -soluihin monistamista varten. Rikastuskierros toistettiin kahdesti. Jatkossa rikastettujen peptidien ja denguen proteiinien sekvensseistä voidaan etsiä yhtäläisyyksiä. Faagien inaktivointi oli täydellinen 1000 J/m 2 intensiteetillä. Faagien seulonta kahdella näyteparilla onnistui, mikä havaittiin vertaamalla faagimääriä ennen ja jälkeen seulonnan. Vertailu tehtiin laskemalla faagien aiheuttamat plakit solumatolta. Seulottujen faagien rikastuminen oli noin 240-kertainen. Rikastetuista peptidisekvensseistä voidaan myöhemmin koota multiepitooppiproteiini, jota voidaan käyttää diagnosoimaan dengue-viruksen tunnistavia vasta-aineita potilaan verestä. Asiasanat: Dengue-virus, faaginäyttö, diagnostiikka

12 α 1 β 1 -integriinin aktivaatio Henri Niskanen Ohjaajat: FT Johanna Jokinen, FM Matti Lahti, dos. Jarmo Käpylä ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Integriinit ovat monisoluisille eliöille keskeisiä reseptoreja, jotka muodostavat solukalvolla dimeerin α- ja β-alayksiköistä. Näillä solut tarttuvat erilaisiin solunulkoisiin ligandeihin kuten soluväliaineeseen. Integriinit säätelevät solujen proliferaatiota, adheesiota, leviämistä ja erilaistumista kaksisuuntaisen signalointikykynsä avulla. Ne voivat aktivoitua sekä ligandiin sitoutuessaan että solunsisäisen signaloinnin kautta. Erikoistyössä keskityttiin kollageenireseptoreihin kuuluvan α 1 β 1 -integriinin konformaation säätelyn ja toiminnan väliseen yhteyteen. Kollageenireseptoreilla on merkittävä rooli esimerkiksi syövissä, valtimotukoksissa ja tulehdusreaktioissa. α 1 -integriinin ligandia sitovan osan, α 1 I-domeenin, konformaation muutoksella voidaan vaikuttaa sen sitoutumiskykyyn. E317A mutaation on havaittu aktivoivan α 1 -integriini I-domeenitasolla. E335A mutaation puolestaan oletetaan estävän vuorovaikutus integriinin α- ja β-alayksiköiden solunulkoisten osien välillä ja pitävän integriini inaktiivisessa konformaatiossa. Työn tarkoituksena oli selvittää näiden kohdennettujen mutaatioiden vaikutuksia α 1 -integriinin toimintaan solutasolla. α 1 -integriiniä koodaavaan cdna:han tehtiin QuikChangemenetelmällä mutaatiot E317A, E335A sekä kaksoismutaatio E317A/E335A. CHO-soluista luotiin α 1 -integriinejä yliekspressoivat solulinjat. Toiminnallisissa kokeissa selvitettiin solulinjojen kykyä sitoutua ja levitä eri kollageenityypeillä. Leviämiskokeita tehtiin xcelligence-laitteistolla sekä kuvaamalla soluja faasikontrasti- ja konfokaalimikroskoopeilla. Mutaatioiden vaikutuksia eri signalointireitteihin, kuten p38:n ja ERK:n fosforylaatioon, selvitettiin Western blot-analyyseillä. Kokeissa havaittiin, että solujen leviäminen tyypin I ja IV kollageeneilla lisääntyi, kun α 1 -integriinin I-domeenirakenne aktivoitiin. Inaktivoiva E335A mutaatio puolestaan esti solujen tarttumisen ja leviämisen. E317A/E335A-solut kykenivät tarttumaan ja leviämään tyypin IV kollageenilla, mutta niiden leviäminen oli osittain estynyt. Parhaillaan selvitetään, miten integriinin erilaiset konformaatiot vaikuttavat solunsisäisiin signalointireitteihin. Asiasanat: α 1 β 1 -integriini, rakennebiologia, integriinivälitteinen signalointi

13 Erään solukalvon pyrofosfataasin toiminnan tutkiminen Tiina Pettersson Ohjaajat: FM Heidi Luoto, prof. Reijo Lahti BIOKEMIA Solukalvon pyrofosfataaseja (PPaasi) on löydetty kasveilta, bakteereilta, arkkibakteereilta ja alkueläimiltä. Ne ovat kooltaan noin aminohappoa ja muodostuvat yhdestä polypeptidiketjusta, joka läpäisee solukalvon kertaa. Membraanin läpäiseviä α-kierteitä yhdistävät evoluutiossa hyvin samanlaisina pysyneet silmukat. Solukalvon PPaasien kolmiulotteista rakennetta ei tunneta. Nämä entsyymit toimivat dimeereinä ja pilkkovat epäorgaanista pyrofosfaattia (PP i ) fosfaattitähteiksi (P i ). Tästä vapautuu energiaa, jonka solukalvon PPaasit käyttävät H + - tai Na + -ionien siirtoon kalvon puolelta toiselle. H + -PPaasit jaetaan kahteen pääluokkaan K + -ionin tarpeen perusteella. Kaikki solukalvon PPaasit tarvitsevat toimiakseen Mg 2+ -ioneja. Fylogeneettisen analyysin perusteella valittiin tietynlaisia solukalvon PPaaseja tutkimuksen kohteeksi. Yhden PPaasin kahteen evoluutiossa konservoituneeseen aminohappoon tehtiin muutoksia paikkaspesifisellä mutageneesillä. Sekä mutantti- että villityypin proteiineja tuotettiin kalvoproteiinien tuottoon sopivassa Escherichia coli -kannassa. Proteiinit eristettiin kalvovesikkeleissä käyttäen ultrasentrifugaatiota sakkaroosigradientilla. Proteiinien tuottuminen varmistettiin Western blot -menetelmän avulla. Mutaatioiden vaikutuksen selvittämiseksi entsyymien toimintoja tutkittiin entsyymikineettisin menetelmin eri olosuhteissa. H + -ionin siirto on tarkoitus selvittää fluoresoivan väriaineen avulla ja Na + -ionin pumppaus 22 Na + -isotoopin avulla. Western blot -menetelmän avulla havaittiin, että kaikki tuotetut mutantit olivat ilmentyneet E. colissa. Osa mutaatioista, mukaan lukien C-terminaalisen histidiinihännän lisäys, inaktivoi entsyymin. Kaikkia mutantteja ei ole vielä tuotettu. Tarkoituksena on selvittää ioninsiirron spesifisyyteen vaikuttavat tekijät. Lisäksi aiotaan selvittää olosuhteet, joissa solukalvon PPaasi toimii bakteerissa. Asiasanat: solukalvon pyrofosfataasi, H + -pyrofosfataasi, Na + -pyrofosfataasi, ioninsiirron spesifisyys

14 Europium-ionin kehitysliuos LED-pohjaista mittalaitetta varten Eeva-Maija Puputti Ohjaajat: FM Timo Valta ja prof. Tero Soukka BIOTEKNIIKKA DI Lantanidi-ioneista etenkin europiumia käytetään leimana immunomäärityksissä, koska sen fluoresenssilla on pitkä elinikä, kapea emissiopiikki ja suuri Stokesin siirtymä. Perinteisten lantanidikelaattien ongelma on se, että niiden virittämiseen tarvitaan korkeaenergistä UV-valoa, joka tuotetaan yleensä xenonvälähdyslampuilla, jotka ovat kookkaita ja kalliita. Valoa emittoivat diodit (LED) ovat pieniä ja edullisia, mutta niillä ei toistaiseksi voida tuottaa tehokkaasti korkeaenergistä UV-valoa. Jotta lähellä näkyvää valoa emittoivia UV-LED:jä voitaisiin käyttää viritysvalolähteinä, täytyy lantanidikelaatit virittää yli 350 nm:n, mielellään jopa 400 nm:n aallonpituudella. Lantanidikelaattien viritysmaksimin aallonpituuteen voidaan vaikuttaa kelatoivan ligandin viritysvaloa absorboivalla rakenteella. Diplomi-insinöörityön tavoitteena oli kehittää kehitysliuos, jonka avulla europiumia voitaisiin virittää lähellä näkyvän valon aallonpituuksia käyttäen LED:ä, joka emittoi 365 nm:ssä. Tutkittujen ligandien viritysspektrit ja eliniät selvitettiin ja kehitysliuoksen komponenttien pitoisuudet optimoitiin fluoresenssin intensiteetin maksimoimiseksi. Tuloksia verrattiin kaupalliseen kehitysliuokseen, jonka viritysspektrin huippu sijaitsee 340 nm:ssä. Fluoresenssin intensiteettiä pyrittiin parantamaan tehostetun fluoresenssin avulla käyttäen avustavina ioneina gadoliniumia tai yttriumia. Lisäksi tavoitteena oli tutkia erilaisten optisten komponenttien ja suunnitteluratkaisujen vaikutusta pienikokoisen aikaerotteisen fluorometrin suorituskykyyn. Eri ligandeja sisältävät europiumkelaattien kehitysliuokset viritettiin 365 nm:ssä ja intensiteettejä verrattiin kaupalliseen kehitysliuokseen. Ligandin 1-(4'- morfolinyylifenyyli)-4,4-difluoro-5,5,5-trifluoro-pentaani-1,3-dioni viritysspektrin huippu sijaitsi 350 nm:ssä ja sen fluoresenssin suhteellinen intensiteetti oli 120 %. Ligandilla 9-etyyli-3,6-bis(5',5',5'-trifluoro-4',4'-difluoro-1',3'- dioksopentyyli)karbatsoli havaittiin huiput sekä 330 nm:ssä että 380 nm:ssä ja sen fluoresenssin suhteellinen intensiteetti oli 210 % ja tehostetun fluoresenssin avulla intensiteetti parani entisestään 470 %:iin. Työn tuloksena saatiin intensiteetiltään voimakas 365 nm:ssä virittyvä kehitysliuos, joka soveltunee käytettäväksi LED-pohjaisessa mittalaitteessa. Asiasanat: aika-erotteinen fluoresenssi, kehitysliuos, LED, tehostettu fluoresenssi

15 Kuivattujen immunoreagenssien kehitys ja optimointi automatisoituun hengitystieinfektio-pikatestijärjestelmään Risto-Matti Ruonamo Ohjaaja: FT Janne Koskinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA -DIAGNOSTIIKKA Työn tarkoituksena oli kehittää ja optimoida bioaffiniteettireagenssien kuivausmenetelmä automatisoituun hengitystieinfektioiden pikatestijärjestelmään (maripoc ). Testin tavoitteena on mahdollisimman nopea ja herkkä patogeenispesifinen diagnoosi. Testijärjestelmä perustuu erotusvapaaseen ArcDia TM TPX immunomääritystekniikkaan ja se toimii ns. random-access - periaatteella. Kuivatut reagenssit mahdollistavat selvästi liuosreagensseja yksinkertaisemman määritysprotokollan, reagenssilogistiikan ja instrumentoinnin. Työssä perehdyttiin biomolekyylien kuivauksessa käytettyihin suoja-aineisiin. Suoja-aineina käytetään usein hiilihydraatteja, esimerkiksi disakkarideja. Lisäksi biomolekyylien säilyvyyttä parantamaan voidaan käyttää esimerkiksi antioksidantteja, aminohappoja ja mikrobien kasvunestoaineita. Myös tuotantomenetelmät, kuten kuivausolosuhteet, jäännöskosteus ja pakkauksen toteutus on tärkeää optimoida. Työssä tutkittiin eri suoja-aineiden vaikutusta ensin immunoreaktioon ja seuraavassa vaiheessa immunoreagenssien kuivatuskestävyyteen sekä säilyvyyteen. Potentiaalisten suoja-aineiden ei havaittu tutkituilla pitoisuuksilla vaikuttavan immunoreaktioon. Suoja-aineista kuivaus- ja säilyvyyskokeisiin valittiin trehaloosi, sorbitoli ja glyseroli. Pikatestijärjestelmän immunoreagenssit saatiin säilymään säilytyspakkauksessa +4 o C:n lämpötilassa yli kuusi kuukautta. Alustavien kokeiden perusteella on todennäköistä, että reagenssit säilyvät myös huoneenlämpötilassa yli puoli vuotta. Reagenssitestilevyn osoitettiin lisäksi olevan stabiili analysaattorissa riittävän pitkään (yli 2 viikkoa). Tulokset ovat hyvin linjassa kirjallisuuden kanssa, jossa on havaittu disakkaridien ja erityisesti trehaloosin suojaavan kuivattavia proteiineja. Lisäämällä pienen määrän sorbitolia tai glyserolia on mahdollista vielä entisestään parantaa säilyvyyttä. Työssä kehitettyä metodologiaa voidaan käyttää jatkossa uusien testien sekä kuivattujen antigeenikontrollien kehityksessä. Asiasanat: kuivatut reagenssit, POC-diagnostiikka, hengitystieinfektiot

16 Maantieteellisen sijainnin, lajikkeen ja ympäristötekijöiden vaikutukset mustaherukan fenolisiin yhdisteisiin ja niiden pitoisuuksiin Ville Ruusunen FM Jie Zheng, FM Oskar Laaksonen, FT Baoru Yang ja FT Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Mustaherukan (Ribes nigrum L.) marjat sisältävät runsaasti fenolisia yhdisteitä. Nämä yhdisteet ovat viimeaikoina olleet lisääntyvän kiinnostuksen kohteena johtuen niiden monista mahdollista terveysvaikutuksista. Fenolisten yhdisteiden tärkein terveyttä edistävä ominaisuus on niiden kyky toimia ihmiselimistössä antioksidantteina. Fenolisista yhdisteistä tutkituimpia ovat fenoliset hapot, flavonoidit sekä antosyaanit. Yhdisteet ovat kasvien sekundaari metaboliitteja ja vaikuttavat kasvien kasvuun, sekä kehitykseen. Lisäksi ne ovat tärkeässä osassa puolustautuessa ympäristön aiheuttamia stressitekijöitä vastaan. Suomi sijaitsee kaukana pohjoisilla leveyspiireillä ja täällä ympäristö olosuhteet ovat hyvin erilaiset verrattuna alempiin leveyspiireihin. Varsinkin lapissa kasvukausi on lyhyt, mutta päivät pitkiä. Kesällä aurinko ei laske jopa kahteen kuukauteen, mikä altistaa kasvin jatkuvalle UV-säteilylle. Työssä tutkitaan kolmen eri mustaherukka lajikkeen marjoja. Näytteissä olevat fenoliset yhdisteet (fenoliset hapot, flavonoidit ja antosyaanit) havaitaan ja niiden määrät lasketaan käyttämällä preparatiivista HPLC laitteistoa, sillä vastaavalla laiteistolla oli jo aiemmin tunnistettu tutkimamme yhdisteet. Marjoja on 6 vuoden ajalta ( ), kahdesta eri paikasta (Piikkiö ja Apukka), 3 eri lajiketta (Mortti, Ola ja Melalahti) ja näytteitä on otettu kolmesta eri pensaasta lajiketta kohti. Näytettä valmistettaessa marjat murskataan, antosyaanit uutetaan metanolilla toiseen näytteeseen ja flavonoidit sekä fenoliset hapot etyyliasetaatilla toiseen näytteeseen. Tilastollisella analyysillä havaitaan lajikkeen, leveyspiirin ja ympäristö olosuhteiden vaikutus fenolisten yhdisteiden pitoisuuksiin. Tutkimuksen tarkoituksena on tutkia leveyspiirin, ympäristötekijöiden (lämpötila, päivän pituus, UV-säteily ja sademäärä) sekä lajikkeen vaikutusta Suomessa kasvavien mustaherukoiden fenolisten yhdisteiden pitoisuuksiin. Oletetaan että pohjoisen erityisolosuhteet aiheuttavat mustaherukalle stressiä, minkä johdosta marjojen fenolisten yhdisteiden pitoisuudet olisivat korkeampia verrattuna etelä-suomessa kasvavien pensaiden marjoihin. Tutkimuksessa selvitetään myös näyttääkö lajikkeella olevan vaikutusta fenolisten yhdisteiden metaboliaan ja sen riippuvuuteen ympäristötekijöistä. Asiasanat: mustaherukka, fenoliset hapot, antosyaanit ja flavonoidit

17 Sitojavasta-aineen eri muotojen vertailu Eu(III)-nanopartikkeleihin perustuvassa sydänspesifisen troponiini I:n immunomäärityksessä Suvi Saari Ohjaajat: FM Marja-Leena Järvenpää, FM Noora Ristiniemi ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Sydänkohtaus eli äkillisestä sydämen hapenpuutteesta johtuva sydänlihaksen kuolio on yksi maailman yleisimmistä kuolinsyistä. Nopea ja oikea diagnoosi ovat potilaan välittömän hoidon ja ennusteen kannalta hyvin tärkeitä. Diagnoosin tekemiseen käytetään muun muassa kuolleista sydänlihaksen soluista vapautuneita proteiineja, joista tärkeimpiä ovat sydänspesifiset troponiinit I (ctni) ja T. Työssä verrattiin sitojavasta-aineen eri muotoja Eu(III)- nanopartikkeleihin perustuvassa heterogeenisessä, ei-kilpailevassa ctniimmunomäärityksessä. Työn tavoitteena oli parantaa määrityksen herkkyyttä vähentämällä nanopartikkelien epäspesifistä sitoutumista sitojapintaan. Määrityksessä kahdella eri sitojavasta-aineella pinnoitettuun kaivoon lisättiin näyte, jonka sisältämä ctni tunnistettiin Eu(III)-nanopartikkeliin kovalenttisesti kiinnitetyn jäljittäjävasta-aineen avulla. Pesuvaiheen jälkeen partikkelien aikaerotteinen fluoresenssi mitattiin. Toisena sitojavasta-aineena oli ctni:n keskiosan tunnistava vasta-aine ja toisena ctni:n N-terminaaliseen päähän sitoutuvan monoklonaalisen vasta-aineen lisäksi sen eri muodot: proteolyyttisesti pilkottu antigeeniä sitova fragmentti 2 (engl. fragment antigen binding 2, F(ab ) 2 ), laitoksella aiemmin yhdistelmä-dna-tekniikalla tuotettu antigeeniä sitova fragmentti (engl. fragment antigen binding, Fab) ja kimeerinen Fab (kfab), jossa hiiren vasta-aineen vakioiset alueet oli korvattu ihmisen vasta-aineen vastaavilla alueilla. Leimapartikkelien epäspesifinen sitoutuminen kasvoi kaikilla vertailluilla sitojavasta-ainemuodoilla kun vasta-aineen pitoisuutta nostettiin. Taustasignaalin taso oli riippuvainen käytetystä plasmanäytteestä. Kun eri sitojavastaainemuotojen käytettäviä pitoisuuksia määrityksessä verrattiin, havaittiin että 3-20 kertaa pienempi pitoisuus kfab:ia riitti tuottamaan saman signaalitason ja analyyttisen herkkyyden muihin muotoihin verrattuna. Pienempi pitoisuus myös laski plasmanäytteen epäspesifisestä sitoutumisesta aiheutuvaa taustasignaalia. Työn pohjalta ctni-määrityksessä valittiin jatkossa käytettäväksi sitojavastaaineen kfab-muoto. Asiasanat: sydänspesifinen troponiini I, nanopartikkelit, vasta-aine

18 Tyrnimarjojen (Hippophaë rhamnoides L.) sokereiden etyyli-β-d-glukosidin ja (-)-2-O-metyyli-L-chiro-inositolin (L-kvebrakitolin) kvantitointi suorasyöttömassaspektrometrialla ilman kromatografiaa Marianne Salonen Ohjaajat: FT Jukka-Pekka Suomela, FT Baoru Yang ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Tyrnimarjoista on viime aikoina tunnistettu yhdisteet β-d-glukopyranosidi ja (-)- 2-O-metyyli-L-chiro-inositoli (L-kvebrakitoli). Metyyli-inositoli vaikuttaa mahdollisesti kasvin osmoottiseen paineeseen ja kylmänkestävyyteen. Mainituilla yhdisteillä saattaa olla hyödyllinen vaikutus myös ihmiselle. Etyyli-β- D-glukosidin ja metyyli-inositolin pitoisuus vaihtelee tyrnin alalajin mukaan. Tyrnin sokereita on perinteisesti analysoitu erottamalla sokerit kromatografisesti. Työn tavoitteena oli kehittää ja optimoida suorasyöttömassaspektrometriaan perustuva pikamenetelmä etyyli-β-d-glukosidin ja L-kvebrakitolin kvantitoimiseksi mahdollisimman monen eri tyrnilajikkeen mehusta. Ensin analysoitiin kyseisten yhdisteiden puhtaita vertailunäytteitä sähkösumutusionisaatio-ms:lla (ESI-MS) sekä tandem-ms:lla (MS/MS). Vertailuäyte injektoitiin ESI-lähteeseen ruiskupumpulla ja selvitettiin näytteelle tyypilliset ionit. Haluttujen signaalien vahvistamiseksi optimoitiin MS- sekä MS/MS-parametrit. Kokeiltiin myös, miten MS- tai MS/MS-parametrejä pitää muuttaa, jos näyte injektoidaan ESI-lähteeseen saapuvaan liuotinvirtaan. Liuotinvirtana käytettiin metanoli vettä (1:1), johon myös vertailunäytteet liuotettiin ja jolla laimennettiin analysoitavia tyrnimehunäytteitä. Vertailuyhdisteiden avulla luotiin standardisuora, jolla vastaavien yhdisteiden pitoisuus määritettiin mehunäytteestä. Saatua tulosta verrattiin kaasukromatografialla saatuun tulokseen. Etyyli-β-D-glukosidille tyypillisen ionin signaali vahvistui lisäämällä näytteeseen 0,1 % natriumkloridia ja etyyli-β-d-glukosidin vertailunäytteen vahvistuneen ionin avulla oli mahdollista luoda lineaarinen standardisuora toistettavasti ja uusittavasti MS-menetelmällä ruiskupumpun kautta. L-kvebrakitoli kvantitoitiin samalla periaatteella MS/MS-menetelmällä, mutta menetelmän uusittavuuden selvitys on kesken. MS-menetelmällä saatu eri lajikkeiden mehunäytteen etyyliβ-d-glukosidipitoisuus vastasi melko hyvin kaasukromatografialla saatua tulosta. Liuotinvirtamenetelmää varten erittäin etyyli-β-d-glukosidipitoista näytettä tulisi laimentaa hyvin paljon, mutta menetelmän lineaarisuus oli parempi kuin ruiskupumppumenetelmän. Asiasanat: etyyli-β-d-glukosidi, Hippophaë rhamnoides L., L-kvebrakitoli, massaspektrometria, tyrni

19 Sitrullinaation vaikutus TGFβ:n toimintaan Kalle Sipilä Ohjaajat: dos. Jarmo Käpylä, prof. Hannu Larjava, prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Sitrullinaatio on proteiinien translaation jälkeinen modifikaatio, jossa arginiiniaminohappotähde on muuttunut sitrulliinitähteeksi. Reaktiota katalysoivat peptidyyliarginiinideiminaasit (PAD). Autoimmuunivaste sitrullinoituja proteiineja vastaan on keskeisessä osassa nivelreuman patogeneesissä ja PADentsyymit ovat yliekspressoituneita myös karsinoomissa. Transformoiva kasvutekijä beta (TGFβ) on yksi keskeisimmistä kasvutekijöistä tulehduksen säätelyssä, yksilönkehityksessä sekä syövässä. Aktivoidessaan TGFβ 1 :n integriinit tarttuvat pienen latentin kompleksin muodostavan β 1 -LAP:n RGDmotiiveihin ja arginiini on tärkeä aminohappo myös aktiivisen TGFβ 1 :n sitoutuessa reseptoriinsa. Erikoistyön tarkoituksena oli tutkia, miten aktiivisen ja latentin TGFβ 1 :n arginiinien sitrullinoituminen vaikuttaa sen toimintaan. Sitrullinoimme PAD-entsyymillä in vitro aktiivista ja latenttia TGFβ 1 sekä β 1 - LAP-peptidiä. Selvitimme sitrullinaation vaikutusta TGFβ 1 :n signalointiin, latenttiin kompleksiin ja sitoutumiseen reseptoriinsa. Tutkimuksissa käytimme reporttisolutekniikoita, Western blot menetelmää, ELISA:a sekä Biacorea. β 1 - LAP-peptidiä tuotimme rekombinantisti E. colissa ja puhdistimme sen His-tagkromatografialla ja uudelleenlaskostamalla. Solujen integriini α v β 6 välitteistä tarttumista ja leviämistä sitrullinoituun β 1 -LAP:iin tutkimme villityypin hiiren ja integriini β 6 -knock-out hiiren keratinosyyttien sekä HaCat-solujen avulla käyttäen WST1-adheesiokoetta sekä xcelligence-laitetta. Olemme osoittaneet, että sitrullinaation seurauksena latentin TGFβ 1 :n integriini α v β 6 välitteinen aktivaatio estyy. Lisäksi aktiivisen TGFβ 1 :n sitrullinoituminen estää sen sitoutumisen TGFβRII:een, eikä latenttikompleksi suojaa aktiivista TGFβ 1 :a sitrullinoitumiselta. Toisaalta β 1 -LAP näyttää sitrullinoituessaan menettävän kykynsä muodostaa latenttia kompleksia, mikä voisi itsessään aktivoida latentin TGFβ 1 :n. Tulokset viittavaat siihen, että sitrullinaatio estää TGFβ 1 :n toiminnan, mikä saattaa johtaa esim. nivelreumassa tulehduksen voimistumiseen. Asiasanat: TGFβ, sitrullinaatio, PAD-entsyymi, integriini α v β 6

20 Kelaattikomplementaatio nukleiinihappodiagnostiikan monianalyyttimäärityksessä Minna Soikkeli Ohjaajat: FM Ulla Karhunen ja prof. Tero Soukka MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Verenmyrkytys on vaarallinen yleisinfektio, jossa verenkiertoon on päässyt jokin patogeeni. Maailmanlaajuisesti uusia verenmyrkytystapauksia ilmenee lähes 2 miljoonaa joka vuosi, ja nykypäivän diagnostiikasta huolimatta vakavaan verenmyrkytykseen menehtyy päivittäin arviolta 1400 ihmistä. Toipumisen edellytyksenä on taudinaiheuttajan nopea tunnistaminen ja oikean antibioottilääkityksen aloittaminen. Mahdollisten taudinaiheuttajien suuri määrä vaikeuttaa antibioottien valintaa, ja tehottomien antibioottien käyttö puolestaan johtaa antibioottiresistenttien bakteerikantojen syntyyn. Nykyisin verenmyrkytysdiagnostiikassa patogeenin tunnistus perustuu veriviljelyyn, jolla taudinaiheuttajan selvittäminen voi kuitenkin kestää jopa useita vuorokausia. Tämän työn tavoitteena oli rakentaa homogeeninen mallimääritys, jolla useampi bakteerigeeni havaittaisiin saman reaktioastian pohjalta. Työssä hyödynnettiin hiljattain kehitettyä kelaattikomplementaatiotekniikkaa, jossa spesifistä fluoresenssia havaitaan vain, mikäli Eu 3+ -ioninkantajakelaattiin konjugoitu oligonukleotidikoetin ja valoa absorboivaan ligandiin kiinnitetty koetin hybridisoituvat vierekkäin komplementaariseen kohde-dna:han. Reaktioastiaan eli streptavidiinilla päällystettyyn mikrotiitterikaivoon printattiin neljään kohtaan neljälle eri kohde-dna:lle komplementaariset 5 -päästään biotinyloidut ja 3 -päästään ioninkantajakelaattiin konjugoidut koettimet Flexyskontaktiprintterillä (Genomic Solutions, USA). Reaktioastiaan lisättiin neljänlaisia 5'-päästään ligandiin konjugoituja koettimia sekä yhtä tai useampaa synteettistä kohdesekvenssiä sisältävä liuos. Lopuksi Eu 3+ :n fluoresenssi mitattiin kaivosta aikaerotteisesti mittauspisteen alueelta. Mittauspisteiden välimatka oli 0,5 mm. Kun kaivossa oli kaikkia neljää kohde-dna:ta, havaittiin neljä erillistä luminoivaa aluetta kaivon niissä kohdissa, joihin biotinyloidut koettimet oli printattu. Kelaattikomplementaatiolla saavutetut signaali tausta-suhteet olivat näillä alueilla suuruudeltaan 30 90, mikä osoittaa kelaattikomplementaation toimivan hyvin kvalitatiivisessa monianalyyttimäärityksessä. Jatkossa tällainen määritys olisi mahdollisesti sovellettavissa esimerkiksi nopean verenmyrkytysdiagnostiikan tarpeisiin. Asiasanat: verenmyrkytys, kelaattikomplementaatio, monianalyyttimääritys