Immunologinen diagnostiikka Immunologinen diagnostiikka - infektioserologia: bakteerit (parasiitit, sienet) Hanna Jarva LT, Kliininen opettaja Haartman-instituutti Bakteriologian ja immunologian osasto ja HUSLAB, Immunologian yksikkö 27.8.2014 - autoimmuunitautien diagnostiikka - immuunipuutosten diagnostiikka Infektioserologia bakteerivasta-aineiden määritys virusvasta-aineiden määritys kuuluu virusdiagnostiikkaan serologisia tutkimuksia tarvitaan kun - viljelynäytettä on vaikea saada esim. Helikobakteeri - mikrobi on vaikeasti viljeltävissä esim. Borrelia, Treponema, Legionella - on kyse jälkitaudista/komplikaatiosta esim. reaktiivinen artriitti, post-streptokokkaali glomerulonefriitti (PSGN) Infektioserologian yleisimmät menetelmät ELISA-tutkimus - seerumin vasta-aineiden reaktio puhdistetun/rekombinantin bakteeriantigeenin tai bakteerilysaatin kanssa - esim. borrelia-, hinkuyskä-, helikobakteeri- ja salmonellavasta-aineet immunofluoresenssitutkimus - vasta-aineiden reaktio lasille kiinnitettyjen bakteereiden kanssa - esim. treponema-vasta-aineet (FTA-abs), legionella-vasta-aineet agglutinaatio - vasta-aineiden sakkausreaktio bakteerikannan kanssa - sopii erityisesti akuutin vaiheen diagnostiikkaan - esim. francisella-va (tularemia), salmonella- ja yersinia-vasta-aineet Pariseerumit infektioserologiassa parinäytteet ovat usein hyödyllisiä vasta-ainetason nousun/laskun arviointi milloin? infektion akuutissa vaiheessa 1-2 viikon välein kroonisemmassa vaiheessa 1-3 kk:n välein infektion paranemisen seurannassa kontrollinäytteitä ei kannata ottaa liian tiheästi - esim. helikobakteeri-infektion seurannassa kontrolliseerumi otetaan 5-6 kk hoidon päättymisen jälkeen Yleisimmät infektioserologian tutkimukset ASTA (antistafylolysiini) stafylokokki-infektion epäily AST (antistreptolysiini) streptokokki-infektion epäily (erit. jälkitaudit) Bordetella-va serologia tärkeä diagnostinen menetelmä Borrelia-va serologia tärkein diagnostinen menetelmä kuppatestit serologia tärkein diagnostinen menetelmä Helikobakteeri-va serologia tärkeä diagnostinen menetelmä tetanus-va rokotusvaste, rokotustarve difteria-va kampylobakteeri-va reaktiivinen artriitti, vatsaoireet, salmonella-va epämääräinen lämpöily yersinia-va 1
Hinkuyskädiagnostiikka (Bordetella pertussis) Borrelian laboratoriodiagnostiikka vasta-aineet ja PCR alkuvaiheessa viljely ja/tai PCR nenänielunäytteestä pitempään kestäneessä taudissa vasta-ainemääritys - PCR likvorista tai nivelnesteestä - vasta-ainemääritys, perustutkimuksena S-BorrAb IgG-, IgA- ja IgM-vasta-aineet rokotusvaste vaikeuttaa serologista diagnostiikkaa parinäytteet usein tarpeen Borreliadiagnostiikka 2 S-BorrAb menetelmät vaihtelevat laboratorioiden välillä yleisimmin ELISA-menetelmä puhdistettu tai kokobakteeriantigeeni lievästi koholla = epävarma epäspesifinen reaktio? tuore infektio? vanhaa immuniteettia? >> II-näyte 3-4 viikon kuluttua selvästi koholla = positiivinen tuore infektio? vanhaa immuniteettia? >> tarvittaessa II-näyte 1-2 kk:n kuluttua Borreliadiagnostiikka 3 Borrelia-jatkotutkimus (S-BorrAbJt) - eri asia kuin II-näyte! - jatkotutkimuksella (immunoblottaus) pyritään selvittämään ovatko havaitut vasta-aineet borreliaspesifisiä - käytetään toistetusti epävarman perustutkimuksen jatkotutkimuksena - jatkotutkimuksella ei voida määrittää infektion ajankohtaa - kerran positiivisen jatkotutkimuksen uusimisista ei ole yleensä hyötyä Borreliadiagnostiikka 3 Borreliadiagnostiikka 4 Keskushermoston borrelioosi - Likvorin borreliavasta-aineet (Li-BorrAb) ja samana päivänä otettu seeruminäyte vertailuun - Likvorin vasta-aineille lasketaan indeksi, jonka avulla voidaan päätellä onko kyseessä intratekaalinen vasta-ainetuotanto Muista: - borrelia-vasta-aineet eivät noudata IgM-tuore, IgG-vanha -sääntöä - borrelia-vasta-aineita ei kannata määrittää oireettomalta - EM-vaiheessa diagnoosi on kliininen - infektion alkuvaiheessa annettu ab-hoito voi vaikuttaa vasta-aineiden muodostumiseen - borrelia-vasta-ainetasoja ei kannata seurata hoidon jälkeen - likvornäytteelle seeruminäyte vertailuun 2
Syfilisdiagnostiikka - viljelyä tai PCR:ää ei ole rutiinikäytössä - ns. spesifiset testit Trpa (Treponema pallidum -vasta-aineet) TPHA (Treponema pallidum -hemagglutinaatio) FTA (Fluorescent Treponema antibodies) - epäspesifinen testi kardiolipiini (KardAb) Syfilisdiagnostiikka 2 - positiivinen Trpa: labra varmistaa toisella spesifisellä testillä (yleensä TPHA) - 2 positiivista testiä: potilas on saanut syfilistartunnan äskettäin tai aiemmin - tartunnan ajankohdan määrittämiseksi: kardiolipiinivasta-aineet (KardAb) - KardAb selvästi koholla > tuore tartunta - KardAb matala > aiemmin hankittu tartunta (ei välttämättä hoidettu) - seulontaan Trpa-vasta-aineet (TrpaAb) (myös äitiysseulassa) Syfilisdiagnostiikka 3 Syfilisdiagnostiikka 4 - Trpa-vasta-aineet nousevat ensimmäisinä - jos Trpa koholla ja muut negatiivisia > aivan tuore tartunta? > II-näyte! - II-näytteenä pyydä KardAb, TPHA ja myös Trpa mikäli alunperin matala positiivinen (< 10 indeksi, viitearvo <0.9) - jos kuukauden kuluttua I-näytteestä muut vasta-aineet negatiivisia, - tartunnan jälkeen seurannassa käytetään kardiolipiiinivasta-aineita - kerran sairastettu syfilis: Trpa, TPHA ja FTA pysyvät positiivisina kardiolipiini laskee (ja nousee uudestaan reinfektiossa) - jos todetaan aiemmin hankittu tartunta, varmista että potilas on saanut adekvaatin hoidon! kyseessä on epäspesifinen löydös Syfilisdiagnostiikka 5 Helikobakteeri-diagnostiikka - positiivinen syfilis-löydös (tuore tai vanha infektio): laboratoriolla ja hoitavalla lääkärillä on ilmoitusvelvollisuus (yleisvaarallinen tartuntatauti) - muista tartunnanjäljitys - taudin luonteen ja diagnostiikan sudenkuoppien takia noudata labran antamia ohjeita, ota tarvittaessa kontrollinäytteet ja herkästi konsultoi! vasta-aineet, ulosteen antigeeninosoitus, hengitystesti, viljely yleisimmin seulontakäytössä vasta-aineet ja F-antigeeni vasta-ainemääritys vähintään IgG IgA:lla vähemmän merkitystä pelkkä IgA-vasta-aineiden määritys ei riitä! 3
Helikobakteeri-diagnostiikka 2 Helikobakteeri-diagnostiikka 3 vasta-aineet laskevat hitaasti onnistuneen hoidon jälkeen vasta-ainekontrolli kannattaa ottaa vasta 5-6 kk häätöhoidon jälkeen vasta-aineet voivat jäädä hieman koholle vuosiksi onnistuneen hoidon jälkeen jos aikuisella matala vasta-ainetaso aktiivi infektio? aiemmin sairastetun infektion serologinen arpi? > varmistus jollain muulla testillä seulontaan joko F-antigeeni (F-HepyAg) tai vasta-aineet (S-HepyAb) hoidon jälkeiseen kontrolliin joko F-ag tai vasta-aineet mutta - vasta-ainekontrolli aikaisintaan 5-6 kk häätöhoidon jälkeen - jos ennen hoitoa ei ole otettu vasta-ainenäytettä, ei serologiaa voida käyttää seurantaan - eri laboratorioiden tulokset eivät ole suoraan vertailukelpoisia Helikobakteeri-diagnostiikka 4 Esimerkki: F-ag positiivinen > hoidetaan Vasta-ainemääritys 6 kk:n kuluttua: IgG 120 (<20), IgA 60 (<20) Tulkinta mikä on lähtötaso? jos lähtötaso IgG 640, niin merkitsevä lasku jos lähtötaso IgG 300, laskusuunta, ei varmuudella merkitsevä jos lähtötaso IgG 150, vasta-aineet ennallaan, infektio jatkuu Eli ilman 0-näytettä ei serologian avulla voida aina arvioida infektion paranemista Tetanus- ja difteria-vasta-ainemääritykset tetanus-vasta-aineet ClteAb (Clostridium tetani) difteria-vasta-aineet CodiAb (Corynebacterium diphtheriae) molempia käytetään 1) rokotustarpeen arviointiin molemmissa viitearvona 0.1 SPU/ml 2) immuunipuutostutkimuksissa T- ja B-soluvasteen arviointiin eli O-näyte, sitten rokotus kuukauden kuluttua kontrollinäyte onko nousua? Salmonella, Yersinia ja Kampylobakteeri serologiaa käytetään jälkitautien diagnostiikassa ja myös epäselvän kuumeilun selvittelyssä ristireaktiot haittaavat serologiaa yksittäinen IgM-positiivisuus harvoin merkitsevä vasta-aineet säilyvät koholla vuosia tarvittaessa II-näyte akuutissa infektiossa n. 2 viikon kuluttua kroonisemmassa tilanteessa esim. 1-2 kk:n kuluttua Salmonella ja yersinia agglutinaatio (SalmAb, YersAb) erityisesti akuuttivaiheessa positiivinen ei erottele IgM-, IgG- tai IgA-vasta-aineita ELISA-määritys (SalmEIA, YersAbLa) reagoi hitaammin kuin agglutinaatio määrittää erikseen IgM-, IgG- tai IgA-vasta-aineet pelkkä IgM-nousu ei diagnostinen 4
IGRA-testit interferon-gamma release assay käytetään tuberkuloosidiagnostiikassa latentin tubin ja ekstrapulmonaarisen tubin toteamiseen 2 menetelmää käytössä: ELISPOT ja elisa ELISPOT-testi (B-LyTbIFN) potilaan lymfosyyttejä inkuboidaan M. tuberculosis-proteiinien kanssa jos näytteessä on M. tuberculosis-spesifisiä T-soluja, ne aktivoituvat ja tuottavat interferoni-gammaa interferoni-gamma tunnistetaan vasta-aineella ja visualisoidaan spotteina herkkä, luotettava mutta teknisesti haastava vaatii tuoreen näytteen ELISA-testi (B-TbIFNg) IGRA-testit verinäyte otetaan suoraan erikoisputkiin, joissa on joko M. tuberculosis-peptidejä tai kontrollipeptidejä herkistyneet T-solut stimuloituvat ja erittävät interferoni-gammaa tuotettu interferoni-gamaa mitataan ELISAlla helpompi tehdä kuin ELISPOT, kestää kuljetuksen ei yhtä herkkä kuin ELISPOT mittaavat vain M. tuberculosis-bakteerin muistavia T-lymfosyyttejä säilyvät positiivisena loppuiän - ei siis voi käyttää hoidon seurantaan raja-arvoinen tai heikko positiivinen voi olla epäspesifi reaktio jos potilaalla on lymfopenia, ei tulos ole luotettava Bakteeriserologian yleisiä ongelmia antigeeni usein käytössä antigeeniseos > ristireaktiot menetelmien herkkyys vaihtelee pelkkä IgM-vaste voi merkitä yleistä immunostimulaatiota, Autoimmuunitaudit yleisiä systeemiset vs elinspesifiset diagnoosi perustuu kliiniseen kuvaan ja autovasta-aineiden osoitukseen harvoin yksinään diagnostinen pariseerumit usein tarpeen optimaalinen aika pariseerumeille joskus vaikea ohjeistaa 5
Autoimmuunitautien diagnostiikka autovasta-aineiden osoitus yleisimmät menetelmät immunofluoresenssi ja ELISA menetelmä vaikuttaa - herkkyyteen - spesifisyyteen - viitearvoihin menetelmät täydentävät toisiaan joitain autovasta-aineita käytetään taudin aktiivisuuden seurantaan autovasta-aineet ilmaantuvat usein ennen kliinisen taudin kehittymistä Tulehduksellisten sidekudossairauksien diagnostiikka pvk, CRP, La reumafaktori, ANA sitrulliinipeptidivasta-aineet DNA-va, ANCA, ENA Reumafaktori (Rf) yleensä IgM-luokan vasta-aine IgG:n Fc-osaa vastaan herkkä mutta epäspesifinen on koholla seropositiivisessa nivelreumassa Rf usein koholla myös esim. Sjögrenin syndroomassa ja MCTD:ssä matalia positiivisia todetaan - ohimenevästi infektioiden yhteydessä - reumapotilaiden lähisukulaisilla - täysin oireettomilla Tumavasta-aineet (ANA) vasta-aineet tuman- ja solunsisäisiä rakenteita vastaan ANA ei ole diagnostinen millekään autoimmuunitaudille, mutta se on hyvä epäspesifinen markkeri matalatitterisiä tumavasta-aineita on kaikilla korkea tumavasta-ainetitteri ( > 1000) viittaa sidekudostautiin tutkitaan immunofluoresenssitekniikalla ja värjäytymiskuvio voi antaa viitteen diagnoosista Tumavasta-aineet (ANA) 2 ANA + - sidekudostaudit - autoimmuunit maksasairaudet - maligniteetit - infektiot - täysin terveet mikäli tumavasta-aineita ei todeta, on SLE- tai MCTD-diagnoosi epätodennäköinen (mutta ei poissuljettu!) ENA vasta-aineet tuman liukoisia antigeenejä vastaan (extractable nuclear antigens) jatkotutkimus kun ANA+ tai kun ANA- mutta epäily autoimmuunitaudista vahva käytetään esim. SLE:n, Sjögrenin syndrooman, MCTD:n, systeemisen skleroosin ja polymyosiitin diagnostiikassa DNA-vasta-aineet SLE:n diagnostiikka SLE:n aktiivisuuden seuranta 6
ANCA (neutrofiilien sytoplasma-antigeeni-va) vaskuliitit, glomerulonefriitit. autoimmuunihepatiitit immunofluoresenssimenetelmällä P- ja C-ANCA-vasta-aineet merkittävien P-ANCA-vasta-aineiden spesifisyytenä yleensä myeloperoksidaasi (MPO) merkittävien C-ANCA-vasta-aineiden spesifisyytenä yleensä proteinaasi-3 (Pr3) Sitrulliinipeptidivasta-aineet (CCPAb) nivelreuman diagnostiikka spesifisyys >90% herkkyys 60-80% ilmaantuvat jo ennen nivelreuman puhkeamista MPA, Churg-Strauss: 50-75% P-ANCA/MPO + Wegenerin granulomatoosi (GPA): 80-90% C-ANCA/Pr3 + Elinspesifiset autoimmuunitaudit lähes kaikille tutkimuksia saatavissa Suomessa yleisimpiä elinspesifisten vasta-aineiden tutkimuksia: kilpirauhassairaudet tyreoideamikrosomi-va tyreoglobuliini-va autoimmuunimaksasairaudet sileälihas-va mitokondrio-va LKM-va ihon rakkulasairaudet ihovasta-aineet AIHA (+ systeemiset) Coombs Goodpasturen sdr glomerulustyvikalvo-va fosfolipidivasta-ainesdr (+SLE) kardiolipiini-va (KardAbG) Kilpirauhasvasta-aineet TPOAb ja TyglAb tarvittaessa hypotyreoosin etiologian varmistukseen vasta-aineet koholla lähes kaikilla autoimmuunityreoidiitissa vasta-aineita (matalia) löytyy myös terveiltä vasta-ainetasoja ei voida käyttää seurantaan TSH-reseptorivasta-aineet (TSHRAb) hypertyreoosin diagnostiikkaan ja seurantaan Pemfigus vulgaris ihon autoimmuunitauti epidermikseen tai limakalvon epiteeliin muodostuu velttoja rakkuloita välittömästi tyvisolukerroksen päälle 75%:lla potilaista ensioireet suun alueelta Pemfigoidi ihon autoimmuunitauti rakkulat tyvisolukerroksen ja tyvikalvon väliin Diagnoosi ihovasta-aineiden osoitus PAD Ihovasta-aineet rakkulatautien diagnostiikka seulontana ihovasta-aineet (IhoAb) jos positiivinen, Bp180 ja/tai desmogleiinivasta-aineet pemfigus: ihon väliaine- ja desmogleiini-vasta-aineet positiiviset pemfigoidi: ihon tyvikalvo- ja Bp180-vasta-aineet positiiviset 7
Autoimmuunit maksasairaudet Autoimmuunit maksasairaudet 2 Autoimmuunihepatiitti primaari biliaari kirroosi (PBC) primaari sklerosoiva kolangiitti (PSC) IgG4:ään liittyvä autoimmuunikolangiitti (IAC) Immunologinen diagnostiikka - tumavasta-aineet (ANA) - ANCA-vasta-aineet - kudosvasta-aineet mitokondrio-va sileälihas-va LKM-va (liver-kidney microsomal) - maksablotti (vasta-aineet puhdistettuja antigeeneja kohtaan) Keliakia Keliakia 2 serologia sopii seulontaan ja seurantaan käytössä kudostranglutaminaasi-, endomysium-, gliadiini-, gliadiinipeptidi- ja retikuliini-vasta-aineet perusseulassa IgA-vasta-aineet, joten potilaan IgA-taso täytyy määrittää jos potilaalla IgA-puutos, tutkitaan IgG-luokan vasta-aineet vasta-ainetasoja voidaan käyttää hoitovasteen seurantaan dieettihoidon aikana vasta-ainetasojen pitäisi normaalistua 6-12 kk:n kuluessa hoidon aloittamisesta transglutaminaasivasta-ainemääritys herkkä ja spesifinen seulontatutkimuksissa yleisimmin käytetään transglutaminaasija endomysium-vasta-aineiden määritystä (täydentävät toisiaan) (S-tTGAbA ja S-EndoAbA) gliadiini- ja gliadiinipeptidivasta-aineissa runsaasti epäspesifisiä positiivisia löydöksiä jos potilaalla on kerran todettu IgA-puutos, täytyy seurantanäytteissä pyytää IgG-luokan vasta-aineet Milloin epäillä immuunipuutosta? Primaari vai sekundaarinen immuunipuutos? vakavat primaariset puutokset todetaan usein lapsuusiässä toistuvat (vakavat) infektiot huonosti paranevat infektiot oudot taudinaiheuttajat lapsilla huono kasvu autoimmuunitaudit CVI-taudin keskimääräinen toteamisikä 30-35 v sekundaaristen puutosten tärkeimmät aiheuttajat maligniteetit immunosuppressiivinen tai -modulatorinen hoito HIV munuais- tai maksasairaudet, DM 8
Immuunijärjestelmän osat Immuunipuutosten seulontatutkimukset T-lymfosyytit verenkuva ja diffi solujen määrä (lymf, neutr) B-lymfosyytit fagosyytit komplementtijärjestelmä IgG, IgA, IgM B-solujen toiminta komplementtipuutostutkimus komplementtijärjestelmä Jatkotutkimuksia T-solut: T-solujen määrä ja alaluokat (virtaussytometria) Mantoux? proliferaatiotutkimukset B-solut: vasta-ainevaste rokotuksiin B-solujen määrä (virtaussytometria) neutrofiilit: funktiotutkimukset - oxidative burst (NBT, virtaussytometria) - kemotaksis komplementti: yksittäisten tekijöiden määritykset Hereditaarinen angioödeema = HAE Suomessa 100-150 potilasta oireina kohtauksittaiset iho- ja limakalvoturvotukset yleisin syy toimivan C1-inhibiittorin puutos Hereditaarinen angioödeema HAE: oireet 1 tautityypit HAE I C1-inhibiittorin puutos HAE II C1-inhibiittorin toimintavika HAE III syy? osalla potilaista hyytymistekijä XII:n mutaatio samanlaiset oireet hankinnaisessa angioödeemassa (AAE) ja ACE-estäjien käyttöön liittyvässä angioödeemassa oireet identtiset tautityypistä riippumatta toistuvat, itsestään ohimenevät turvotukset iholla ja limakalvoilla kasvot raajat suoliston limakalvo kurkunpää turvotus itsessään kivuton, kutiamaton turvotuksiin voi liittyä erytematoottinen ihottumareaktio mutta ei urtikariaa turvotukset kestävät yleensä 12-72 tuntia 9
HAE: oireet 2 HAE: oireet 3 suoliston limakalvon turvotukset - kovat koliikkimaiset vatsakivut - pahoinvointi, oksentelu - virtsaamisvaivat - kivut johtaneet turhiin leikkauksiin - HAE-lääkitys poistaa kivut kurkunpään turvotus - esiintyy 50%:lla potilaista jossain vaiheessa - jopa ensioireena - hoitamattomana kuolleisuus 20-30% HAE: oireet 4 laukaisevat tekijät pienet traumat toimenpiteet, esim. hammashoito psyykkinen tai fyysinen stressi jotkin ruoka-aineet kyseessä synnynnäinen mutaatio oireet alkavat yleensä murrosiässä ja lieventyvät yleensä ikääntymisen myötä hormonaalinen vaikutus? kohtaukset yleensä lievenevät raskauden aikana turvotuskohtausten frekvenssi vaihtelee Angioödeeman erotusdiagnostiikka C1-inhibiittorin puutos HAE I, II, AAE Allerginen angioödeema Lääkeaineet, ruoka-aineet, hyönteisten pistot, parasiitti-infektiot Krooninen idiopaattinen angioödeema Muut syyt HAE III ACE-estäjien käyttöön liittyvä angioödeema Infektio Trauma Sydänperäinen turvotus Pahanlaatuisiin kasvaimiin liittyvä lymfödeema Yläonttolaskimon tukos HAE: estohoito käytössä syklokaproni, androgeenit ja laskimonsisäinen C1-inhibiittori kaikkia voidaan käyttää joko pitkäaikaiseen estohoitoon tai tarpeen mukaan ennen toimenpiteitä tms. HAE: kohtaushoito käytössä syklokaproni, C1-inhibiittori ja ikatibantti kurkunpään turvotus akuutti, henkeä uhkaava hätätilanne C1-inhibiittori (Cebitor, Berinert ) ikatibantti (Firazyr ) vatsakivut C1-inhibiittori ikatibantti lievissä tapauksissa syklokaproni ihoturvotukset yleensä itsestään ohimeneviä tarvittaessa syklokaproni, C1-inhibiittori tai ikatibantti adrenaliini, kortikosteroidit ja antihistamiinit: huono teho! 10
HAE:n diagnostiikka HAE-tutkimus sisältää yleensä seuraavat osatutkimukset: S-C1Inh P-C1InhBk S-C4 (S-C3) Tulkinta: jos C1-inhibiittorin pitoisuus ja biokemiallinen aktiivisuus ovat normaalitasolla kohtauksen aikana otetussa näytteessä, ei potilaalla ole I- tai II-tyypin HAE-tautia ACE-estäjien käyttöön liittyvä angioödeema ACE = kininaasi II ACE inaktivoi bradykiniinia ACE-estäjähoitoon liittyy 0.1-0.5% angioödeemariski akuutti kohtaus voidaan hoitaa C1-inhibiittorilla varsinainen hoito: ACE-estäjän lopetus 11