KASVAIMEN VERI- JA IMUSUONITUKSEN MERKITYS MUNASARJASYÖVÄN DIAGNOSTIIKALLE JA ENNUSTEELLE

KASVAIMEN VERI- JA IMUSUONITUKSEN MERKITYS MUNASARJASYÖVÄN DIAGNOSTIIKALLE JA ENNUSTEELLE Oona-Tuuli Muukkonen Tutkielma Lääketieteen koulutusohjelma Itä-Suomen yliopisto Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos / molekulaarinen lääketiede, naistentaudit Lokakuu 2016

ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Terveystieteiden tiedekunta Lääketieteen laitos Lääketieteen koulutusohjelma MUUKKONEN, OONA-TUULI E.: Kasvaimen veri- ja imusuonituksen merkitys munasarjasyövän diagnostiikalle ja ennusteelle Opinnäytetutkielma, 31 sivua Tutkielman ohjaajat: naistentautien ja synnytysten erikoislääkäri, LT Hanna Sallinen, molekulaarisen lääketieteen professori, LT Seppo Ylä-Herttuala Lokakuu 2016 Asiasanat: naistentaudit, munasarjasyöpä, angiogeneesi, lymfangiogeneesi Munasarjasyöpä on salakavala tauti, joka todetaan usein vasta levinneessä vaiheessa. Aluksi se voi olla oireeton, tai sen epäspesifejä oireita, kuten vatsan turvottelua, suolen toiminnan muutoksia tai kuukautishäiriöitä ei osata yhdistää sairauteen. Pitkälle edennyttä munasarjasyöpää ei useinkaan voida täysin parantaa, ja silloin käytetään palliatiivisia hoitokeinoja. Olisi siis tärkeää löytää keinoja munasarjasyövän varhaisen vaiheen diagnostiikkaan. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää veri- ja imusuonien ominaisuuksien vaikutusta munasarjasyövän ennusteeseen, diagnostiikkaan ja taudinkulkuun. Tutkittavat ominaisuudet olivat suonten tiheys, koko ja prosenttiosuus munasarjakasvaimesta. Aineistona oli munasarjakasvainnäytteitä Kuopion yliopistollisessa sairaalassa vuosina 1999 2007 hoidetuilta potilailta (n = 139). Verisuonivärjäyksiin käytettiin kahta erilaista merkkiainetta, jotka olivat CD34 ja CD105 eli endoglin. CD34 on tunnettu ja yleisesti käytetty verisuonimerkkiaine, kun taas endoglinilla on tehty vähemmän tutkimuksia. Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään, onko jompikumpi näistä merkkiaineista parempi kuvaamaan munasarjasyövän taudin laatua ja ennustetta. Imusuonivärjäyksiin käytettiin merkkiainetta D2-40, jota on käytetty myös muissa tutkimuksissa. Tutkimuksessa todettiin, että verisuonten uudismuodostus oli runsaampaa pahanlaatuisissa munasarjakasvaimissa kuin hyvänlaatuisissa tai rajatilakasvaimissa. Samansuuntainen tulos saatiin sekä CD34- että endoglin-merkkiaineella. Merkkiaineilla saatiin kuitenkin myös eroavia tuloksia. Endoglin-värjäyksissä suuntaus oli niin, että kasvaimen runsaampi verisuonitus yhdistyi huonompaan ennusteeseen. CD34-värjäyksissä kasvaimen pienempi verisuonitiheys ja lukumäärä taas liittyivät huonompaan ennusteeseen. Imusuonten määrässä ei havaittu yhteyttä kasvaimen hyvän- tai pahanlaatuisuuteen. Imusuonten suuri tiheys syöpäkasvaimessa yhdistyi kuitenkin kasvaimen matalampaan erilaistumisasteeseen, ja suuri prosenttisosuus runsaampaan etäpesäkkeiden määrään imusolmukkeissa.

UNIVERSITY OF EASTERN FINLAND, Faculty of Health Sciences School of Medicine Medicine MUUKKONEN, OONA-TUULI E.: The effect of tumor angiogenesis and lymphangiogenesis on ovarian cancer diagnostics and prognosis Thesis, 31 pages Tutors: Hanna Sallinen, MD, Specialist in gynecology and obstetrics, Seppo Ylä-Herttuala, Professor of Molecular Medicine October 2016 Keywords: gynecological diseases, ovarian cancer, angiogenesis Ovarian cancer is a treacherous disease that is often diagnosed in advanced stage. Symptoms can be subtle and not specific, such as swelling, changes in bowel function or period disorders. It may be difficult to associate these symptoms to the disease. Unfortunately, disseminated ovarian cancer can rarely be completely treated, and then only palliative treatment is available. Therefore, it is important to make the diagnosis of ovarian cancer early enough. The purpose of this study was to examine the role of blood and lymphatic vessels to the diagnosis and prognosis of epithelial ovarian cancer. Microvessel density (MVD), total area of microvessels in tumors and mean perimeter of microvessels in tumors were measured. The material consisted of ovarian tumors from patients treated in Kuopio University Hospital in 1999 2007 (n = 139). We used two different blood vessel marker in immunohistochemical stainings, CD34 and CD105 (endoglin). CD34 is a well-known and generally used blood vessel marker, whereas there are not so many studies with endoglin. The aim was to compare these two blood vessel markers and find whether one was better than another to describe the clinical picture and prognosis of ovarian cancer. As lymph vessel marker we used D2-40. We found that angiogenesis was greater in malignant tumors compared to benign tumors. The result was similar in both CD34 and endoglin stainings. However, there were differences in those markers when prognosis of ovarian cancer patients was studied. In endoglin stainings the trend was that the greater was the blood vessel density in tumor the poorer was the prognosis. On the contrary, in CD34 stainings the smaller vessel density and lesser number of vessels were associated with poorer prognosis. Number of lymph vessels was not found to have an effect whether the tumor was benign or malign. However, a high density of lymph vessels was associated with poorer differentiation grade in tumors. A high total area of lymphatic vessels in tumors was also associated with lymph node metastasis.

SISÄLTÖ 1 JOHDANTO... 5 2 MUNASARJASYÖPÄ... 6 2.1 Yleistä... 6 2.2 Luokittelu... 8 2.3 Riski- ja suojatekijät... 10 2.4 Diagnostiikka... 11 2.5 Hoito... 12 3 VERI- JA IMUSUONTEN KEHITTYMINEN KASVAIMISSA... 13 3.1 Angiogeneesi eli verisuonten muodostuminen... 13 3.2 Lymfangiogeneesi... 14 3.3 Veri- ja imusuonimerkkiaineet... 15 4 TUTKIMUS... 16 4.1 Tutkimustehtävä... 16 4.2 Aineisto ja menetelmät... 17 4.3 Oma osuus... 19 4.4 Tulokset... 19 4.4.1 Veri- ja imusuonten ominaisuuksien merkitys munasarjakasvaimen laatuun... 19 4.4.2 Munasarjasyövän erilaistumisaste... 20 4.4.3 Munasarjasyövän levinneisyys... 20 4.4.4 Munasarjasyövän histologinen tyyppi... 21 4.4.5 Jäännöskasvaimen koko... 21 4.4.6 Munasarjasyöpäpotilaiden taudin uusiutuminen, tautivapaa-aika ja kokonaiselinaika... 21 5 POHDINTA... 23 LÄHTEET... 27

5 1 JOHDANTO Munasarjasyöpä on kaikista tappavin naisten gynekologisista syövistä (Sankaranarayanan, Ferlay 2006). Sitä voidaan hoitaa leikkauksella ja solunsalpaajilla, mutta ne ovat usein melko tehottomia etenkin edenneen vaiheen taudissa. Usein munasarjasyöpä todetaankin vasta myöhäisessä vaiheessa, koska se voi olla kauan oireeton tai hyvin vähäoireinen. Seulontamenetelmää ei ole kehitetty. (Lurie ym. 2009) Munasarjasyöpään liittyvä suuri kuolleisuus ja potilaiden kokema kärsimys antavat aiheen tämän tutkimuksen tekemiseen. Tämän työn tarkoituksena oli tutkia, millä tavalla veri- ja imusuonten määrä, tiheys ja koko liittyvät munasarjasyövän ennusteeseen ja taudin laatuun. Aineistona oli munasarjakasvaimista otettuja näytteitä Kuopion yliopistollisessa sairaalassa hoidetuilta potilailta. Näytteiden verisuonet värjättiin kahdella eri vasta-aineella, joista CD34 on vanhempi ja tunnetumpi, ja CD105 eli endoglin uudempi sekä vähemmän käytetty. Endoglinin on havaittu värjäävän erityisesti vastamuodostuneita suonia, joten sen voisi ajatella olevan tarkempi sairauden laadun kuvaaja kuin kaikki verisuonet värjäävä CD34 (Cwiklinska ym. 2013, Dallas ym. 2008). Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään, onko näistä värjäyksistä toinen parempi munasarjasyövän diagnostiikan ja ennusteen kuvaamisen kannalta. Samoin kuin verisuonissa, syöpäsolut voivat kulkeutua ympäri elimistöä imusuonia pitkin. Imusuonten merkitystä syövän kehittymisen kannalta on tutkittu paljon vähemmän kuin verisuonia, ja se onkin tärkeä ja mielenkiintoinen osa tätä tutkimusta. Eläinkokeissa runsas imusuonten muodostus kasvaimessa on yhdistetty suurempaan etäpesäkkeiden määrään imusolmukkeissa (Albrecht, Christofori 2011). Tässä tutkimuksessa käytettiin D2-40- vasta-ainetta, joka kiinnittyy imusuoniin ja värjää ne. Verisuonten muodostumisen merkityksestä syövän kehittymiseen on tehty runsaasti tutkimuksia, mutta tulokset ovat olleet hämmentävän erilaisia. Joissain tutkimuksissa on havaittu selvä yhteys: mitä enemmän ja mitä tiheämmässä verisuonia, sitä pahanlaatuisempi kasvain. Toisissa tutkimuksissa riippuvuutta ei ole löydetty, ja jopa täysin päinvastaisia tuloksia on saatu. (Chan ym. 2004, Ogawa ym. 2002). Tämä tutkimus ei luultavasti anna lopullista vastausta, mutta sen tarkoituksena on viedä meitä taas askeleen lähemmäs ratkaisua.

6 2 MUNASARJASYÖPÄ 2.1 Yleistä Munasarjasyöpä on kymmenenneksi yleisin naisten syöpä Suomessa, ja toiseksi yleisin gynekologinen syöpä kohdunrungon syövän jälkeen. Suomessa todettiin uusia munasarjasyöpiä 471 vuonna 2012, ja ikävakioitu ilmaantuvuus kyseisenä vuotena oli 8,6/100 000 henkilövuotta. Samana vuonna kuolleisuus oli 4,8/100 000 henkilövuotta. (www.cancerregistry.fi 17.12.2014) Munasarjasyöpään sairastuneiden mediaani-ikä on 60 vuotta (Hennessy ym. 2009). Kaikista gynekologisista syövistä munasarjasyöpään menehtyy eniten naisia, ja suurin esiintyvyys on luoteisessa Euroopassa sekä Pohjois-Amerikassa. Naisilla keskimääräinen riski sairastua munasarjasyöpään kehittyneissä maissa on noin 1/70. Kehittyvissä maissa munasarjasyövän esiintyvyys on matalin. (Sankaranarayanan, Ferlay 2006) Munasarjasyövän syntymekanismi on vielä epäselvä, mutta joitakin teorioita siitä on esitetty. Erään mallin mukaan toistuvat ovulaatiot vaurioittavat munasarjan pintaa (Fathalla 1971), ja sen seurauksena aktivoituvat korjausmekanismit. Solujen jakautuessa runsaasti niihin kertyy geenivirheitä. Karsinogeneesi voi tällöin indusoitua esimerkiksi kasvutekijöiden liiallisesta aktiivisuudesta johtuen. (Hennessy ym. 2009) Toinen teoria esittää, että suuret gonadotropiini- eli FSH- ja LH-tasot ovulaation aikaan lisäisivät estrogeenituotantoa munasarjoissa, mikä johtaisi pahanlaatuisiin muutoksiin. Teorian mukaan myös pysyvästi korkeat gonadotropiinitasot menopaussin jälkeen voivat aktivoida estrogeenituotantoa. (Cramer, Welch 1983) Kolmannen teorian mukaan androgeenit voisivat altistaa syövän syntymiselle, kun taas progestiinit ehkäisisivät sitä (Risch 1998). Lisäksi tulehdukselliset sairaudet lantion alueella, kuten endometrioosi tai sisäsynnytintulehdukset saattavat liittyä munasarjasyövän syntyyn (Ness ym. 2000). Suurimmalla osalla (noin 70 %) munasarjasyöpäpotilaista todetaan diagnoosihetkellä jo pitkälle edennyt, FIGO-luokituksessa (International Federation of Gynecology and Obstetrics) tason III tai IV munasarjasyöpä, koska tauti on usein alkuvaiheessa oireeton ja kivuton tai oireet eivät ole spesifisiä (Cannistra 2004, Runnebaum, Stickeler 2001). Sen vuoksi hoitoon hakeudutaan myöhään. Varhaisen vaiheen syövän tunnistamiseen ei ole spesifisiä keinoja, ja myöhäisemmässäkin vaiheessa tauti voi oireilla vain vähän. Oireiden alkaessa syöpä on usein jo levinnyt, mikä tekee munasarjasyövän ennusteesta huonon. (Lurie ym. 2009) Munasarjasyövän oireita ovat esimerkiksi

7 vatsan turvotus vatsan, selän ja lantion alueen kipu suolen toiminnan häiriöt virtsaamisvaivat kuukautishäiriöt ruokahalun menetys, pahoinvointi laihtuminen vaihdevuosioireet, kuumat aallot (Chan ym. 2003, Hennessy ym. 2009). Munasarjasyövälle ominaista on askitesnesteen muodostuminen vatsaonteloon. Siitä kärsii useampi kuin yksi kolmesta munasarjasyöpäpotilaasta. Askiteksen muodostuminen on yhdistetty huonoon ennusteeseen ja potilaan elämänlaadun heikkenemiseen, sillä se aiheuttaa vatsakipua ja turvotuksen tunnetta. Se voi vaikeuttaa myös hengitystä ja aiheuttaa suoliston ja virtsateiden ongelmia. Askites mahdollistaa kasvaimelle optimaalisen ympäristön kehittyä, ja se myös ehkäisee vastetta solusalpaajahoidolle. Askitesta voi muodostua niin paljon, että sitä on otettava pois vatsaontelosta, jotta potilaan oireet helpottuisivat. Toisaalta toimenpide voi aiheuttaa komplikaatioita, esimerkiksi verisuonivaurioita, jotka lopulta vaikeuttavat potilaan hoitoa (Ahmed ym. 2013). Askites saattaa sisältää kasvaimesta irronneita soluja, ja sen liike vatsaontelossa edesauttaa syöpäsolujen leviämistä. Syöpäsolujen leviämiseen vaikuttavat painovoima, pallean aiheuttama paine, vatsaontelon elinten liikkuvuus sekä anatomisten rakenteiden muodostamat syvennykset. Kolme yleisintä vatsansisäistä metastaasialuetta ovat iso vatsapaita (omentum majus), peräsuolen ja kohdun välissä oleva syvennys (fossa Douglasi) sekä pallean alapuolinen alue oikealla puolella. Ruumiinonteloita myöten kulkeutumisen lisäksi syöpä leviää myös veri- ja imusuonia pitkin (Ahmed ym. 2013). Munasarjasyövän havaitsemiseksi oireettomilta henkilöiltä ei ole käytössä seulontamenetelmää, toisin kuin esimerkiksi rinta- ja kohdunkaulan syöpään. CA125-määritys tai lantion ultraäänitutkimus eivät ole tarpeeksi tarkkoja ja spesifisiä käytettäväksi seulontaan. (Chan ym. 2003)

8 2.2 Luokittelu Munasarjakasvaimet luokitellaan munasarjoissa esiintyvien kolmen eri kudostyypin perusteella: epiteliaaliset kasvaimet (pinnan epiteelistä), osuus syövistä 85 90 % itusolukasvaimet (itusoluista), osuus 1 3 % sukupienakasvaimet (stroomasta), osuus 3 5 % Jokaisessa ryhmässä on laadultaan hyvän- ja pahanlaatuisia kasvaimia. Epiteelikasvainryhmässä voi olla myös niin sanottuja rajalaatuisia kasvaimia (borderline- eli semimalignit kasvaimet). Ne sijoittuvat histologisesti ja käyttäytymiseltään hyvän- ja pahanlaatuisten kasvainten väliin. (Syöpätaudit, Duodecim 2013) Tässä tutkimuksessa keskitytään munasarjasyövän epiteliaaliseen muotoon, joka on kaikista yleisin. Histologisesti epiteliaaliset munasarjakasvaimet luokitellaan eri luokkiin: seroosit ja musiinit karsinoomat, endometrioidikarsinoomat ja harvinaisemmat kirkassolukarsinoomat, erilaistumattomat sekä sekamuotoiset kasvaimet (Hennessy ym. 2009). Seroosi karsinooma on epiteliaalisen munasarjasyövän yleisin muoto sen osuuden ollessa 60 80 % (Li, Fadare ym. 2012). Karsinoomat jaetaan kolmeen eri ryhmään erilaistumisasteensa mukaan: hyvin, kohtalaisesti ja huonosti erilaistuneet karsinoomat. (Hennessy ym. 2009). Nykyisin uudemmassa luokituksessa karsinoomat jaetaan kahteen luokkaan: high ja low grade. Uusi luokitus on pelkistetympi ja se perustuu kasvainten erilaiseen kehitystapaan. Matalaasteiset karsinoomat kehittyvät adenofibroomista tai rajatilakasvaimista, niiden kehitys invasiiviseksi syöväksi on hitaampi, ja niillä on parempi ennuste. Korkean asteen karsinoomissa mitoosiaktiivisuus on suurempi, ja ne kehittyvät ja leviävät aggressiivisemmin. (Vang ym. 2009) FIGO laatii maailmanlaajuiset gynekologisten syöpien levinneisyysluokitukset (Taulukko 1). Luokituksessa kasvaimet jaetaan neljään eri ryhmään ja niiden alaryhmiin syövän levinneisyyden mukaan. Tällä pyritään siihen, että koko maailmassa hoito ja tulokset olisivat samanlaisia ja keskenään vertailtavissa. Myös taudin ennustetta pyritään kuvaamaan mahdollisimman hyvin luokituksen muuttujien avulla. (www.gynekologiyhdistys.fi 5.12.2014)

9 Taulukko 1. Munasarjasyövän FIGO-luokitus, 2014 (Muokattu lähteestä SGO, Society of Gynecologic Oncology. www.sgo.org/wp-content/uploads/2012/09/figo-ovarian-cancer- Staging_1.10.14.pdf) Luokka Aste I IA IB IC Aste II IIA IIB Aste III IIIA IIIB Levinneisyys Munasarjoihin rajoittunut kasvain Kasvain vain toisessa munasarjassa. Munasarjan kapseli ehjä, eikä sen pinnassa ole kasvainta. Ei kasvainsoluja huuhtelunäytteissä. Kasvain kummassakin munasarjassa. Muutoin sama kuin IA. Molemmissa tai vain toisessa munasarjassa kasvain. IC1: Leikkauksen aikana repeytynyt munasarjan kapseli, jolloin kasvainsoluja voi levitä vatsaonteloon ja lantion elimiin. IC2: Kapseli repeytynyt jo ennen leikkausta tai kasvainta munasarjan pinnassa. IC3: Pahanlaatuisia kasvainsoluja askiteksessa tai vatsaontelon huuhtelunäytteissä. Toisessa tai molemmissa munasarjoissa sekä lantion alueella kasvain Kasvainta on kohdussa ja/tai munanjohtimissa. Kasvain on levinnyt muihin lantion kudoksiin. Toisessa tai molemmissa munasarjoissa kasvain, ja se on levinnyt vatsakalvon ulkopuolelle lantioon ja/tai metastoinut retroperitoneaalisiin imusolmukkeisiin Retroperitoneaalisissa imusolmukkeissa kasvain ja/tai mikroskooppinen leviäminen lantion ulkopuolelle. IIIA1: Kasvainta vain retroperitoneaalisissa imusolmukkeissa. IIIA1 (i): metastaasit </= 10 mm IIIA1 (ii): metastaasit > 10 mm IIIA2: Mikroskooppinen leviäminen lantion ulkopuolelle, lisäksi vatsakalvossa ± retroperitoneaalisissa imusolmukkeissa. Makroskooppinen leviäminen lantion ulkopuolelle, ja vatsakalvossa metastaaseja, jotka </= 2 cm ± retroperitoneaalisissa imusolmukkeissa. Kasvainta voi olla myös maksan tai pernan kapselissa.

10 IIIC Aste IV IVA IVB Makroskooppinen leviäminen lantion ulkopuolelle, ja vatsakalvossa metastaaseja, jotka > 2 cm ± retroperitoneaalisissa imusolmukkeissa. Kasvainta voi olla myös maksan tai pernan kapselissa. Toisessa tai molemmissa munasarjoissa kasvain. Etäpesäkkeitä muodostunut, poislukien vatsakalvon metastaasit Keuhkoissa pleuranesteessä pahanlaatuisia soluja. Maksan tai pernan parenkyymissä etäpesäkkeitä, ja metastaaseja vatsan ulkopuolisiin elimiin (sisältäen nivusen imusolmukkeet sekä vatsaontelon ulkopuoliset imusolmukkeet). 2.3 Riski- ja suojatekijät Merkittävimpänä munasarjasyövän riskitekijänä pidetään suvussa runsaasti esiintyvää rinta- tai munasarjasyöpää. Kuitenkin vain 10 15 %:lla potilaista todetaan perinnöllinen alttius, joka johtuu yleensä BRCA1- ja BRCA2-geenien mutaatioista. BRCA1-mutaatiota kantavilla naisilla on 39 46 %:n riski sairastua epiteliaaliseen munasarjasyöpään, ja BRCA2- mutaation kantajilla riski on 12 20 %. Muita riskitekijöitä ovat lapsettomuus, varhaisessa iässä alkaneet kuukautiset, myöhäiset vaihdevuodet ja ikääntyminen. (Hennessy ym. 2009) Munasarjasyövältä suojaavia tekijöitä ovat yhdistelmäehkäisypillereiden käyttö, raskaus ja imetys sekä munanjohtimien tukkiminen tai katkaiseminen eli sterilisaatio (Hennessy ym. 2009). Yhdistelmäehkäisypillereiden käyttö 10 vuoden ajan tai pidempään on yhdistetty jopa 70 % vähentyneeseen munasarjasyövän riskiin verrattuna pillereitä käyttämättömiin naisiin. Sterilointi munanjohtimien ligaatiolla vähentää riskiä noin 30 50 %, kuten myös kohdunpoisto. (Green ym. 1997) Munasarjan ja munanjohtimen ehkäisevää poistoa suositellaan vain BRCA1- ja BRCA2- mutaation kantajille, joilla on suurentunut riski sairastua munasarjasyöpään. Poistamisella voidaan huomattavasti pienentää sairastumisriskiä munasarja- ja rintasyöpään. Poistamista suositellaan, kun nainen on täyttänyt 40 vuotta. (Domchek ym. 2010) Munasarjojen poistamista ei suositella naisille, joiden riski sairastua ei ole kasvanut. Munasarjojen poistosta voi seurata negatiivisia vaikutuksia terveyteen, kuten suurentunut alttius sairastua sepelvaltimotautiin ja keuhkosyöpään. (Parker ym. 2009)

11 2.4 Diagnostiikka Tällä hetkellä munasarjasyövän diagnostiikkaan käytetään gynekologista tutkimusta, seerumin CA125-tason mittausta sekä emättimen kautta tehtävää ultraäänitutkimusta (Dutta ym. 2010). Lisäksi käytössä on TATI- ja HE4-tasojen määritys seerumista, sillä munasarjasyövässä niiden pitoisuudet seerumissa ovat kohonneet. HE4 (human epididymis protein) on proteiini, jota muodostuu runsaasti munasarjasyöpäkudoksessa. TATI (tumorassociated trypsin inhibitor) ilmentyy useissa syöpätyypeissä, mutta erityisesti munasarjasyövän musinoottisessa muodossa (Li, Dowdy ym. 2009, Stenman 2002). Nämä keinot eivät kuitenkaan ole riittäviä varhaisen vaiheen munasarjasyövän toteamiseen. Taudin alkuvaiheessa muutokset ovat vielä hyvin vähäisiä, eivätkä nämä menetelmät ole tarpeeksi herkkiä havaitsemaan niitä. (Dutta ym. 2010) Lopullinen diagnoosi perustuu leikkauksessa otettavasta kasvainnäytteestä tehtävään histopatologiseen tutkimukseen. Magneettikuvantamisesta voi olla hyötyä levinneisyyden arvioimisessa ja diagnosoinnissa. (Hennessy ym. 2009) Seerumin CA125-tason käyttö munasarjasyövän merkkiaineena perustuu sen toimintaan kasvainantigeenina. Musiiniperheeseen kuuluvaa CA125-proteiinia (myös MUC16) erittävät epiteliaaliset kasvainsolut. CA125-taso on kohonnut 80 90 %:ssa edenneen vaiheen munasarjasyövistä, mutta varhaisen vaiheen syövistä vain 47 %:ssa. Valitettavasti se ei myöskään ole spesifinen munasarjasyövän merkki, vaan CA125-pitoisuus nousee monissa muissakin syövissä (esimerkiksi haima- ja rintasyöpä), sairauksissa (esimerkiksi endometrioosi) ja fysiologisissakin tiloissa, kuten raskauden ja kuukautisten aikana. (Dutta ym. 2010) Muita käyttökelpoisia kasvainmerkkiaineita ovat esimerkiksi muut musiinit, kuten MUC4. CA125-tason mittaus yhdistettynä MUC1-, CA72-4- ja M-CSF-mittauksiin paransi asteen I munasarjasyövän tunnistamista 70 %:iin, kun CA125-mittauksessa yksinään tunnistusaste oli 45 % (Dutta ym. 2010). Seerumin CA125-taso on kuitenkin käyttökelpoinen mittaamaan potilaan vastetta leikkauksen jälkeiseen solunsalpaajahoitoon, ja sitä voidaan käyttää myös taudin uusiutumisen varhaiseen tunnistamiseen (Hennessy ym. 2009). Lisäksi angiogeenisistä kasvutekijöistä ja reseptoreista on pyritty saamaan uusia verenkierron merkkiaineita munasarjasyövälle. Soveltuvia merkkiaineita voisivat olla esimerkiksi Ang-2 ja VEGFR-2. (Sallinen ym. 2014)

12 2.5 Hoito Tällä hetkellä munasarjasyövän hoitona käytetään leikkausta ja solunsalpaajahoitoa. Epäiltäessä munasarjasyöpää potilaan oireiden, kliinisen tutkimuksen ja kuvantamistutkimusten, kuten emättimen kautta tehtävän ultraäänitutkimuksen, vartalon tietokonetomografiakuvauksen tai vatsan magneettitutkimuksen perusteella tehdään potilaalle laparotomia eli vatsan avaus. Harkinnan mukaan leikkaus voidaan myös aloittaa tähystysleikkauksena eli laparoskopiana, jolloin voidaan vähemmän invasiivisella tekniikalla ensin varmistaa, että laajempi leikkaus on potilaalle mahdollinen. Leikkauksessa pyritään poistamaan kasvain ja saamaan histologinen määritys diagnoosin varmistamiseksi. Samalla selvitetään taudin levinneisyysaste, jolla on merkitystä leikkauksen jälkeiseen hoitoon. Leikkauksessa otetaan vatsaontelon huuhtelunäyte ja poistetaan kaikki näkyvä kasvainkudos, kohtu sekä sen sivuelimet. Myös para-aortaalialueen ja lantion molemminpuoliset imusolmukkeet, vatsapaita sekä umpilisäke poistetaan. (Ghezzi ym. 2007) Leikkauksessa vatsaonteloon jäävän jäännöskasvaimen koolla on merkitystä potilaan selviytymisen kannalta: tutkimuksissa on osoitettu ennusteen olevan parempi, mikäli jäännöskasvaimen koko on alle 1 cm (Hennessy ym. 2009). Solunsalpaajina on käytössä ensisijaisesti karboplatiinin ja paklitakselin yhdistelmä (International Collaborative Ovarian Neoplasm Group 2002). Munasarjasyövän ja muidenkin syöpien hoitoon on kehitetty antiangiogeenisiä lääkeaineita, kuten VEGF-, PDGF- tai FGF-inhibiittoreita. Tehokkaimmaksi on osoittautunut monoklonaalinen vasta-aine bevasitsumabi, joka estää VEGF-kasvutekijän sitoutumisen reseptoreihinsa (VEGFR-1 ja VEGFR-2). (Hall ym. 2013) Huolimatta kasvaimen optimaalisesta poistosta ja tehokkaasta ensilinjan solusalpaajahoidosta, pitkälle edenneen munasarjasyövän ennuste on huono. Vaikka syöpä saataisiin hoidettua ensimmäisellä kerralla, pyrkii se uusiutumaan 16 22 kuukauden kuluessa ja kehittymään samalla vastustuskykyiseksi solusalpaajille. Tällöin selviytymisaste 5 vuoden jälkeen on vain noin 27 %. (Ahmed ym. 2013)

13 3 VERI- JA IMUSUONTEN KEHITTYMINEN KASVAIMISSA 3.1 Angiogeneesi eli verisuonten muodostuminen Angiogeneesissä verisuonten endoteelisolujen kehitys käynnistyy ja sen seurauksena uusia verisuonia alkaa muodostua. Angiogeneesillä on tärkeä rooli esimerkiksi alkionkehityksessä, haavan parantumisessa, kuukautiskierrossa sekä syövän kehityksessä. Se liittyy siis sekä patologisiin että normaaleihin ja fysiologisiin tapahtumiin. (Bamberger, Perrett 2002) Syövän kehittymiselle angiogeneesi on elintärkeää. Ilman verisuonitusta kasvain ei voi kasvaa kooltaan suuremmaksi kuin 1 2 mm, sillä verisuonten kautta se saa happea ja ravinteita sekä pystyy poistamaan kuona-aineita. Verisuonituksen muodostuminen on edellytys syövän leviämiselle ja metastaasien kasvamiselle. Vasta muodostuneiden pienten kapillaarien seinämät ovat ohuita ja fenestroituja, eli niissä on aukkoja. Syövän leviäminen mahdollistuu, kun syöpäsolut pääsevät kulkemaan verisuonten seinämien läpi (Bamberger, Perrett 2002). Syöpäkasvaimen kehittämät verisuonet eroavat normaaleista suonista. Kasvaimen suonet ovat mutkikkaampia ja järjestäytyneet epäsäännöllisemmällä tavalla (Pasqualini ym. 2002). Lisäksi niiden seinämät ovat hauraampia, sillä niissä endoteelisolut ovat heikommin kiinni toisissaan ja niitä peittävissä perisyyteissä (Morikawa ym. 2002). Tyvikalvo on löyhemmin kiinnittynyt endoteeliin ja perisyytteihin (Baluk ym. 2003). Kasvaimeen liittyvien suonten endoteelisolujen perimä on myös epästabiili, ja ne voivat olla esimerkiksi aneuploidisia, jolloin kromosomimäärä on poikkeava (Hida, Klagsbrun 2005). Angiogeneesi aktivoituu hypoksian eli hapenpuutteen seurauksena (Jussila, Alitalo 2002). Angiogeneesissä verisuonten endoteelin kasvutekijöillä (VEGFs, vascular endothelial growth factors) on tärkeä rooli. Kasvutekijät edistävät verisuonten endoteelisolujen kasvua ja kerääntymistä ja näin verisuoniontelon muodostumista. VEGF-perheeseen kuuluu viisi erityyppistä kasvutekijää: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D sekä PlGF (istukkakasvutekijä, placental growth factor). Verisuonten muodostumisesta kasvaimissa vastaa suurimmaksi osaksi VEGF-A, kun taas VEGF-C ja VEGF-D saavat aikaan imusuonten kehittymistä. VEGF-reseptorit VEGFR-1, VEGFR-2 ja VEGFR-3 ovat tyrosiinikinaasireseptoreja, jotka kasvutekijän sidottuaan aktivoivat solunsisäisen signaalinvälitysketjun (Shibuya 2013). Verisuonten muodostumisessa tarvitaan myös muita kasvutekijöitä, kuten PDGF (platelet derived growth factor) ja TGF (transforming growth factor) (Bamberger, Perrett

14 2002). Suonten kasvua edistävät lisäksi FGF (fibroblast growth factor) ja angiopoietiinit 1 ja 2 (Ang-1 ja Ang-2). Toisaalta esimerkiksi trombospondiini-1 ja angiostatiini ovat verisuonten kehittymistä rajoittavia tekijöitä, ja niiden toiminnan estäminen lisää verisuonten muodostumista (Hall ym. 2013). Useissa tutkimuksissa on havaittu, että VEGF-kasvutekijöitä tuotetaan ylimäärin useissa erityyppisissä kasvaimissa, kuten rinnan, munasarjan, kohdun ja virtsarakon kasvaimissa (Brown ym. 1993; Dvorak ym. 1995; Tjalma ym. 2000). Angiogeneesin mittarina voidaan käyttää esimerkiksi seerumista mitattavia Ang-1-, Ang-2, VEGF- ja VEGFR-pitoisuuksia (Sallinen ym. 2014). Angiogeneesin määrästä kertoo myös verisuonten tiheys kasvaimessa eli MVD (microvessel density). Mitä suurempi tiheys on, sitä enemmän angiogeneesiä tapahtuu. Useissa tutkimuksissa munasarjakasvainten korkea MVD, VEGF-kasvutekijätasot ja VEGF-reseptorien ilmentyminen on yhdistetty sairauden huonoon ennusteeseen. (Bamberger, Perrett 2002, He ym. 2015, Jacquemier ym. 1998) Toisaalta on saatu myös vastakkaisia tuloksia: joissakin tutkimuksissa korkea MVD merkitsi parempaa ennustetta kuin matala MVD (Chan ym. 2004, Ogawa ym. 2002). Kasvaimen runsas verisuonitus saattaa edistää solunsalpaajien ja hapen pääsyä kasvaimeen, minkä takia ennuste paranee (Chan ym. 2004). Joissakin tutkimuksissa MVD:n ja huonon ennusteen tai sairauden uusiutumisen välillä ei havaittu yhteyttä. (Cwiklinska ym. 2013, Shen ym. 2000) Tämä voisi selittyä sillä, että kasvaimen muodostamat verisuonet poikkeavat tavallisista verisuonista rakenteellisesti ja toiminnallisesti. Näissä verisuonissa verenvirtaus on satunnaista ja katkonaista, ja lääkkeiden kulkeutuminen kasvaimeen vaikeutuu. (Chan ym. 2004) Tutkimustulokset ovat siis ristiriitaisia, ja angiogeneesin vaikutus munasarjasyövän ennusteeseen ja lääkehoidon vasteeseen on epäselvä. 3.2 Lymfangiogeneesi Imusuonisto säätelee elimistön nestetasapainoa palauttaen kapillaareista soluvälitilaan tihkuvan nesteen takaisin verenkiertoon, säädellen näin myös verenpainetta. Se osallistuu myös immuunipuolustukseen kuljettaen puolustusjärjestelmän soluja sekä liukoisia vastaaineiden muodostajia, jotka kuljetetaan tunnistettaviksi ja tuhottaviksi imusolmukkeisiin. Lisäksi imusuonilla on rooli ravinnosta saatavien rasvojen imeytymisessä ja kuljetuksessa suolistosta. Lymfangiogeneesistä eli imusuonten muodostumisesta tiedetään paljon vähemmän kuin angiogeneesistä. Uusia imusuonia muodostuu tulehduksellisissa tiloissa,

15 kuten bakteeri-infektioissa, haavojen paranemisessa ja kasvainten kehityksessä. Yleensä aikuisella uudet imusuonet muodostuvat jo olemassa olevista imusuonista. (Tammela, Alitalo 2010) Lymfangiogeneesiä, kuten myöskään angiogeneesiä ei kuitenkaan tapahdu normaalisti terveissä aikuisen kudoksissa. (Eklund ym. 2013) Lymfangiogeneesi aktivoituu VEGFR-3-reseptorin kautta, kun kasvutekijät VEGF-C ja VEGF-D sitoutuvat siihen. (Tammela, Alitalo 2010) Syöpäkasvaimeen liittyvät imusuonet mahdollistavat syöpäsolujen kulkeutumisen ympäri elimistöä niiden irrottua alkuperäisestä kasvaimesta. Syöpäsolut voivat näin muodostaa sekundaarikasvaimia eli etäpesäkkeitä imusolmukkeissa sekä muissa elimissä. Eläinkokeissa on havaittu, että aktiivinen lymfangiogeneesi kasvaimessa edistää syövän leviämistä imusolmukkeisiin metastaaseiksi. Toisaalta kasvaimet voivat käyttää hyväkseen myös valmiiksi olemassa olevia imusuonia, etenkin jos kasvain sijaitsee suuren imusuonitiheyden omaavassa kudoksessa. (Albrecht, Christofori 2011) Syöpäkasvaimen sisäiset imusuonet eivät toimi normaalisti, vaan niissä on heikommat seinämät. Seinämän läpi pääsee vuotamaan nestettä soluvälitilaan, jolloin paine siellä kasvaa. Tämä voi heikentää syöpälääkkeiden tehoa. (Eklund ym. 2013) 3.3 Veri- ja imusuonimerkkiaineet Veri- ja imusuonten pinnan soluihin tarttuvia verisuonimerkkiaineita on käytössä useita. Näytteet värjätään immunohistokemiallisesti, jolloin kasvaimessa olevat suonet saadaan erottuviksi. Verisuonimerkkiaineista CD31 ja CD34 ovat käytetyimpiä (Bamberger, Perrett 2002). Muita verisuonimerkkiaineita ovat esimerkiksi Ulex ja von Willebrand -tekijän (vwf, factor VIII) vasta-aine (Suhonen ym. 2007). CD34-vasta-aine reagoi laajimmin endoepiteliaalisolujen kanssa takertuen niiden pinnan CD34-glykoproteiiniin. Solukalvon CD34 kiinnittää soluja toisiinsa, ja sitä on epäkypsien verisolujen sekä endoepiteliaalisolujen pinnalla. Myös CD31 on adheesiomolekyyli, joka esiintyy verisuonten endoteelisolujen solukalvolla. (Bamberger, Perrett 2002, Cwiklinska ym. 2013) Endoglin eli CD105 on solukalvon homodimeerinen glykoproteiini, ja se on osa TGF-βreseptorikompleksia (transforming growth factor). Se koostuu kahdesta molekyylipainoltaan 95 kda:n alayksiköstä, jotka yhdistyvät disulfidisidoksella. Nopeasti jakautuvat verisuonten endoteelisolut ilmentävät endoglinia, joka on välttämätöntä angiogeneesille. En-

16 doglinia on käytetty kasvaimen sisäisen verisuonitiheyden (MVD) määrittämiseen. Korkea endoglinilla mitattu MVD on liitetty runsaampaan metastointiin ja huonompaan ennusteeseen rinnan, eturauhasen, kohdunkaulan ja ruuansulatuskanavan syövissä sekä pään ja kaulan alueen syövissä. (Bock ym. 2010) Endoglin-merkkiaineen on huomattu tarttuvan erityisesti kasvaimen muodostamiin uusiin verisuoniin, kun taas CD34 värjää sekä uudet että vanhat, alkuperäiset verisuonet (Cwiklinska ym. 2013). Näin ollen endoglin voisi olla parempi sairauden laatua ennustava verisuonimerkkiaine kuin perinteisesti käytetyt merkkiaineet, kuten CD31. Angiogeneesin stimuloimisen lisäksi endoglinin ilmentyminen aktivoi apoptoosia eli ohjelmoitua solukuolemaa estäviä signaalireittejä endoteelisoluissa (Dallas ym. 2008). Imusuonten muodostumisesta kasvaimissa tiedetään vähemmän kuin angiogeneesistä, eikä imusuonille ei ole niin paljon spesifisiä merkkiaineita kuin verisuonille. Imusuonien värjäykseen käytetään esimerkiksi LYVE-1-, Prox-1- ja podoplanin-vasta-aineita. Podoplaninin huomattiin alun perin esiintyvän podosyyteissä, mutta sitä ilmennetään myös imusuonten endoteelisolujen solukalvolla. Monoklonaalinen D2-40-vasta-aine tarttuu podoplaniniin, ja sitä käytetään kasvaimen imusuonitiheyden (LVD) mittaamiseen. Podoplaninin runsas ilmentyminen kasvainsoluissa on yhdistetty syövän aggressiivisuuteen ja suurempaan leviämiskykyyn. (Raica ym. 2008) 4 TUTKIMUS 4.1 Tutkimustehtävä Tutkimuksessa oli tarkoitus selvittää kasvaimen veri- ja imusuonten muodostumisen vaikutusta munasarjasyövän ennusteeseen ja oirekuvaan. Lisäksi selvitettiin, onko veri- ja imusuonten muodostumisessa eroa riippuen kasvaimen tyypistä (hyvänlaatuinen, rajatilakasvain tai munasarjasyöpäkasvain). Tutkimuksessa pyrittiin selvittämään, onko suonten määrällä merkitystä taudin kliinisiin piirteisiin. Tarkoituksena oli myös vertailla kahta eri värjäystä, CD34:ää ja CD105:tä, ja saada vastaus kysymykseen, onko CD105 parempi verisuonimerkkiaine munasarjakasvaimissa kuin CD34.

17 4.2 Aineisto ja menetelmät Aineistona tutkimuksessa käytettiin munasarjakasvainnäytteitä, jotka on otettu Kuopion yliopistollisessa sairaalassa munasarjakasvaimen vuoksi hoidossa olleilta potilailta vuosina 1999 2007. Kaikki tutkimuksen potilaat olivat allekirjoittaneet suostumuslomakkeen tutkimukseen ja tutkimuksella on Pohjois-Savon sairaanhoitopiirin tutkimuseettisen toimikunnan puoltava lausunto (lausunnon lupanumero 26/99). Yhteensä näytteitä oli 139 kappaletta. Näytteet otettiin leikkauksen yhteydessä. Patologi tutki näytteet, ja ne luokiteltiin kolmeen ryhmään diagnoosin perusteella: hyvänlaatuiset kasvaimet (n = 36), rajatilakasvaimet (n = 17) sekä munasarjasyövät (n = 86). Kasvaimet luokiteltiin myös histologisen alatyyppinsä mukaan. Kaikki munasarjasyöpäpotilaat saivat platinapohjaisen solunsalpaajahoidon. Tiedot potilaista on koottu taulukoihin 2 ja 3. Näytteet leikattiin ja kiinnitettiin laseille. Näytteiden verisuonten värjäys tehtiin immunohistokemiallisella CD34-värjäyksellä (hiiren monoklonaalinen vasta-aine CD34, Vectastain Elite kit, Dako, Glostrup, Tanska, laimennos 1:500) ja CD105-värjäyksellä (hiiren monoklonaalinen vasta-aine CD105, Biocare Mach 1 kit, laimennos 1:90). Imusuonten värjäykseen käytettiin D2-40-vasta-ainetta (hiiren monoklonaalinen vasta-aine D2-40, Vectastain Elite kit, Dako, Glostrup, Tanska, laimennos 1:200). Tulosten analysointiin käytettiin SPSS Statistics 19 -ohjelmaa. Eroja tutkittiin Kruskall- Wallis-testillä ja Mann-Whitney-testillä. Kliinis-patologisten riippuvuuksien tutkimista varten muuttujat jaettiin kahteen luokkaan mediaanin avulla, ja frekvenssitaulukoiden analysointiin käytettiin Chi-Square-testiä. Muuttujien vaikutusta tautivapaaseen aikaan ja selviytymiseen tutkittiin Kaplan-Meierin testillä. Taulukko 2. Potilasaineisto. Taulukon arvot n (%) Hyvänlaatuiset Rajatilakasvaimet Syöpäkasvaimet kasvaimet Yhteensä 36 (100) 17 (100) 86 (100) Ikä diagnoosihetkellä, 56 [16 92] 66 [20 92] 58 [29 88] mediaani (vuosia) Histologinen alatyyppi Seroosi 21 (58) 11 (65) 51 (59)

18 Musinoosi 15 (42) 6 (35) 11 (13) Endometrioidikarsinooma 15 (17) Kirkassolukarsinooma 5 (6) Taulukko 3. Kliinis-patologiset tiedot munasarjasyöpäpotilaista Munasarjasyöpä n (%) Yhteensä 86 (100) Askites Kyllä 59 (69) Ei 16 (19) Ei tiedossa 11 (13) Erilaistumisaste 1 (erilaistunut) 14 (16) 2 (kohtalaisesti erilaistunut) 31 (36) 3 (erilaistumaton) 41 (48) Levinneisyys I 12 (14) II 10 (12) III 46 (53) IV 18 (21) Etäpesäkkeet imusolmukkeissa Kyllä 5 (6) Ei 22 (26) Ei tiedossa 59 (69) Jäännöskasvain Ei jäännöskasvainta 40 (47) </= 1 cm 8 (9) > 1 cm 38 (44) Vaste solunsalpaajahoitoon Täydellinen vaste 57 (66)

19 Osittainen vaste 4 (5) Vakaa tilanne 2 (2) Etenevä tauti 5 (6) Ei solunsalpaajahoitoa 5 (6) Ei tiedossa 13 (15) Taudin uusiutuminen Ei uusiutunut 25 (29) Uusiutunut 42 (49) Ei tiedossa 19 (22) Potilaan tila Elossa 37 (43) Kuollut, munasarjasyöpä 46 (53) Kuollut, muu syy/ei tietoa 3 (3) Seuranta-aika, mediaani (kuukausia) 61 [0 168] 4.3 Oma osuus Tehtävänäni oli katsoa kaikki näytteet mikroskoopilla ja etsiä jokaisesta kolme kohtaa, joissa suonia oli eniten. Näistä hot spoteista otettiin kuvat suurennoksella 200 x (Salvesen ym. 2003, Solomon ym. 2006, Yang ym. 2009). Kaikki CD34-, CD105- ja D2-40-värjätyt näytteet tutkittiin mikroskoopilla samalla tavalla. Nekroottisia alueita ei otettu mukaan kuviin. Kuvista laskettiin suonet analyysiohjelmalla, jolloin saatiin suonten tiheys (MVD ja LVD), pinta-ala (µm 2 ) ja osuus (%) kasvaimesta. Näytteet kuvattiin käyttäen Olympus AX70 -mikroskooppia (Olympus Optical, Japan) ja analysoitiin analysis-ohjelmalla (Soft Imaging System, GmbH, Germany). 4.4 Tulokset 4.4.1 Veri- ja imusuonten ominaisuuksien merkitys munasarjakasvaimen laatuun CD34-värjätyissä näytteissä löytyi eroja erityyppisten kasvainten välillä (Kuva 1). Hyvänlaatuisten ja rajatilakasvainten verisuonten keskikoko ja prosenttiosuus kasvaimesta erosivat tilastollisesti merkitsevästi siten, että rajatilakasvainten verisuonet olivat isompia (p =

20 0,001, hyvänlaatuisilla keskikoko 213,13 ± 20,03 ja rajatilakasvaimilla 414,25 ± 54,75) ja niiden prosenttiosuus kasvaimesta oli suurempi (p < 0,001, hyvänlaatuisilla prosenttiosuus 4,59 ± 0,54 ja rajatilakasvaimilla 8,57 ± 0,77) (Kuva 2 A, 2 C). Verisuonten tiheydessä (verisuonia/mm 2 ) tai suonten lukumäärässä ei ollut merkitsevää eroa hyvänlaatuisten ja rajatilakasvainten välillä. CD34-värjätyissä syöpänäytteissä suonten tiheys (340,69 ± 18,58), prosenttiosuus (8,32 ± 0,42) ja lukumäärä (142,99 ± 7,91) olivat selvästi suurempia verrattuna hyvänlaatuisista kasvaimista otettuihin näytteisiin (tiheys 232,55 ± 20,35, prosenttiosuus 4,59 ± 0,54 ja lukumäärä 92,54 ± 7,70, kaikkien p < 0,001) (Kuva 2 B D). Lisäksi syöpäkasvainten verisuonten keskikoko (291,82 ± 19,89) oli suurempi kuin hyvänlaatuisissa kasvaimissa (213,13 ± 20,03, p = 0,044) (Kuva 2 A). CD34-näytteissä syöpäkasvaimissa oli suurempi verisuonitiheys (340,69 ± 18,58) ja suonten lukumäärä (142,99 ± 7,91) kuin rajatilakasvaimissa (tiheys 255,39 ± 39,84, lukumäärä 108,59 ± 17,41, p = 0,010) (Kuva 2 B ja 2 D). CD105-värjätyissä näytteissä syöpäkasvainten verisuonitiheys oli tilastollisesti merkitsevästi suurempi (42 %) kuin rajatilakasvaimissa (p = 0,046) ja huomattavasti suurempi (79 %) kuin hyvänlaatuisissa kasvaimissa (p < 0,001) (Kuva 2 F). Lisäksi verisuonia oli 45 % enemmän syöpäkasvaimissa kuin rajatilakasvaimissa (p = 0,036) ja kaksinkertainen määrä verrattuna hyvänlaatuisiin kasvaimiin (p < 0,001) (Kuva 2 H). 4.4.2 Munasarjasyövän erilaistumisaste Verisuonivärjäyksissä ei havaittu yhteyttä kasvaimen erilaistumisasteeseen. Kaksiluokkaisessa erilaistumisen jaottelussa (gradus 1 ja gradus 2 3) suuri imusuonten tiheys liittyi kasvaimen huonoon erilaistumisasteeseen (p = 0,044), samoin kolmiluokkaisessa jaottelussa (p = 0,01). Kaksiluokkaisessa jaottelussa (seroosit syöpäkasvaimet ja muut syöpäkasvaimet) imusuonten suuri määrä ei liittynyt yhtä vahvasti kasvaimen heikompaan erilaistumisasteeseen, mutta jonkinlainen yhteys saattaa olla (p = 0,073). Jatkuvia muuttujia käytettäessä imusuonten suuri tiheys ja lukumäärä kuitenkin merkitsivät kasvaimen huonompaa erilaistumista (p = 0,002 ja p = 0,035). 4.4.3 Munasarjasyövän levinneisyys Verisuonten prosenttiosuus kasvaimesta korreloi syövän levinneisyyteen CD105- värjätyissä näytteissä. Korkea prosenttiosuus liittyi levinneisyysluokkaan III, p = 0,040.

21 Lisäksi imusuonten korkea prosenttiosuus kasvaimessa ennusti merkittävästi runsaampaa etäpesäkkeiden muodostumista imusolmukkeisiin (p = 0,008). 4.4.4 Munasarjasyövän histologinen tyyppi Imusuonten prosenttiosuus kasvaimesta oli yhteydessä kasvaimen histologiseen tyyppiin, kun kasvaimet luokiteltiin kahteen luokkaan: seroosit syöpäkasvaimet ja muut syöpäkasvaimet. Serooseissa kasvaimissa imusuonten prosenttiosuus (5,32 ± 0,38) oli keskimäärin suurempi (p = 0,01) kuin muissa syöpäkasvaimissa (3,87 ± 0,39). Imusuonilla ei ollut merkitystä, kun verrattiin keskenään hyvänlaatuisia, rajatila- ja syöpäkasvaimia (Kuva 2 I L). 4.4.5 Jäännöskasvaimen koko CD34-värjätyissä näytteissä verisuonten suuri prosenttiosuus kasvaimesta oli yhteydessä isompaan jäännöskasvaimeen (> 1 cm), p = 0,003. Myös jatkuvalla muuttujalla saatiin samanlainen tulos: suuri prosenttiosuus korreloi isompaan jäännöskasvaimeen (p = 0,001). CD105-värjätyissä näytteissä ei havaittu yhteyttä verisuonten tiheyden, koon tai prosenttiosuuden ja jäännöskasvaimen koon välillä. Sen sijaan suuri verisuonten lukumäärä liittyi isompaan jäännöskasvaimeen (> 1 cm) (p = 0,012). Jatkuvia muuttujia käytettäessä verisuonten suuri tiheys ja erityisesti lukumäärä ennustivat kookkaampaa jäännöskasvainta (p = 0,057 ja p = 0,022). 4.4.6 Munasarjasyöpäpotilaiden taudin uusiutuminen, tautivapaa-aika ja kokonaiselinaika Potilaiden seuranta-ajan mediaani oli 61 kuukautta (vaihteluväli 0 168 kuukautta). Seuranta-ajan lopussa 49 (57 %) potilaista oli kuollut. Tautivapaa-ajan tutkimiseen kuului 67 potilasta, joista 37 %:lla tauti oli uusiutunut. Keskimääräinen tautivapaa-aika oli 20 ± 13 kuukautta (keskiarvo + keskihajonta). Verisuonten suuri tiheys CD34-värjätyissä näytteissä ennusti pidempää tautivapaata aikaa Kaplan-Meier-testissä (p = 0,036), samoin suonten suuri lukumäärä (p = 0,020). Toisaalta verisuonten suuri keskikoko CD34-näytteissä merkitsi lyhempää tautivapaa-aikaa (p = 0,031). Verisuonituksella ei havaittu olevan merkitystä kokonaiselinaikaan CD34- värjäyksissä.

22 Verisuonten ominaisuuksilla ei ollut merkitsevää vaikutusta tautivapaa-aikaan tai kokonaiselinaikaan CD105-värjäyksissä. Suunta oli kuitenkin selvä: mitä runsaammin verisuonia oli, sitä lyhempi oli tautivapaa-aika. Vain imusuonilla oli merkitystä kokonaiselinaikaan siten, että pienet imusuonet huononsivat ennustetta. Imusuonten ominaisuuksilla ei ollut merkitystä tautivapaa-ajan pituuteen. Imusuonten suuri lukumäärä ja tiheys kuitenkin kertoivat taudin todennäköisemmästä uusiutumisesta Kruskal-Wallis-testissä (p = 0,042 ja p = 0,013). Kuva 1. Veri- ja imusuonet histologianäytteissä. CD34-värjätyissä näytteissä verisuonia oli enemmän syöpäkasvaimissa (C) kuin rajatilakasvaimissa (B) tai hyvänlaatuisissa kasvaimissa (A). Myös CD105-värjätyissä näytteissä verisuonitus oli runsaampaa syöpäkasvaimissa (F) kuin rajatilakasvaimissa (E) tai hyvänlaatuisissa kasvaimissa (D). Imusuonten prosenttiosuus kasvaimesta oli suurempi serooseissa syöpäkasvaimissa (G) kuin muun histologisen tyypin syöpäkasvaimissa (H, I; musiini karsinooma, endometrioidikarsinooma).

23 Kuva 2. Veri- ja imusuonten ominaisuuksien merkitys munasarjakasvaimen laatuun. Syöpä- ja rajatilakasvaimissa oli keskimäärin isompia verisuonia kuin hyvänlaatuisissa kasvaimissa CD34-näytteissä (A). Myös verisuonitiheys ja prosenttiosuus kasvaimesta olivat suurempia syöpä- ja rajatilakasvaimissa verrattuna hyvänlaatuisiin kasvaimiin CD34- värjäyksissä (B, C). CD105-värjätyissä näytteissä syöpäkasvaimissa oli suurempi verisuonitiheys kuin rajatilakasvaimissa tai hyvänlaatuisissa kasvaimissa (F). Verisuonia oli lukumäärällisesti enemmän syöpäkasvaimissa kuin rajatilakasvaimissa tai hyvänlaatuisissa kasvaimissa CD105-värjäyksissä (H). CD105-värjäyksissä verisuonten keskikoolla tai prosenttiosuudella ei ollut yhteyttä kasvaimen laatuun (E, G). Imusuonivärjäyksissä ei löytynyt eroja erityyppisten kasvainten välillä (I, J, K, L). 5 POHDINTA Tutkimuksen tarkoitus oli tarkastella veri- ja imusuonten määrää ja ominaisuuksia erityyppisissä munasarjasyöpäkasvaimissa ja tutkia, löytyykö niistä eroja. Lisäksi haluttiin vertail-

24 la kahta erilaista verisuonien värjäysmenetelmää, CD34 ja endoglin eli CD105. Ne eroavat toisistaan siten, että endoglinin on havaittu värjäävän erityisesti uudisverisuonia, kun taas CD34 tarttuu sekä uusiin että vanhoihin verisuoniin (Cwiklinska ym. 2013). Tarkoitus oli tutkia, olisiko endoglin siten parempi verisuonimerkkiaine munasarjasyövän taudin laadun ennustamisessa kuin CD34. Tulokset yhdistettiin tutkimuksessa olleiden potilaiden tietoihin heidän sairautensa laadusta ja selviytymisestä. Tutkimukseen valittiin potilaita, joilla oli epiteliaalinen munasarjakasvain, koska ne ovat yleisimpiä munasarjakasvaimia. Angiogeneesiä on tavallisesti mitattu etsimällä näytteestä edustavat, runsaasti verisuonia sisältävät kohdat eli hot spotit ja määrittämällä MVD-arvo (He ym. 2015, Rubatt ym. 2009). Niin tehtiin myös tässä tutkimuksessa. Valittujen hot spottien lukumäärä tutkimuksissa vaihtelee yhdestä (Taskiran ym. 2006) jopa kymmeneen (Salvesen ym. 2003). Kolme hot spottia valittiin Raspollinin ym. (2005) ja Rubattin ym. (2015) tutkimuksissa, ja niin myös tässä tutkimuksessa. Tutkimuksessamme käytettiin suurennosta 200 x, kuten on käytetty aikaisemmissakin tutkimuksissa (Taskiran ym. 2006, Ogawa ym. 2002). Tutkimuksessa havaittiin, että syöpäkasvainten verisuonitiheys oli suurempi verrattuna rajatilakasvaimiin ja erityisesti hyvänlaatuisiin kasvaimiin, kun värjäykseen käytettiin endoglinia. CD34-vasta-aineella saatiin samankaltaiset tulokset, joten tällä tutkimuksella ei voida osoittaa, että toinen näistä merkkiaineista olisi parempi kuin toinen. Tulosten perusteella voidaan kuitenkin sanoa, että angiogeneesi on runsaampaa pahanlaatuisissa kuin hyvänlaatuisissa kasvaimissa molemmilla värjäyksillä. Samanlaisia tuloksia on saatu myös muissa tutkimuksissa (He ym. 2015, Jacquemier ym. 1998). Usein korkea MVD on yhdistetty lyhempään tautivapaa-aikaan (He ym. 2015, Jacquemier ym. 1998). Joissakin tutkimuksissa taas korkea kasvaimen verisuonitiheys on merkinnyt pidempää tautivapaa-aikaa. Ogawan ym. (2002) tutkimuksessa korkea MVD liittyi pidempään tautivapaa-aikaan luokan I-II taudissa, ja ainoastaan kirkassolukarsinoomissa. Muissa histologisissa tyypeissä ei nähty yhteyttä MVD:n ja ennusteen välillä, eikä taudin edenneessä vaiheessa (III-IV) MVD:lla ollut merkitystä. Meidän tutkimuksessamme korkea MVD merkitsi pidempää tautivapaa-aikaa CD34-värjäyksissä. Endoglin-värjäyksissä suuntaus oli päinvastoin niin, että korkeampi MVD liittyi huonompaan ennusteeseen, vaikka merkitsevää tulosta ei saatu. Verisuonten ominaisuuksien vaikutuksesta tautivapaaseen aikaan saatiin siis ristiriitaisia tuloksia. Niitä voisi selittää käytettyjen verisuonimerkkiaineiden eroavaisuuksilla. CD34-

25 värjätyissä näytteissä nähtiin merkitsevä yhteys verisuonten keskikoon ja tautivapaan ajan välillä niin, että pienet verisuonet ennustivat pidempää tautivapaata aikaa. Toisaalta verisuonten tiheyden ja lukumäärän suhteen havaittiin päinvastainen ilmiö: pieni tiheys ja vähäinen lukumäärä yhdistyivät lyhempään tautivapaa-aikaan. Voi olla, että CD34:llä mitattu runsas alkuperäinen verisuonitus sekä uudisverisuonet edesauttavat solunsalpaajien pääsyä syöpäkasvaimeen, jolloin vaste lääkkeelle on parempi ja tautivapaa-aika pitenee. Vanhoja ja toimivia verisuonia pitkin kasvain saisi myös runsaasti happea ja ravinteita kasvaakseen ja levitäkseen. Tämän tapaista selitystä on esitetty myös muissa tutkimuksissa (Chan ym. 2004). CD105-värjätyissä näytteissä verisuonten ominaisuuksilla ei ollut merkitsevää vaikutusta tautivapaa-aikaan. Suuntaus oli kuitenkin niin, että kasvaimen runsaampi verisuonitus kertoi keskimäärin huonommasta ennusteesta. Tätä voisi selittää CD105:n ominaisuus merkitä erityisesti juuri muodostuneet uudisverisuonet. Kasvaimen vilkas verisuonten muodostus voi kertoa sen aggressiivisuudesta ja pyrkimyksestä levitä. Toisaalta kasvaimen muodostamat verisuonet on havaittu poikkeavan normaaleista verisuonista. Suonet ovat pieniä, epäsäännöllisemmin järjestäytyneitä ja niiden seinämät ovat hatarampia. Syöpälääkkeet eivät välttämättä pääse vaikuttamaan kasvaimeen yhtä hyvin kuin normaaleja verisuonia pitkin. CD34:llä ja endoglinilla saadut erilaiset tulokset osoittavat, että ne mittaavat eri asioita: CD34 kaikkia, sekä alkuperäisiä että uudisverisuonia, kun taas endoglin mittaa ennemmin uudisverisuonia. Toista merkkiainetta ei voida tämän tutkimuksen perusteella nimetä toista paremmaksi munasarjasyövän ennusteen arvioinnissa. Taskiranin (2006) tutkimuksessa verrattiin endoglinia ja CD31-vasta-ainetta ja havaittiin, että endoglin olisi parempi itsenäinen tekijä ennustamaan lyhempää kokonaiselinaikaa. Endoglin todettiin paremmaksi lyhemmän kokonaiselinajan ennustamisessa myös Salvesenin (2003) kohdunrungon syövän tutkimuksessa, kun sitä verrattiin von Willebrand - tekijän vasta-aineeseen. Toisin kuin näissä tutkimuksissa, meidän tutkimuksessamme verisuonimerkkiaineilla ei saatu yhteyttä kokonaiselinaikaan. Imusuonet värjäävällä D2-40-merkkiaineella käsitellyissä näytteissä ei havaittu tilastollisesti merkitseviä eroja hyvänlaatuisten, rajatilakasvainten ja pahanlaatuisten kasvainten välillä. Imusuonten suuri tiheys syöpäkasvaimessa ennusti kuitenkin huonompaa erilaistumisastetta riippumatta kasvaimen histologisesta tyypistä. Lisäksi suuri imusuonten prosenttiosuus kasvaimesta ennusti suurempaa etäpesäkkeiden määrää imusolmukkeissa. Keski-

26 kooltaan pienet imusuonet ennustivat lyhempää kokonaiselinaikaa. Tämän tutkimuksen perusteella voidaan siis sanoa, että imusuonten suuri tiheys ja osuus syöpäkasvaimesta voidaan yhdistää potilaan huonompaan taudinkuvaan ja ennusteeseen. Muissa tutkimuksissa on saatu samanlaisia tuloksia: korkea LVD ennusti suurempaa etäpesäkkeiden määrää imusolmukkeissa ja lyhempää kokonaiselinaikaa (Kyzas ym. 2005). Kasvaimen läheisten imusuonien suuri tiheys ennusti todennäköisempää metastasointia imusolmukkeisiin useissa syövissä Raican ym. (2008) tutkimuksen mukaan. Tämän tutkimuksen etuna on sen laajuus. Muissa tutkimuksissa yleisesti käytetyn MVDarvon lisäksi tässä tutkimuksessa suonten ominaisuuksia tutkittiin myös muilla parametreilla, joita olivat suonten keskikoko, lukumäärä ja prosenttiosuus näytteestä. Samanaikaisesti verisuonten lisäksi tutkittiin imusuonten merkitystä taudin laatuun, mikä ainutlaatuista verrattuna muihin tutkimuksiin. Tutkimuksen rajoitteena voidaan pitää näytteiden arviointia ihmissilmällä. Tutkimusmenetelmänä käytetty hot spot -alueiden etsiminen näytteistä ja suonten laskeminen ei ole täysin virheetön. Se sisältää inhimillisen virheen mahdollisuuden, vaikka jokainen näyte pyrittiin tutkimaan samaa periaatetta käyttäen. Menetelmä on kuitenkin yleisesti hyväksytty ja käytetty useissa tutkimuksissa. Aineiston koko oli riittävä, mutta sitä edelleen kasvattamalla voisi tulosten luotettavuutta lisätä. Jatkossa olisi hyvä tutkia imusuonten merkitystä aineistossa, jossa suuremmalle osalle munasarjasyöpäpotilaista olisi tehty lymfadenektomia eli imusolmukkeiden poisto lantiosta ja para-aortaalialueelta. Lisäksi jatkossa voisi uudenlaisena lähestymistapana tutkia, onko uudisverisuonien prosenttiosuudella kaikista verisuonista (CD105/CD34) merkitystä. Tämän tutkimuksen perusteella munasarjakasvainnäytteiden verisuonten ominaisuuksia voitaisiin hyödyntää apuna munasarjakasvainten diagnostiikassa: sekä CD34- että CD105- värjäyksellä angiogeneesi oli korostunutta syöpäkasvaimissa verrattuna hyvänlaatuisiin munasarjakasvaimiin. Sen sijaan selkeitä tuloksia näiden kahden verisuonimerkkiaineen paremmuudesta ennustamaan munasarjasyöpäpotilaan tautivapaa- tai kokonaiselinaikaa ei pystytty toteamaan ja lisätutkimuksia tarvitaan. Imusuonten tiheyden ja osuuden mittaaminen kasvaimista vaikuttaa lupaavalle lisämenetelmälle munasarjasyövän leviämisen arvioinnissa, mutta laajempia tutkimuksia vaaditaan edelleen. Jatkossa munasarjasyöpään saattaa avautua vielä mahdollisuuksia tehokkaampiin, kasvaimen veri- ja imusuoniin kohdistuviin hoitoihin.