Rapurutto hallintaan

LOPPURAPORTTI Rapurutto hallintaan epidemiologian ja diagnostiikan verkostohanke Markku Pursiainen, Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos Satu Viljamaa-Dirks, Evira Jenny Makkonen, Harri Kokko Paula Henttonen, BT, KY ja Japo Jussila, Raputietokeskus Jyväskylä 12.06.2008

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 2 LOPPURAPORTTI Rapurutto hallintaan epidemiologian ja diagnostiikan verkostohanke Markku Pursiainen, Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos Satu Viljamaa-Dirks, Evira Jenny Makkonen, Harri Kokko Paula Henttonen, BT, KY ja Japo Jussila, Raputietokeskus Yleistä Keski-Suomen TE-keskus myönsi 15.6.2006 tekemällään päätöksellä Dnro 3441/3516/2005 määrärahan 100 000 euroa hankkeelle Rapurutto hallintaan epidemiologian ja diagnostiikan verkostohanke (hankenumero 525108). Verkostohankkeen osapuolina toimivat Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitos (koordinaattori), Evira, Kuopin tutkimusyksikkö ja Kuopion yliopiston Soveltavan biotekniikan instituutti, sittemmin Biotieteiden laitos. Hanketta ohjasi ohjausryhmä, joka kokoontui kaksi kertaa. Hankkeen tavoitteet ja osakokonaisuudet Hankkeen suunnitelmanmukaiset päätavoitteet olivat: 1) Selvitetään rapuruttotyyppien ja -kantojen ominaisuudet perinnöllisten erojen ja epidemiologisten ominaisuuksien perusteella. 2) Tutkitaan rapuruttoa täpläravussa, erityisesti ruton siirtymistä täplärapujen istutusmateriaalin mukana laitoksesta luonnonveteen. Varmistetaan uusin menetelmin, onko rutottomien täpläravun poikasten tuottaminen rutollisista emoista mahdollista irtohaudonnassa 3) Kehitetään parannettuja rapuruton diagnoositekniikoita ja testataan menetelmien toimivuus sekä validoidaan menetelmä. 4) Arvioidaan ravunviljelylaitosten sijoittumiseen liittyviä riskitekijöitä ja suunnitellaan (alustava) rapujen terveystarkkailuohjelma sekä raportoidaan hankkeen tulokset. Työnjako rakentui seuraaviin osa-alueisiin ja tehtäviin vetovastuutahoineen: 1a) Rapuruttotyyppien ja kantojen väliset perinnölliset erot SBI 1b) Rapuruton epidemiologiset ominaisuudet Evira 2a) Rapuruton siirtyminen täpläravussa SBI 2b) Näytteiden hankkiminen ja tuottaminen Evira, SBI, RKTL, Raputietokeskus 3a) Rapuruttotyypit erottelevien molekyylibiologisten menetelmien tuottaminen SBI 3b) Uusien diagnoosimenetelmien testaus ja validointi Evira 4) Terveystarkkailun suunnittelu Evira Tulostiivistelmät Väliotsikointi ja osakoodaus viittaavat osiokohtaiseen liitteinä oleviin loppuraportteihin (LIITTEET 1-6). Rapuruton epidemiologiset ominaisuudet (Osa E1, Evira, LIITE 1) Yleistä: Tässä loppuraportin osassa kuvataan Evirassa tehtyä arviointia eri rapuruttotyyppien ja kantojen välisistä eroista taudinaiheutuskyvyssä. Suomessa on todettu kahta eri genotyyppiä olevaa rapuruttoa, jokiraputyypin ja täpläraputyypin rapurutot. Niiden aiheuttamissa epidemioissa on havaittu eroja, joita haluttiin varmentaa kokeellisesti. Osio toteutettiin aikavälillä toukokuu 2006 kesäkuu 2007. Toteutus: Koetta varten testattiin rapuruttokantojen kasvunopeus elatusaineessa, koska kasvunopeudessa oli todettu eroja liittyen taudinkuvaan luonnonepidemioissa. Molemmista genotyypeistä valittiin kasvuno-

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 3 peudeltaan poikkeavat kannat, joilla suoritettiin altistuskoe olosuhteissa, joissa rapuruton on kuvattu aiheuttavan suhteellisen nopeasti koerapujen kuoleman. Tulokset: Keskimääräisessä kasvunopeudessa havaittiin merkittävä ero genotyyppien välillä, siten että täpläraputyypin kannat kasvoivat selvästi jokirapukantoja nopeammin. Altistuskokeessa täpläraputyypin kannat aiheuttivat nopean täydellisen kuolleisuuden. Jokirapukantojen aiheuttama kuolleisuus oli selkeästi hitaampaa, ja testatulla nopeakasvuisella jokirapukannalla ei eronnut kontrolliryhmän kuolleisuudesta. Johtopäätös: Taudinaiheutuskyvyn kokeellinen testaus vahvisti epäilyä siitä, että jokiraputyypin rapuruttokannat ovat täpläraputyyppiä heikompia taudinaiheuttajia ja voivat siksi elää pitkään jokiravussakin. Sen sijaan pelkkä kasvunopeus ei ennusta taudinkulun nopeutta ja muiden virulenssitekijöiden vaikutusta on selviteltävä erillisellä tutkimuksella. Rapuruttodiagnostiikka (Osa E2, Evira, LIITE 2) Yleistä: Tässä loppuraportin osassa kuvataan Eviran tavoitteena olleen rapuruton tautidiagnostiikan ja rapuruton kantajadiagnostiikan testaamista. Osio toteutettiin aikavälillä toukokuu 2007 joulukuu 2007. Toteutus: Pikadiagnostiikkaan käytetään reaaliaikaista PCR-menetelmää, joka on kehitetty Norjassa. Erilaisia kuorenkäsittelytapoja DNA:n tehokkaaksi eristämiseksi testattiin taudinaiheutuskokeesta saaduilla positiivisilla näytteillä. Kliinisiä näytteitä testattiin tautidiagnostiikan luotettavuuden toteamiseksi. Taudinkantajanäytteitä tuotettiin erillisellä, alhaisella itiöpitoisuudella toteutetulla altistuskokeella. Tulokset: Reaaliaikainen PCR- menetelmä antoi yhtenevät tulokset kaikista testatuista, eristyksellä varmennetuista tautinäytteistä. Taudinkantajien tuottaminen kokeella epäonnistui siinä mielessä, että osa ravuista sairastui kliiniseen tautiin. Myös tulokset altistettujen rapujen testauksesta olivat jonkun verran ristiriitaiset. Johtopäätös: Reaaliaikainen PCR- menetelmä voidaan ottaa käyttöön tautitapausten varmistamiseksi, jolloin aikaa vievää ja vaativaa viljelyä ei välttämättä tarvita. Yksittäisiä epäspesifisiä heikkoja positiivisia tuloksia, sekä joitakin virhenegatiivisia saatiin kantajatutkimuksessa, joten sitä täytyy edelleen testata. Menetelmä saadaan oireettomien rapujen tutkimiseksi käyttöön todennäköisesti vuoden 2008 aikana. Rapuruton siirtyminen emoista poikasiin: rapunäytteiden diagnosointi (Osa E3, Evira LIITE 3) Yleistä: Tässä loppuraportin osassa kuvataan Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitoksen (RKTL) toteuttaman täpläraputestauksen laboratoriodiagnostiikan osuus. Hankeosion tavoitteena oli tutkia rapuruton siirtymistä emoista jälkeläisiin viljelyoloissa. Osio toteutettiin aikavälillä helmikuu 2007 joulukuu 2007. Toteutus: Kokeisiin valittujen täplärapuemojen ruttotartunta varmistettiin eristämällä rapurutto ja tyypittämällä eristetyt kannat. Parittelun ja muninnan jälkeen naaraiden mädistä irrotettiin noin kaksi kolmannesta, joka määrä edelleen puolitettiin haudottavaksi kylvetysryhmään (Betadine 25 ja 50 ppm) ja kylvettämättömään ryhmään. Tässä vaiheessa mäti tutkittiin reaaliaikaisella PCR-menetelmällä. Huhti - toukokuun vaihteessa kuoriutuneet poikaset tutkittiin molemmista irtohaudotetuista ryhmistä sekä emojen alta reaaliaikaisella PCRmenetelmällä. Näytteenä käytettiin kokonaisia poikasia, 30-48 rapua ryhmästä. Elokuun lopussa poikasryhmät tutkittiin uudelleen. Tällöin näytteenä käytettiin poikasten vatsakilpeä, näytemäärä oli 26 rapua kustakin ryhmästä. Tulokset: Kokeen emoravut todettiin täpläraputyypin rapuruton kantajiksi. Reaaliaikaisella PCRmenetelmällä todettiin emojen mätimunissa rapuruton DNA:ta. Rapuruton DNA:ta todettiin pieni määrä myös emojen pyrstön alle jätetystä mädistä kuoriutuneista vastakuoriutuneista poikasista. Muissa poikasryhmissä rapurutto-dna:ta ei todettu. Tulosta vahvisti kesänvanhoista poikasista otettu uusintanäyte, jossa emojen alla kuoriutuneista poikasista saatiin useita positiivisia tuloksia, muiden ryhmien pysyessä edelleen kielteisinä. Johtopäätös: Rapuruton luonnollinen siirtyminen täplärapuemoista poikasiin varmistui. Irtohaudonta näyttäisi mahdollistavan rutottomien poikasten tuottamisen. Näytekoot olivat kuitenkin niin pieniä, että niiden perusteella ei voi vielä tehdä lopullista johtopäätöstä.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 4 Ravunviljelylaitosten terveystarkkailun mahdollisuudet (Osa E4, Evira, LIITE 4) Yleistä: Tässä loppuraportin osassa kuvataan ravunviljelylaitoksille asetettavia uusia vaatimuksia rapujen terveydenhuollon suhteen, sekä mahdollisuuksia rapuruton hallintaan terveydenhuollon keinoin. Yhteenveto: Ravunviljelyyn kohdistuu uusia vaatimuksia pohjautuen uuteen Euroopan Unionin Vesieläinten terveysdirektiiviin, joka astuu voimaan 1.8.2008. Ravunviljelylaitokset tulevat tarvitsemaan terveysluvan toimintaansa varten. Terveyslupa myönnetään laitoksille toiminnan, rakenteiden ja terveysomavalvonnan kuvauksen perusteella, edellytyksenä että laitoksen toiminta ei aiheuta tautien leviämisen vaaraa. Viranomaisvalvonta kohdistuu äyriäisten valkopilkkutautiin, valvonnan tasoa ei ole vielä määritelty. Omavalvonnan avuksi tarjottavaa rapujen terveydenhuoltoa varten Evira uudistaa Kalaterveyspalveluaan myös ravunviljelyyn soveltuvaksi vuoden 2008 aikana. Terveydenhuollon kautta on mahdollista tarjota viljelijän tarvitsemia tautidiagnostiikkapalveluja. Ennen kaikkea terveydenhuolto mahdollistaa rapuruton suhteen tutkittujen istukkaiden markkinoinnin. Suomalaisten rapuruttokantojen erot ja erotusdiagnostiikka sekä rapuruton siirtyminen täplärapuemoista poikasiin (Osa K, Kuopion yliopisto, Biotieteiden laitos, LIITE 5) Jenny Makkonen, Harri Kokko, Paula Henttonen (BT, KY) ja Japo Jussila (Raputietokeskus) Tavoitteet: Tavoitteena oli tutkia valikoitujen rapuruttokantojen perinnöllisiä eroja ja samalla selvittää täpläraputyypin (Ps1) ja jokiraputyypin (As) rapuruton oleellisia eroja ja näihin tuloksiin perustuen kehittää rapuruttotyypeille (As ja Ps1) spesifinen PCR (Polymerase Chain Reaction) -diagnostiikka. Lisäksi tutkittiin rapuruton siirtymistä irtohaudonnalla tuotetuissa poikasissa, joiden emot olivat rapuruton kantajia. Vertaamalla keskenään rapuruttoisista emoista eri haudontamenetelmin tuotettuja poikasia pyrittiin hankkimaan tietoa rapuruton siirtymisestä täplärapuemosta poikaseen. Suomalaisten rapuruttokantojen erot ja erotusdiagnostiikka: Rapuruton perinnöllisiä eroja tutkittiin kolmelta alueelta rapuruton genomista. Rapuruttotyyppien erotusdiagnostiikan kehityksen mahdollistavia geneettisiä eroja löytyi kitinaasigeeniä koodaavalta alueelta. Kitinaasigeenistä löydettiin useita As- ja Ps1- tyypin rapurutot erottavaa kohtaa. Lisäksi havaittiin, että Etelä-Euroopassa rapuruttoinfektioita aiheuttava Procambarus-tyypin rapurutto oli kitinaasigeenin perusteella selkeästi samankaltainen Astacus-tyypin rapuruton kanssa. Löydettyjen geneettisten erojen pohjalta kehitettiin rapuruttotyyppien välille kitinaasigeenin suoraan PCRmonistukseen perustuva erotusdiagnostiikka. Uuden menetelmän avulla rapuruttotyypit on mahdollista tunnistaa suoraan ravun kuoresta tai maljalle kasvaneesta mikrobien sekakasvustosta eikä puhdasviljelmä ole enää välttämätön tyypin määritykseen. Rapuruton siirtyminen täpläravussa: Rapuruton siirtymistä täpläravussa tutkittiin RKTL:n tuottamista täplärapunäytteistä hyödyntäen hankkeessa kehitettyä kitinaasi-pcr -menetelmää. Täpläravun munista sekä vastakuoriutuneista (VK) ja kesänvanhoista (1K) -poikasista eristettiin DNA Evirassa. Evira ja Kuopion yliopisto analysoivat samat mätimuna- ja poikasnäytteet, emonäytteiden osalta käytössä olivat eri täplärapuyksilöt. Kaikki Kuopion yliopistossa tutkitut täplärapuemot olivat rapuruton kantajia. Myös kaikista tutkituista mätimunanäytteistä löytyi rapuruttoinfektio. Lisäksi kitinaasi-pcr antoi rapurutolle positiivisia signaaleja myös VK-poikasista sekä 1K-poikasista kaikista tutkituista ryhmistä. Sekvensointituloksella pystyttiin varmistamaan Ps1-tyypin rapuruttoinfektio VK-poikasista (kylvettämätön hemputin) ja 1K-poikasista (emon alla haudotut poikaset), joten ainakaan irtohaudonnan yksinään ei havaittu estävän rapuruton siirtymistä täpläravun poikasiin tässä koejärjestelyssä ja käytetyillä tutkimusmenetelmillä. Johtopäätökset: As ja Ps1 rapuruttotyyppien väliltä löydetyt erot kitinaasigeeneissä mahdollistivat uuden erotusdiagnostiikan ja lisäksi selittävät osaltaan havaintoja eri rapuruttotyyppien erilaisesta käyttäytymisestä infektion yhteydessä. Kehitettyä rapuruttotyyppien erotusdiagnostiikkaa voidaan jatkossa hyödyntää entistä nopeammassa ja varmemmassa taudin osoituksessa. Menetelmä toimii ainakin akuuteissa infektioissa. Lisäksi täplärapunäytteiden osalta voidaan todeta, että ainakaan pelkkä irtohaudonta ei näyttäisi estävän rapuruton siirtymistä täpläravun poikasissa.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 5 Rapuruton siirtyminen emoista poikasiin: haudonta ja poikastuotantovaiheet (Osa R, RKTL, LIITE 6) Yleistä: Tässä loppuraportin osassa kuvataan Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitoksen (RKTL) hoidossa olleen hankeosion toteutuksen. Hankeosion tavoitteena oli tuottaa rapuruttoa sairastavien täplärapuemojen mätiä ja poikasia viljelyoloissa erilaisin käsittelyin. Osio toteutettiin aikavälillä syyskuu 2006 elokuu 2007. Toteutus: Kokeisiin valittiin emoravut varmuudella ruton tartuttamista populaatioista. Parittelun ja muninnan jälkeen naaraiden mädistä irrotettiin noin kaksi kolmannesta, joka määrä edelleen puolitettiin haudottavaksi kylvetysryhmään (Betadine 25 ja 50 ppm) ja kylvettämättömään ryhmään. Emoihin jätetty kolmannes mädistä sai hautoutua luonnollisella tavalla pyrstön alla. Haudontavaiheessa kunkin naaraan mätierät pidettiin jäljitettävästi erillään. Haudonta-aikaa nopeutettiin lämmittämällä. Huhti - toukokuun vaihteessa kuoriutuneet poikaset kasvatettiin omissa haudontakäsittelyryhmissään elokuun loppuun. Emoravuista, mätiryhmistä ja poikasista toimitettiin suunnitelman mukaiset näytteet Eviraan ja näytteitä myös SBI:lle. Tulokset: Koejärjestelyt ja kokeen läpivienti aikatauluineen onnistuivat suunnitellulla tavalla. Kokeen kaikki emoravut olivat rapuruton kantajia. Ruttoa ilmentävien melanisaatiotäplien määrä kasvoi emojen pituuden myötä, ja samalla suhteellinen emokohtainen mätimäärä pieneni ja jäljellä olevan mädin laatu heikkeni. Haudontatulos irrotetulla mädillä vastasi normaalia viljelyn tulosta, noin 50 % mädistä säilyi hengissä kuoriutumiseen saakka. Kuolleisuudessa ei ollut eroa kylvetetyn ja kylvettämättömän mätiryhmän välillä. Johtopäätös: Akuutti, täpläravuilla kuolleisuutta viljelyolosuhteissa aiheuttava rapurutto vaikuttaa merkittävästi emorapujen kykyyn tuottaa jälkeläisiä. Emoista, mädistä ja vastakuoriutuneista sekä kesänvanhoista poikasista tehtyjen rapuruttodiagnoosien tuloksista raportoivat Evira ja SBI omissa tutkimusosioissaan. Tulosarviointi Hankkeen hakemusasiakirjoissa (hanketiivistelmä) todettiin arvioitaessa hankkeen innovatiivisuutta ja soveltamiskelpoisuutta sekä odotettavissa olevaa vaikuttavuutta seuraavasti: Hanke tähtää rapuruttotyyppien ja -kantojen ominaisuuksien selvittämiseen ja rapuruttodiagnostiikan tehostamiseen. Yhteisiä tavoitteita eri hankeosioilla ovat mm. rapujen terveydentilan seurannan helpottaminen rapuruton osalta sekä ravunviljelylaitosten toimintamallien parantaminen rapuruton torjumisessa. Tämän arvioidaan parantavan valmiuksia löytää rapuruton taudinkantajia oireettomista yksilöistä ja siten vähentävän ruton siirtämisriskejä esim. istutusmateriaalin mukana, ja toisaalta turhia istutuksia ns. kroonisiin ruttovesiin voidaan vältää Kokonaisuutena hanke eteni suunnitellulla tavalla ja edellä olevien tiivistelmien ja tarkemmin liitteinä olevien loppuraporttien perusteella tulokset vastaavat hyvin suunnitteluvaiheessa arvioituja näkökohtia. Hankkeen vaikuttavuusarviointilomake on liitteenä (LIITE 7) Talousselvitys Hankkeen talousarvio päätyi loppusummaan 100 000, jonka käyttö jakautui seuraavasti: Osapuoli Kustannusarvio Käyttö/laskutus Ali-/ylijäämä RKTL 13 507 13 509,00-2,00 Evira 40 900 40 192,70 707,30 SBI 45 593 45 593,00 0,00 Yhteensä 100 000 99 294,70 705,30 Koordinaattori (RKTL) on maksanut osapuolille edellä olevan mukaiset summat ja toimittanut maksatushakemukset liiteasiakirjoineen rahoittajalle, joka on suorittanut niiden mukaiset maksut RKTL:lle. Hankkeen talousraportti on liitteenä (LIITE 8).

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 6 Keskeiset johtopäätökset ja ehdotuksia jatkotoimiksi Hankkeessa selvitettiin rapuruton eri kantojen ominaisuuksia ja todettiin selkeitä eroja sekä epidemiologiassa että ruttokantojen perimässä. Eroja ilmeni rapuruton geneettisten ryhmien välillä ja myös niiden sisällä. Erot kitinaasigeenissä mahdollistivat PCR- menetelmään perustuvan erotusdiagnostiikan kehittämisen. Havaittujen erojen tutkimusta täytyy vielä jatkaa, jotta rapuruttoepidemioiden ennustettavuutta voitaisiin edelleen parantaa. Heikosti tautia aiheuttavien rapuruttokantojen käyttäytymistä luonnonkannoissa on selvitettävä tunnettujen kroonista rapuruttotartuntaa kantavien jokirapupopulaatioiden seurannalla. Myös täplärapujen rapuruttotartuntoja on syytä selvittää. Rapuruton todellisen levinneisyyden selvittämiseksi tarvittaisiin laajaa kartoitustyötä, jonka tulisi kohdistua erityisesti niihin vesistöihin, joissa toistuvia rapuruttoepidemioita on kuvattu. Tällaisen kartoitustyön olennainen edellytys on luotettava taudinkantajadiagnostiikka. Nyt testattujen PCR -menetelmien toimivuutta lievästi infektoituneiden rapujen löytämiseen täytyy vielä varmentaa perusteellisemmalla validointimenettelyllä. Tämä on tarkoitus toteuttaa yhteistyössä menetelmän kehittäneen norjalaisen instituutin kanssa alkaen syksyllä 2008. Varsinaista rapuruton tautidiagnostiikkaa saatiin jo parannettua tämän projektin puitteissa, niin että lopullinen vahvistus diagnoosille voidaan saada jo parin päivän sisällä käyttäen eri PCR- menetelmiä. Kehitetyllä uudella kitinaasi-pcr -menetelmällä myös taudin aiheuttavan kannan tyypitys voidaan tehdä, vaikka rapuruton eristäminen ei onnistuisikaan. Genotyypit erottelevan menetelmän käyttökelpoisuutta taudinkantajien diagnostiikassa täytyy edelleen testata. Täpläravuilla suoritetussa rapuruton emoista poikasiin siirtymisen tutkimuksessa todettiin rapuruttotartunta jo vastakuoriutuneissa poikasissa, mikäli ne kuoriutuivat luonnollisella tavalla emon pyrstön alla. Emoista irrotetuista munista kuoriutuneista poikasryhmistä saatiin ristiriitaisia tuloksia käytetyillä kahdella eri PCR-menetelmällä, joten irtohaudonnan käyttökelpoisuutta rutottomien poikasten tuottoon on vielä tutkittava, mikäli mahdollista suuremmat poikasryhmät ja pidempiaikaisen seurannan mahdollistavan kenttäkokeen avulla. Raputautien, erityisesti rapuruton, perustutkimukseen ja rapujen terveydenhuollon suunnitteluun ja toteuttamiseen tarvitaan edelleen monipuolista panostusta. Liitteet LIITE 1 LIITE 6: LIITE 7: LIITE 8: Hankeosioiden loppuraportit Hankkeen arviointilomake (toimitettu rahoittajalle erillisenä) Talousselvitys (toimitettu rahoittajalle erillisenä)

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 7 LOPPURAPORTTI: OSA E1 (Evira, Kuopion tutkimusyksikkö) HANKEOSIO: Rapuruton epidemiologiset ominaisuudet Satu Viljamaa-Dirks, Evira Tiivistelmä LIITE 1 Yleistä: Tässä loppuraportin osassa kuvataan Evirassa tehtyä arviointia eri rapuruttotyyppien ja kantojen välisistä eroista taudinaiheutuskyvyssä. Suomessa on todettu kahta eri genotyyppiä olevaa rapuruttoa, jokiraputyypin ja täpläraputyypin rapurutot. Niiden aiheuttamissa epidemioissa on havaittu eroja, joita haluttiin varmentaa kokeellisesti. Osio toteutettiin aikavälillä toukokuu 2006 kesäkuu 2007. Toteutus: Koetta varten testattiin rapuruttokantojen kasvunopeus elatusaineessa, koska kasvunopeudessa oli todettu eroja liittyen taudinkuvaan luonnonepidemioissa. Molemmista genotyypeistä valittiin kasvunopeudeltaan poikkeavat kannat, joilla suoritettiin altistuskoe olosuhteissa, joissa rapuruton on kuvattu aiheuttavan suhteellisen nopeasti koerapujen kuoleman. Tulokset: Keskimääräisessä kasvunopeudessa havaittiin merkittävä ero genotyyppien välillä, siten että täpläraputyypin kannat kasvoivat selvästi jokirapukantoja nopeammin. Altistuskokeessa täpläraputyypin kannat aiheuttivat nopean täydellisen kuolleisuuden. Jokirapukantojen aiheuttama kuolleisuus oli selkeästi hitaampaa, ja testatulla nopeakasvuisella jokirapukannalla ei eronnut kontrolliryhmän kuolleisuudesta. Johtopäätös: Taudinaiheutuskyvyn kokeellinen testaus vahvisti epäilyä siitä, että jokiraputyypin rapuruttokannat ovat täpläraputyyppiä heikompia taudinaiheuttajia ja voivat siksi elää pitkään jokiravussakin. Sen sijaan pelkkä kasvunopeus ei ennusta taudinkulun nopeutta ja muiden virulenssitekijöiden vaikutusta on selviteltävä erillisellä tutkimuksella. 1 Rapuruttokantojen ominaisuudet 1.1 Tausta Rapuruton aiheuttaa leväsieniin (Oomycetes), Saprolegniales- luokkaan kuuluva Aphanomyces astaci- leväsieni. Rutto-organismin kasvunopeus ja siten myös taudin kehittyminen riippuu lämpötilasta. Ainakin yksittäisen ravun kohdalla tartunnan aiheuttavien itiöiden määrä vaikuttaa taudin kulkuun lämpötilan ohella. Molekyyligenetiikkaan perustuvien menetelmien kehittäminen on tuonut uutta tietoa Aphanomyces astaci - lajista. Pitkällä aikavälillä eristettyjen kantojen vertailussa on havaittu selvä ero vanhemmissa, ennen amerikkalaisen täpläravun kotiuttamista Eurooppaan esiintyneissä rapuruttokannoissa verrattuna täpläravuista ja eräistä muista Pohjois-Amerikasta peräisin olevista ravuista eristettyihin kantoihin. Rapuruttoa on todettu olevan ainakin neljää eri tyyppiä. Eviran Kuopion yksikössä on selvitetty RAPD-PCR -menetelmällä vuodesta 1998 lähtien talletettujen rapuruttokantojen tyyppejä. Toistaiseksi on löytynyt vain kahta tyyppiä. Jokiravuissa esiintyvää, vanhempaa tyyppiä (jokiraputyyppi, As) edustavat kannat ovat peräisin Itä- ja Keski-Suomen alueelta, kun taas täplärapujen istutusalueella Etelä-Suomessa rapuruttotapaukset ovat täpläravuissa esiintyvän täpläraputyypin (PsI) aiheuttamia. Täpläravuista on löytynyt toistaiseksi vain täpläraputyypin kantoja. Evirassa suoritetuissa altistuskokeissa todettiin jokiraputyypin kantojen yleensä aiheuttavan koerapujen kuoleman hitaammin kuin täpläravuista eristetyn tyypin. Samaten näytteeksi tulleissa jokiravuissa on vanhan rapuruttotyypin ollessa kyseessä useammin ehtinyt kilpeen muodostua melanisaatiota, joka on ravun puolustuskeino rapuruttorihmaston kasvua vastaan. Näytti siis siltä, että tyypeillä on myös selkeitä eroja taudinaiheutuskyvyssä.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 8 Rapuruton on oletettu hävittävän sille alttiiden rapulajien tartunnan saavat populaatiot sataprosenttisesti, ja kokeellisissa infektioissa kaikki altistetut ravut ovat kuolleet. Suomessa on kuitenkin usein todettu tapauksia, jotka eivät noudata odotettua taudinkulkukaavaa. Erityisesti suurissa järvissä ja reittivesissä todettujen toistuvien ruttotapausten on oletettu johtuvan populaation hajanaisuudesta, siten että tauti pystyy hitaasti kiertämään populaatiossa - puhutaan ns. kroonisesta rapurutosta. Parantuneen viljelytekniikan ansiosta viime vuosina on useita kertoja todettu jokiraputyypin rapuruttoa järvissä, joissa se on aiheuttanut rapukuoleman vasta huomattavalla viiveellä, tai osa populaatiosta on säilynyt hengissä pitkän aikaa epidemian huipun jälkeen. Lisäksi on voitu osoittaa jokiraputyypin rapuruton esiintyvän yllättävän pitkiä aikoja samassakin populaatiossa. Ainakin osa kroonisista rapurutoista voisi selittyä ruttokantojen välisillä virulenssieroilla. Jos voidaan osoittaa merkittäviä eroja rapuruton eri kantojen taudinaiheutuskyvyssä, jokainen alhaisen virulenssin omaavan kannan aiheuttama ruttotapaus saattaa merkitä pysyvää jokirapukannan romahtamista kannattavaa hyödyntämistä alemmalle tasolle, koska uusi joukkokuolema olisi kannan luontaisen lisääntymisen tai istutuksilla aikaansaadun vahvistumisen todennäköinen seuraus. Viime vuosilta on esimerkkejä laajamittaisten istutusprojektien epäonnistumisista, joiden syyksi voitiin varmistaa rapuruton esiintyminen vesistössä. Myös Ruotsissa on todettu populaatioiden toipumisen jokiraputyypin aiheuttaman ruttoepidemian jäljiltä entiselleen olleen erittäin harvinaista, ja syyksi on arveltu rapuruton pysyvää esiintymistä harvassa rapukannassa. Rapuruttokantojen virulenssieroja ei ole kuitenkaan aikaisemmin testattu. 1.2 Tavoitteet Tutkimusosion tavoitteena oli selvittää Suomessa esiintyvien rapuruttokantojen mahdollisia eroja taudinaiheutuskyvyssä. Lisäksi tarkoituksena oli arvioida, voidaanko mahdolliset erot liittää rapuruton genotyyppiin tai johonkin muuhun ominaisuuteen. Rapuruton kasvunopeuden on ainakin joissakin kliinisissä tapauksissa todettu olevan mahdollinen taudinkuvaan vaikuttava tekijä. Epätyypillisissä rapuruttoepidemioissa, joissa sairauden oireet ovat edenneet hitaasti, on yleensä löydetty selkeästi elatusaineessa normaalia hidaskasvuisempia rapuruttokantoja. Toinen rapuruton tarttumista uusiin rapuihin edistävä tekijä voisi olla kannan kyky uimaitiöiden tuotantoon. Tässä ei kuitenkaan kokemuksen mukaan ollut havaittavissa selkeää eroa eri kantojen välillä, mikäli itiöitä muodostavaa rihmastoa oli suunnilleen sama määrä. Itiöiden tuotto suhteutui siten myös kasvunopeuteen, joten kantojen välisiä eroja lähdettiin hakemaan kasvunopeuden pohjalta. 2 Rapuruton kahden genotyypin erot kasvunopeudessa 2.1 Tutkimusmenetelmä ja aineisto Tutkimuksen aineisto muodostui Evirassa talletetuista, kliinisiä tautitapauksia edustavista rapuruttokannoista. Kantoja tutkittiin yhteensä 56 kappaletta. Näistä 25 oli täpläraputyypin kantoja ja 31 jokiraputyypin kantoja. Neljätoista kantaa tutkittiin sekä 15 ºC että 20 ºC kasvulämpötilassa, loput ainoastaan 20 asteessa. Kasvunopeus määriteltiin PG-1 elatusaineessa, joka sisältää peptonia, glukoosia sekä rapuruton kasvulle välttämättömän suolaseoksen. Vakioidun paksuiselle elatusainelevylle sijoitettiin keskelle 6 mm halkaisijaltaan oleva pyöreä aloituspala aktiivisesti kasvavaa rapuruttorihmastoa. Jokaisesta kannasta tehtiin kolme viljelmää. Kasvuston halkaisijaa mitattiin kerran vuorokaudessa. Kasvua seurattiin noin kaksi viikkoa. Kasvuston halkaisija mitattiin aina kohdasta, jossa se oli suurimmillaan. 2.2 Tulokset Rapuruttokantojen välillä ei havaittu merkittävää eroa tutkittaessa eri lämpötiloja, joten ensimmäisten 14 kannan jälkeen testilämpötilana käytettiin ainoastaan +20 ºC. Rapurutto kasvoi elatusaineessa melko tasaista vauhtia. Kantojen välinen ero määritettiin 6 tai 7 vrk kasvun keskiarvosta, kolmen rinnakkaistestin keskiarvona. Tästä eteenpäin nopeakasvuisimmat kannat täyttivät jo koko maljan, joten eroja nopeudessa ei enää pystytty määrittämään. Hitaimpien kantojen kasvu heikkeni

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 9 tai pysähtyi kokonaan kahden viikon seuranta-ajan lopussa, joten nämä eivät yleensä täyttäneet koko 8,5 cm halkaisijaltaan olevaa maljaa. Rapuruttokasvustojen kasvunopeus vaihteli selkeästi kantojen välillä. Hitaimmissa kasvustoissa radiaalinen kasvunopeus oli 1,5 mm/vrk, kun taas nopein kanta kasvoi keskimäärin 4,5 mm vuorokausinopeudella. Täpläraputyypin kannat kasvoivat kaikki melko tasaista nopeutta, radiaalisen kasvun keskiarvo oli noin 3,5 mm vuorokaudessa (vaihteluväli 2,6 4,5 mm). Vaihtelua oli enemmän jokiraputyypin kannoissa, ja niiden keskiarvo oli täpläraputyypin kantoja alhaisempi, noin 2,5 mm vuorokaudessa (vaihteluväli 1,5 4,1 mm). 2.3 Pohdinta Laboratoriossa säilytyksessä olleet kannat eivät välttämättä käyttäydy enää samalla tavalla kuin suoraan luonnosta peräisin olevat. Kantoja säilytetään elatusaineessa jääkaappilämpötilassa, suojattuna kuivumiselta. Ne täytyy siirrostaa uudelle elatusaineelle vähintään puolen vuoden välein. Tässä prosessissa voi valikoitua kasvuston nopein osa. Rapuruttodiagnostiikassa vertailukantana käytetty jokiraputyypin K86/1999 oli kaikkein nopeakasvuisin kanta, radiaalinen kasvu keskimäärin 6 mm vuorokaudessa. Sekä tätä kantaa että täpläraputyypin vertailukantaa K47/1999 on siirrostettu lukuisia kertoja vuosittain. Myös K47 oli oman genotyyppinsä nopeakasvuisin kanta. Nämä kannat jätettiin siksi pois vertailuista. Koska mukana olleet kannat olivat vuodelta1998 tai sen jälkeen kerättyjä, niiden siirrostusmäärä on ollut maksimissaan kuusitoista kertaa tai vähemmän, verrattuna kontrollikantojen arvioituun 60 kerran siirrostusmäärään. Näin ollen valikoitumisen ei vielä arvioitu vaikuttavan merkittävästi vertailutulokseen. Täpläraputyypin kantojen ja jokiraputyypin kantojen välillä havaittiin merkittävä ero kasvunopeudessa. Täpläraputyypin kannoissa kasvunopeus oli suhteellisen vakio, eikä niissä todettu lainkaan hidaskasvuisia kantoja. Jokiraputyypin kannoissa vaihtelua oli huomattavasti enemmän. Kontrollikantojen alkuperäistä kasvunopeutta ei ole tiedossa, joten on mahdotonta arvioida valikoivan siirrostamisen vaikutusta niiden kasvunopeuteen. On mahdollista, että rapurutto pystyy adaptoitumaan vallitseviin olosuhteisiin kasvupotentiaalin muutoksella. Näin ajatellen olisi myös mahdollista, että pitkäaikaisen luonnossa säilymisen selitys olisi hidaskasvuisuuden valikoituminen vallitsevaksi ominaisuudeksi, jolloin rapurutto ei välttämättä tappaisi isäntäeläintään nopeasti ja pystyisi näin säilymään jokiravussakin. Kasvunopeuden tutkiminen elatusaineessa ei tietenkään suoraan vastaa rapuruton kasvumahdollisuuksia ravun kuoressa. Kuoressa kasvaakseen rapurutto tarvitsee mm. entsyymien apua, joista tärkein kitinaasin tuotto. Kasvupotentiaali elatusaineessa voi kuitenkin antaa viitteitä siitä, miten rapurutto pystyisi kasvamaan ravussa. 3 Rapuruttokantojen virulenssierot 3.1 Koeasetelma 3.11 Rapuruttokantojen valinta Altistuskokeeseen valittiin molemmista Suomessa esiintyvistä genotyypeistä mahdollisimman hidaskasvuinen ja mahdollisimman nopeakasvuinen kanta, pois lukien nopeakasvuiset kontrollikannat. Jokiraputyypin kannoista tutkimukseen otettiin 29.7.2003/116 (keskimääräinen kasvunopeus 4,0 mm/vrk) ja 16.8.2005/17 (keskimääräinen kasvunopeus 1,63 mm/vrk). Nopea kanta (tästä eteenpäin Nopea As) oli eristetty keskikokoisesta järvestä rapukuoleman yhteydessä, hidaskasvuinen (tästä eteenpäin Hidas As) pienestä järvestä koeravustusten yhteydessä 5 vuotta rapukuoleman jälkeen saadusta ravusta.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 10 Täpläraputyypin kannoista ei löytynyt yhtä suurta eroa. Nopeakasvuiseksi kannaksi valittiin 11.7.2003/86 (keskimääräinen kasvunopeus 4,14 mm/vrk) ja hidaskasvuiseksi 7.10.2003/5 (keskimääräinen kasvunopeus 2,59 mm/vrk). Nopea kanta (tästä eteenpäin Nopea PsI) oli eristetty keskikokoisesta järvestä akuutin rapukuoleman yhteydessä, hidaskasvuinen (tästä eteenpäin Hidas PsI) istutusprojektin yhteydessä sumputetuista ravuista, joissa esiintyi kuolleisuutta. 3.12 Altistuskokeen suoritus Altistuskoetta varten hankittiin jokirapuja ravunviljelylaitokselta, jonka rapuja oli pariin otteeseen tutkittu rapuruton varalta negatiivisin tuloksin. Rapujen koko oli 6-9 cm. Ravut tulivat elokuussa, mutta niillä oli vielä osittain kuorenvaihto kesken. Akklimatisointiaikana kuoli siksi jonkun verran rapuja, niin että alun perin suunniteltu ryhmäkoko 15 rapua pienennettiin 12 rapuun. Jokaiseen ryhmään valittiin 6 urosta ja 6 naarasta. Jokaista testattavaa rapuruttokantaa kohti oli kolme ryhmää, lisäksi kolme kontrolliryhmää. Ravut sijoitettiin 15 litraan vettä altaisiin, joissa oli ilmastointi ja salaojaputken palasia piilopaikoiksi. Koealtaiden veden lämpötila vaihteli huonelämpötilan mukaan välillä 20 22 astetta. Rapuja ruokittiin kokeen aikana pakasteherneillä. Vettä vaihdettiin yksi kolmasosa keskimäärin kaksi kertaa viikossa. Vetenä käytettiin vähintään kolme viikkoa seisonutta järvivettä. Varsinainen altistuskoe aloitettiin 26.10., jolloin kuolleisuus oli vakiintunut alhaiselle tasolle. Valituista rapuruttokannoista tuotettiin uimaitiöitä ruotsalaisten tutkijoiden kuvaamalla menetelmällä, jota Evirassa oli käytetty aiemmin rapuruton lajimäärityksessä. Tarkoitus oli testata rapuruttokantojen taudinaiheutuskykyä kahdella pitoisuudella, 10 ja 100 itiötä/ml. Näistä sadan itiön pitoisuuden oletettiin johtavan melko nopeasti rapujen 100% kuolleisuuteen, joka kirjallisuudessa oli saavutettu yleensä 1,5 kk sisällä. Siksi testaus aloitettiin tällä pitoisuudella, sillä tilojen puolesta ei ollut mahdollista testata molempia pitoisuuksia samanaikaisesti. Ruttorihmastojen huuhtelu antoi tulokseksi 6000:sta 12000 itiöön/ml Bürkerin kammiolla laskettuna. Liuokset laimennettiin steriiliin järviveteen ja lisättiin koealtaisiin, joista piilot oli poistettu (26.10.06). Suojapaikat palautettiin seuraavana päivänä kannibalismin estämiseksi. Koealtaat kontrolloitiin päivittäin ja kuolleet ravut poistettiin. Ravut tarkastettiin rapuruton oireiden varalta sekä viljeltiin, kunnes altaasta eristetystä kannasta oli varmistunut sen vastaavan ominaisuuksiltaan altistukseen käytettyä kantaa. 3.2 Tulokset altistuskokeesta Kuolleisuuskäyrät esitetään kuvassa yksi. Kuvan selvyyden vuoksi ryhmät on yhdistetty, suuria allaskohtaisia eroja ei kuitenkaan esiintynyt. Täplärapukantojen käyttö altistukseen aiheutti ravuissa voimakkaat akuutin rapuruton oireet ja nopeasti kehittyvän kuolleisuuden, joka oli täydellinen odotetun 1,5 kk sisällä. Nopea PsI aiheutti kuoleman nopeammin kuin hidas PsI. Sen sijaan nopea As ei näissä olosuhteissa aiheuttanut kuolleisuutta kontrolliryhmää nopeammin. Hidas As aiheutti kuolleisuutta, joka tasaantui ja kesti lopulta useita kuukausia saavuttaakseen 100%. Viimeinen hidas-as-altistettu rapu kuoli 3.3.07. Kontrolliravuissa ja nopea- As- altistetuissa ravuissa oli tasaista pientä kuolleisuutta. Viimeinen altistettu rapu kuoli 27.6. ja viimeinen jäljellejäänyt kontrollirapu lopetettiin 4.7.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 11 Kuva 1. Kuolleisuuden kehittyminen altistuskokeessa. PsI-altistetuissa ravuissa oli runsaasti akuuttia rihmastokasvua vatsakilvessä. Viljelyllä saatiin heti ensimmäisistä kuolleista ravuista positiivinen eristystulos. Hidas As aiheutti huomattavan paljon melanisaatiovaurioita ravun kuoreen. Myös näistä altaista eristys onnistui nopeasti. Nopea Asryhmässä todettiin suoramikroskooppisesti vain pistemäistä melanisaatiota tai lyhyitä melanisoituneita rihmanpätkiä (kuva 2). Rapuruton eristäminen kuolleista ravuista oli huomattavan hankalaa ja onnistui vain yhdestä ravusta. Koska kuolleisuuden kehittyminen täydelliseksi kesti jo suuremmalla itiöpitoisuudella yli puoli vuotta, alempaa itiöpitoisuutta ei keritty enää testata ja se katsottiin toisaalta tarpeettomaksi, koska merkittäviä eroja saatiin aikaan jo 100 itiöllä/ml. 4 Rapuruttokantojen ja tyyppien erot: pohdinta Altistuskoe näyttäisi vahvistavan käytännössä syntynyttä epäilyä siitä, että rapuruton eri genotyypeillä on eroja taudinaiheutuskyvyssä. Molemmat testatut täpläraputyypin kannat käyttäytyivät, kuten rapuruton on raportoitu tekevän aiemmassa kirjallisuudessa. Sen sijaan jokiraputyypin kannoilla saatiin osin yllättäväkin tulos. Hidaskasvuinen jokiraputyypin rapurutto aiheutti kuolleisuutta huomattavasti hitaammin kuin täpläraputyypin kannat. Nopeakasvuinen jokiraputyypin kanta, jonka oli oletettu olevan hidaskasvuista kantaa tehokkaampi taudinaiheuttaja, ei kuitenkaan koeoloissa näyttänyt saavan aikaan kontrolliryhmästä poikkeavaa kuolleisuutta. Näissä olosuhteissa ja käytetyllä itiömäärällä rapuruton oletettiin olevan optimaalisissa oloissa kuolleisuuden kehittymiseksi. Vaikka nopea As-kanta ei käytännössä aiheuttanutkaan kuolleisuutta, sen todettiin kuitenkin tarttuneen rapuihin itiöiden aikaansaamien melanisaatiopisteiden perusteella. Myös kannan eristys koe-

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 12 ravuista onnistui, vaikkakin oli hankalaa. Ilmeisesti ruton kasvu kuoressa oli jollakin tavoin estynyt tai hyvin hidasta. Kuva 2. Nopean As-kannan aiheuttama kilpivaurio ravun vatsakilvessä. Altistuksesta 5 kk. Ottaen huomioon jokiraputyypin rapuruton pitkän historian Euroopassa, on mahdollista, että rapurutto on muuntunut eri tavoilla mahdollistaakseen yhteiselon isäntäeläimen kanssa. Yksi selviytymiskeino on todennäköisesti hidas kasvu, joka antaa ravulle aikaa puolustusmekanismin aktivoitumiseen ja estää siten ruton liian nopean leviämisen. Nopeakasvuisilla kannoilla saattaa olla muita virulenssia heikentäviä ominaisuuksia, jotka ovat antaneet isäntäeläimelle selviytymismahdollisuuden ja samalla pitäneet rapuruton hengissä. Esimerkiksi kitinaasin tuotto saattaa olla alentunut. Tämän kokeen puitteissa ei kuitenkaan tutkittu tarkemmin muita mahdollisia syitä huonoon taudinaiheutuskykyyn. Myöskään neljällä rapuruttokannalla tehty testaus ei vielä sulje pois mahdollisia suuriakin poikkeamia taudinaiheutuskyvyssä genotyyppien sisällä. Tulos sopii kuitenkin yhteen käytännössä havaittujen erojen kanssa ja selittää, miksi jokiraputyypin rapurutto voi toistuvasti aiheuttaa ongelmia samoissa järvissä. Rapuruttoa todettaessa on siis hyödyllistä selvittää, mihin genotyyppiin aiheuttaja kuuluu, jolloin voidaan paremmin ennustaa epidemian kulkua. Sen sijaan tämän kokeen perusteella pelkkä kasvunopeus ei riitä taudinaiheutuskyvyn arviointiin. Muiden virulenssitekijöiden kuin kasvunopeuden selvittäminen vaatii lisätutkimuksia.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 13 LOPPURAPORTTI: OSA E2 (Evira, Kuopion tutkimusyksikkö) HANKEOSIO: Satu Viljamaa-Dirks, Evira Tiivistelmä Rapuruttodiagnostiikka LIITE 2 Yleistä: Tässä loppuraportin osassa kuvataan Eviran tavoitteena olleen rapuruton tautidiagnostiikan ja rapuruton kantajadiagnostiikan testaamista. Osio toteutettiin aikavälillä toukokuu 2007 joulukuu 2007. Toteutus: Pikadiagnostiikkaan käytetään reaaliaikaista PCR-menetelmää, joka on kehitetty Norjassa. Erilaisia kuorenkäsittelytapoja DNA:n tehokkaaksi eristämiseksi testattiin taudinaiheutuskokeesta saaduilla positiivisilla näytteillä. Kliinisiä näytteitä testattiin tautidiagnostiikan luotettavuuden toteamiseksi. Taudinkantajanäytteitä tuotettiin erillisellä, alhaisella itiöpitoisuudella toteutetulla altistuskokeella. Tulokset: Reaaliaikainen PCR- menetelmä antoi yhtenevät tulokset kaikista testatuista, eristyksellä varmennetuista tautinäytteistä. Taudinkantajien tuottaminen kokeella epäonnistui siinä mielessä, että osa ravuista sairastui kliiniseen tautiin. Myös tulokset altistettujen rapujen testauksesta olivat jonkun verran ristiriitaiset. Johtopäätös: Reaaliaikainen PCR- menetelmä voidaan ottaa käyttöön tautitapausten varmistamiseksi, jolloin aikaa vievää ja vaativaa viljelyä ei välttämättä tarvita. Yksittäisiä epäspesifisiä heikkoja positiivisia tuloksia, sekä joitakin virhenegatiivisia saatiin kantajatutkimuksessa, joten sitä täytyy edelleen testata. Menetelmä saadaan oireettomien rapujen tutkimiseksi käyttöön todennäköisesti vuoden 2008 aikana. 1 Eviran käytössä oleva diagnoosimenetelmä Rapuruttodiagnoosi perustuu ravun kilvessä esiintyvän rapuruttorihmaston toteamiseen mikroskooppisesti ja rapuruton viljelyyn. Viljelytulos on varmistettu vuodesta 2004 lähtien Oidtmann ym kehittämällä PCR-menetelmällä. Jos viljelyssä on saatu aikaan puhdasviljelmä, on tehty myös eristetyn rapurutto-organismin geneettinen tyypitys RAPD- PCR- menetelmällä. Ruotsissa aikoinaan kehitettyyn viljelymenetelmään Kuopion Evirassa tehdyt muutokset paransivat olennaisesti menetelmällä saatuja tuloksia, siten että suoramikroskooppisesti todetusta rapuruttoepäilystä tulos pystytään varmentamaan eristyksellä suurimmasta osasta tapauksia, ja eristyksiä on tehty myös ravuista, jotka mikroskoopilla tarkasteltuina olivat negatiivisia. Tulos on kansainvälisesti vertailtuna hyvä, sillä rapuruton eristystä pidetään ongelmallisena ja vain muutamat eurooppalaiset laboratoriot ovat onnistuneet siinä satunnaisesti. Viljelymenetelmän ongelmallisuuden vuoksi suuntaus on ollut molekyylibiologiaan perustuvan diagnostiikan kehittäminen. PCR- reaktioon pohjautuvat menetelmät ovat nopeita suorittaa eikä niiden luotettavuus kärsi, vaikka laboratorio ei olisikaan erityisesti perehtynyt rapuruttodiagnostiikkaan. Näiden menetelmien varjopuolena on rapuruttokantojen jääminen eristämättä ja siten niiden saaminen tutkimuskäyttöön ei onnistu. Nykyisillä molekyylibiologisilla menetelmillä ei myöskään voida erottaa rapuruton eri tyyppejä toisistaan, siihen tarvitaan puhtaaksiviljelty kanta. 2 Molekyylibiologiaan perustuvat menetelmät 2.1 Perinteinen PCR PCR (Polymerase chain reaction)- menetelmissä kopioidaan polymeraasientsyymin avulla DNA:sta sellaista jaksoa, jonka oletetaan esiintyvän vain tutkittavan organismin perimässä. Kun kopiointikertoja on riittävä määrä, saadaan tuotettua DNA:ta niin paljon, että se voidaan todeta ajamalla

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 14 tuote geelissä sähkökentän avulla. Tällöin se kulkee kokonsa mukaisen matkan ja voidaan tunnistaa vertaamalla standardeihin ja positiiviseen kontrolli- DNA:han. Tunnistamiseen voidaan käyttää myös PCR-tuotteen restriktioentsyymikäsittelyä tai sekvensointia. Vuonna 2004 julkaistu Oidtmann ym. kehittämä menetelmä on käytössä rapuruton puhdasviljelmän tunnistamisessa. Sitä on myös käytetty viljelymenetelmässä rapuruton osoittamiseksi sekakasvun joukosta. Kokeilut rapuruton toteamiseksi tällä menetelmällä suoraan ravun kuoresta eivät aina antaneet odotettua tulosta kliinisistä näytteistä. Koska herkempiä menetelmiä on käytettävissä, siirryttiin pikadiagnoosimenetelmien testauksessa suoraan niihin. 2.2 Nested-PCR Nested-PCR- menetelmässä käytetään perinteisellä PCR- menetelmällä tuotettua DNA:ta uutena näytteenä, josta kopioidaan aiemmin kopioituun DNA-jaksoon sisältyvää lyhyempää osaa. Muuten periaate on sama kuin perinteisessä PCR-menetelmässä. Nested-PCR- menetelmän ongelma rutiinikäytössä on alttius laboratoriokontaminaatiolle. Kun ensimmäisessä vaiheessa tuotetaan mahdollisesti suuria määriä kohde-dna:ta, uuden reaktion aloittamisen vaatima näytteiden käsittely saastuttaa helposti muita näytteitä ja laboratorioympäristöä ja virheelliset positiiviset tulokset ovat siten tavallisia. Oidtmann ym. ovat julkaisseet loppuvuodesta 2006 menetelmän, joka perustuu nested-pcr:ään (semi-nested PCR). Vaikka nested-pcr yleensä parantaa herkkyyttä, Oidtmann ym. tutkimuksessa ensimmäisen ja toisen kierroksen tulokset eivät eronneet merkittävästi. Lisäksi toisella kierroksella kopioitui myös eräitä muita oomykeettejä kuin rapurutto. Näin ollen myös tämän menetelmän jatkotestauksesta luovuttiin. 2.3 Reaaliaikainen PCR Reaaliaikaisessa PCR-menetelmässä kopioituvan DNA-tuotteen määrää mitataan jokaisella kopiointikerralla fluoresoivaa valoa lähettävän koettimen avulla. Valon määrä mitataan ja, mikäli reaktiossa syntyy aiottua tuotetta, saadaan tuotteen määrää kuvaava eksponentiaalisen kasvun käyrä. Vakioitujen standardikäyrien avulla voidaan myös arvioida näytteessä alun perin olleen kohde- DNA:n määrää. Tästä syystä menetelmää kutsutaan myös kvantitatiiviseksi PCR- menetelmäksi. Norjan Eläinlääketieteellisessä Instituutissa on kehitetty reaaliaikaista PCR- menetelmää rapurutolle. Vaikka menetelmää ei ole vielä julkaistu, saatiin se kuitenkin testattavaksi Kuopion Eviran järjestämän raputautidiagnostiikkakokouksen tuloksena helmikuussa 2007. Menetelmä perustuu lyhyen ITS-alueen geenijakson kopioimiseen (59 emäsparia), ja mitataan TaqMan MGB-koettimella, joka on spesifinen rapurutolle. Testaus Norjassa on osoittanut menetelmän olevan herkkä ja spesifinen rapuruttotartunnan osoittamiseen. Reaaliaikaisen PCR-menetelmän etu on reaktion tapahtuminen suljetussa koeputkessa, jolloin näytteen saastuminen on epätodennäköisempää kuin perinteisessä tai nested-menetelmässä. 2.4 PCR menetelmän käyttöön liittyviä virhemahdollisuuksia 2.41 Näytteen valinta - väärä negatiivinen tulos? Viljelymenetelmässä mahdollisimman suuri osa ravun kuoresta sijoitetaan kasvatusalustalle, siten että mahdollinen rapurutto saadaan esiin vaikka sen sijaintia ei tiedetä. Tartuntahan ei ole tasaisesti jakaantuneena ravussa vaan itiöt kiinnittyvät sattumanvaraisesti ravun kuoreen. Pehmeät kuoren osat on kuitenkin todettu ruttoitiöiden suosikkipaikoiksi, ja erityisesti vatsakilpi on otollinen kasvualusta. Heikosti infektoituneissa ravuissa kiinnittymispaikkoja ei kuitenkaan ole perusteellisesti kartoitettu, soveltuvien menetelmien puuttuessa tähän saakka. Oidtmann ym testauksessa paras tulos saatiin vatsakilven ja uimalevyjen tutkimisella. Näytekudos jää kuitenkin PCR- menetelmässä vähäiseksi ja infektoituneita rapuja toteamatta tämän takia.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 15 2.42 DNA:n eristäminen - väärä negatiivinen tulos? PCR- reaktioon perustuvat pikamenetelmät vaativat DNA:n eristämisen näytteestä ennen testausta. Lopullisen testin tulos riippuu paljon siitä, miten hyvin DNA:n eristäminen onnistuu. Näytteessä oleva DNA voi olla jo osittain hajonnutta esimerkiksi näytteen käsittelyn tai pitkäaikaisen säilytyksen seurauksena. Kun näytteenä on ravun osia puhtaan rapuruton asemasta, ongelmaksi tulee paitsi näytteeksi otettavien ravun osien valinta, myös ravun kuoren käsittely niin, että siinä oleva rutto-dna saadaan eristettyä. Kuori on melko sitkeää ja vaatii hajotakseen erityisiä toimenpiteitä. 2.43 PCR-inhibiittorit voivat estää reaktion toimimisen - väärä negatiivinen? PCR- reaktio on monivaiheinen prosessi, joka saattaa häiriintyä näytteessä olevista ainesosista. Muun muassa rapujen kuoressa esiintyvä melaniini tunnetaan inhibiittorina. Luotettavissa PCRdiagnoosimenetelmissä pyritään reaktion oikea kulku testaamaan sisäisellä monistumiskontrollilla, joka todentaa DNA:n onnistuneen kopioitumisen. Sisäisen monistumiskontrollin rakentaminen reaaliaikaiseen PCR- reaktioon on monivaiheinen prosessi. Tämän projektin puitteissa ei siihen ehditty ryhtyä. Alustavasti testattiin kuitenkin perinteistä PCR- reaktiota, joka monistaa Decapodi- DNA:ta eli rapujen omaa DNA:ta. Mahdollisesti tätä reaktiota voidaan jollain tavalla soveltaa kontrolloimaan DNAn monistumismahdollisuuksia. 2.44 PCR-reaktion toteuttaminen: väärät positiiviset tai negatiiviset tulokset? Näytteen käsittely, DNA:n eristäminen ja PCR- reaktion toteuttaminen ovat kaikki monivaiheisia, tarkkuutta vaativia laboratorioprosesseja. Kaikki käsin tehtävät osat sisältävät riskin virheistä, joita voivat olla pipetointivirheet, väärät reagenssit tai virheelliset määrät reagensseja, reagenssien saastuminen DNA:lla, näytteen saastuminen DNA:lla jne. DNA-eristyksen puhtauden varmistamiseksi näyte-eriin otetaan mukaan ns. eristyskontrolli, rapuruton suhteen puhtaaksi oletetun ravun kuorta. Jos eristyskontrollista saadaan positiivinen tulos, näyte on mahdollisesti saastunut DNAeristyksen aikana ja positiiviset tulokset eivät ole luotettavia. Ongelmaksi osoittautui varmasti negatiivisen kuoren valinta, sillä jotkut negatiivisiksi oletetut ravut antoivat heikkoja positiivisia tuloksia. PCR- reaktiossakin on mukana sekä positiivisia että negatiivisia kontrolleja. Reaaliaikaisessa PCRmenetelmässä positiiviset kontrollit toimivat myös DNA-määrän standardeina. Vaikka DNA:n monistuminen käytössä olevassa menetelmässä nojaa kahteen rapurutolle ominaiseen alueeseen, virheellistä sitoutumista ja monistumista voi alkaa tapahtua kun syklien määrä on riittävän korkea. Yli 40 kierroksen tuloksia ei yleensä kannata huomioida. 3 Reaaliaikaisen PCR -menetelmän testaus tautinäytteille Reaaliaikaisen PCR- menetelmän testauksessa käytettiin ensin laimennussarjana rapuruton puhdaskasvusta eristettyä DNA:ta, sitten virulenssitestauksen altistuskokeesta rutolle altistettuja ryhmiä. Ensimmäisessä vaiheessa testattiin eri menetelmiä DNA:n eristämiseen. Testattavana olivat valmissarjat QIAGEN Dneasy Plant Mini Kit, QIAmp Mini Kit ja CTAB- menetelmä yhdistettynä kuoren jauhamiseen nestetypessä tai metallikuulilla homogenisaattorissa. Paras tulos saatiin nestetypellä jauhamalla ja käyttämällä Plant Mini Kit- sarjaa. Käytössä nestetyppi on kuitenkin hankala ja koska metallikuulakäsittely antoi lähes yhtä hyvän tuloksen, sitä käytettiin jatkotutkimuksessa. Ravun kuoren pakastaminen ennen hajottamista todettiin kuitenkin välttämättömäksi kunnollisen hajoamisen aikaansaamiseksi. Altistuskokeen ravuista testattiin vatsakilven kaksi viimeistä jaoketta, jotka kirjallisuuden mukaan ovat paras kuoren osa rapuruton toteamista varten. Kun menetelmäprosessi oli valittu, testattiin noin 30 viljelyssä positiiviseksi todettua ryhmää, joista näyterapuja oli säilötty pakastimeen. Oireettomista näyteravuista testattiin vatsakilpi, mutta jos niissä todettiin melanisaatioalueita, nämä testattiin. Nämä ravut olivat reaaliaikaisessa PCR- kokeessa kaikki voimakkaasti positiivisia.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 16 4 Reaaliaikaisen PCR -menetelmän testaus kantajista 4.1 Rapujen altistuskoe Kantajadiagnostiikan testaamiseksi tehtiin altistuskoe, jonka tarkoituksena oli tuottaa tunnetulla pitoisuudella altistettuja, heikosti infektoituneita rapuja. Ravut hankittiin samalta toimittajalta kuin osan 1 altistuskokeeseenkin. Ne sijoitettiin pyöröaltaisiin, joissa oli 30 litraa järvivettä ja ilmastus. Veden lämpötila kokeen ajan oli 18-20 ºC. Rapuja oli kuusi koeryhmää, joissa kussakin 30 rapua, ja kolme samankokoista kontrolliryhmää. Altistuskannaksi valittiin hidaskasvuinen As- kanta, joka virulenssitestauksessa oli aiheuttanut hitaasti kehittyvää kuolleisuutta 100 itiötä/ml pitoisuudella. Kolme ryhmistä altistettiin itiöpitoisuudelle 1 itiö/ml, eli noin 30 000 itiötä allasta kohti, ja kolme ryhmää itiöpitoisuudelle 10 itiötä/ml eli noin 300 000 itiötä allasta kohti. Kymmenen vuorokauden kuluttua altistuksesta yksi rapu molempien altistustasojen ryhmistä kuoli ja niiden vatsakilvessä todettiin aktiivista rapuruttorihmastoa. Koe lopetettiin ja ravut pakastettiin myöhempää analysointia varten. 4.3 Altistusrapujen tutkiminen ja tulokset Koska merkkejä akuutista taudista löytyi jo yhdellä itiöllä millilitrassa altistetuista ravuista, jatkotutkimukset tehtiin vain tästä ryhmästä. Näytekooksi valittiin 28 rapua, joka määrä pystyttiin käsittelemään kahdella kerralla PCR- menetelmää käytettäessä. Suoramikroskooppisella tutkimuksella tutkittiin rapujen vatsakilpi. Tällä tutkimuksella kymmenessä ravussa todettiin rapuruttorihmastoa. Standardinäytteeksi valitussa kahdessa kaudaalisimmassa vatsakilven jaokkeessa viidellä näistä kymmenestä todettiin rihmastoa. Rapuruttosienen rihmastoa ei todettu kontrolliryhmän ravuilla, mutta pientä melanisaatiopistettä ja epätyypillisen näköisiä pieniä sienirihmoja todettiin molemmissa ryhmissä. Reaaliaikainen PCR antoi tulokseksi raja-arvoksi määriteltyä kynnysarvoa (laskennallinen 1pg DNA:ta standardikäyrästä) suuremman lukeman kymmenestä altistetusta ravusta, mutta tulos ei ollut täysin yhtenevä mikroskooppisen tutkimuksen kanssa. Neljä rapua, jotka mikroskooppisesti olivat positiivisia, antoivat kuitenkin negatiivisen tuloksen PCR-menetelmällä. Näistä kaksi oli kynnysarvoa alempia positiivisia ja kaksi täysin negatiivisia. Sen sijaan PCR- menetelmällä todettiin positiiviseksi neljä rapua, joiden tulos mikroskoopilla oli negatiivinen. Kynnysarvoa alhaisempi positiivinen tulos saatiin lisäksi kuudesta ravusta, joista yksi negatiivinen eristyskontrolli. Yhdestä kontrolliryhmän ravusta saatiin myös kynnysarvoa alhaisempi positiivinen tulos. Kaiken kaikkiaan positiivisia tuloksia saatiin yhteensä viidestätoista ravusta altistetussa koeryhmässä ja yhdestä kontrolliryhmän ravusta sekä yhdestä eristyskontrollikilvestä. Negatiivisiksi oletetuista kontrolleista saadut heikot positiiviset tulokset ovat ongelmallisia. Heikot positiiviset voivat johtua näytteen kontaminoitumisesta tutkimusvaiheessa tai näyterapujen kontaminoitumisesta yksittäisillä itiöillä koetilassa. On myös mahdollista, että koeravuissa on alun perin hyvin heikko infektio. Kontrolliryhmiä ei ole tutkittu vielä kaikkia, joten lisänäytteiden tutkiminen saattaa selventää näitä epäilyttäviä positiivisia tuloksia. Siihen saakka positiivisen tuloksen tulkintaraja on asetettava riittävän korkealle, eli 1pg kynnysarvon mukaiseksi. 5 PCR menetelmän käyttöönotto diagnostiikassa 5.1 Tautidiagnostiikka Reaaliaikainen PCR- menetelmä antoi viljelymenetelmään verrattaessa täysin yhtenevät tulokset positiivisista kliinisistä näyteryhmistä. Tautiepäilynäytteestä saatua voimakasta positiivista tulosta voidaan pitää luotettavana, mikäli negatiiviset eristys- ja reaktiokontrollit säilyvät negatiivisina. Usein tartunta voidaan todeta myös mikroskooppisesti. PCR on hyvä menetelmä tartunnan varmistamiseksi, eikä vaadi erityisosaamista rapuruton tunnistamisessa. Tulos saadaan nopeasti, mikä

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 17 on selvä etu tiedotettaessa rapuruton esiintymisestä. Tähän tarkoitukseen menetelmä on jo käytettävissä. Heikosti positiiviset tulokset aiheuttavat tulkinnanvaraisuutta, mikäli muita diagnoosia tukevia havaintoja (oireet, kuolleisuustiedot, mikroskooppinen tutkimus) ei ole. Vasta kierroksilla 30-40 nousuun lähtevät arvot voivat edustaa heikkoa infektiota tai epäspesifistä sitoutumista tai kontaminaatiota. 5.2 Kantajadiagnostiikka Mahdollisen piilevän infektion toteaminen on tavoitteena kantajadiagnostiikassa. Tällöin heikkojen positiivisten tulosten tulkintaa joudutaan pohtimaan. Altistuskokeessa saatiin vain yhdestä koeravusta alle 30 kierroksen noussut arvo. Toisaalta useista ravuista tartunta voitiin todeta myös mikroskooppisesti. Siinä mielessä tartuntakoe epäonnistui, sillä rapurutto oli selvästi aiheuttanut akuutin taudin joissakin ravuissa ja ne eivät siis edustaneet tyypillistä kantajapopulaatiota. Todennäköinen syy kokeen epätoivottuun tulokseen oli altistus tietylle itiöpitoisuudelle. Vaikkakin pitoisuus oli alhainen, se käytännössä merkitsi 30 000 itiön lisäämistä suhteellisen pieneen tilaan, jossa ravut eivät voineet väistää itiöitä. Itiöidenhän on kirjallisuuden mukaan todettu pystyvän suuntautumaan ja uimaan aktiivisesti rapua kohti. Tämä tosiasia jäi huomioimatta koeasettelussa ja johti liian suuren itiömäärän kiinnittymiseen ainakin osaan rapuja. Kantajadiagnostiikka vaatii siis lisätestausta todellisten lievästi infektoituneiden rapujen toteamisessa, mahdollisesti täpläravuilla tai infektoituneiksi tiedetyillä luonnon jokirapupopulaatioilla. Myös PCR- negatiivisiksi jääneet, mikroskoopilla positiivisiksi todetut ravut vaativat lisäselvitystä. Kantajapopulaation tutkiminen noin 30 ravun otannalla, joka käytännössä on näytemäärän yläraja käytetyn ajan ja reagenssikustannusten vuoksi, edellyttää käytettävältä menetelmältä 100 % varmuutta, mikäli tauti halutaan saada esiin kun sen oletettu esiintyvyys on 5-10 % populaatiosta. Tällöin otoksessa saattaa olla vain yksi tautia sairastava rapu. Ellei tätä rapua pystytä toteamaan, kaikki tulokset jäävät mahdollisesti negatiiviseksi ja erästä saadaan virheellinen negatiivinen tulos, vaikka tartunta olisikin jopa 10 % rapuja. Esiintyvyys kantajapopulaatioissa saattaa vaihdella paljon ja siitä on toistaiseksi hyvin vähän arvioita eikä lainkaan tutkimustietoa. Kantajadiagnostiikan testaus vaatii vielä loppujen tuotettujen näytteiden tutkimista, mahdollisesti uusien näytteiden hankkimista kokemuksen saamiseksi todellisista kantajapopulaatioista. Vääriä positiivisia tuloksia voidaan välttää tulkitsemalla tulosta riittävän tiukasti. Näyterapuja voidaan myös jakaa useaksi näytteeksi, ja jos vatsakilvestä saadaan heikko positiivinen, tulosta voidaan yrittää varmentaa tutkimalla ravun muita osia, esimerkiksi uimalevyt. Väärät negatiiviset ovat ongelma erityisesti terveyden todistamisessa. Näytemäärää voi olla syytä nostaa niin, että suurempi joukko (vähintään 60 rapua) tutkitaan ensin silmämääräisesti kuorivaurioiden varalta ja epäilyttävät otetaan ensisijaisesti jatkotutkintaan. Viljellyt ravut ovat tässä suhteessa vähemmän ongelmallisia, sillä pienemmänkin määrän tutkiminen säännöllisin välein lisää luotettavuutta. Lisäksi suurempia näytemääriä voidaan helposti käydä läpi silmämääräisesti ja kohdentaa näytteenotto vaurioituneisiin ja heikkokuntoisiin yksilöihin. PCR- menetelmän käyttöönotto viljelylaitosten tutkimisessa voidaan toteuttaa vuoden 2008 aikana. Norjan Eläinlääketieteellisen Instituutin kanssa on sovittu jatkoprojektista, jonka tarkoitus on mm. validoida reaaliaikainen PCR- menetelmä kenttänäytteille. Projekti alkaa syksyllä 2008.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 18 LOPPURAPORTTI: OSA E3 (Evira, Kuopion tutkimusyksikkö) LIITE 3 HANKEOSIO: Rapuruton siirtyminen emoista poikasiin: rapunäytteiden diagnosointi Satu Viljamaa-Dirks, Evira Tiivistelmä Yleistä: Tässä loppuraportin osassa kuvataan Riista- ja kalatalouden tutkimuslaitoksen (RKTL) toteuttaman täpläraputestauksen laboratoriodiagnostiikan osuus. Hankeosion tavoitteena oli tutkia rapuruton siirtymistä emoista jälkeläisiin viljelyoloissa. Osio toteutettiin aikavälillä helmikuu 2007 joulukuu 2007. Toteutus: Kokeisiin valittujen täplärapuemojen ruttotartunta varmistettiin eristämällä rapurutto ja tyypittämällä eristetyt kannat. Parittelun ja muninnan jälkeen naaraiden mädistä irrotettiin noin kaksi kolmannesta, joka määrä edelleen puolitettiin haudottavaksi kylvetysryhmään (Betadine 25 ja 50 ppm) ja kylvettämättömään ryhmään. Tässä vaiheessa mäti tutkittiin reaaliaikaisella PCRmenetelmällä. Huhti - toukokuun vaihteessa kuoriutuneet poikaset tutkittiin molemmista irtohaudotetuista ryhmistä sekä emojen alta reaaliaikaisella PCR-menetelmällä. Näytteenä käytettiin kokonaisia poikasia, 30-48 rapua ryhmästä. Elokuun lopussa poikasryhmät tutkittiin uudelleen. Tällöin näytteenä käytettiin poikasten vatsakilpeä, näytemäärä oli 26 rapua kustakin ryhmästä. Tulokset: Kokeen emoravut todettiin täpläraputyypin rapuruton kantajiksi. Reaaliaikaisella PCRmenetelmällä todettiin emojen mätimunissa rapuruton DNA:ta. Rapuruton DNA:ta todettiin pieni määrä myös emojen pyrstön alle jätetystä mädistä kuoriutuneista vastakuoriutuneista poikasista. Muissa poikasryhmissä rapurutto-dna:ta ei todettu. Tulosta vahvisti kesänvanhoista poikasista otettu uusintanäyte, jossa emojen alla kuoriutuneista poikasista saatiin useita positiivisia tuloksia, muiden ryhmien pysyessä edelleen kielteisinä. Johtopäätös: Rapuruton luonnollinen siirtyminen täplärapuemoista poikasiin varmistui. Irtohaudonta näyttäisi mahdollistavan rutottomien poikasten tuottamisen. Näytekoot olivat kuitenkin niin pieniä, että niiden perusteella ei voi vielä tehdä lopullista johtopäätöstä. 1 Tutkimusosion tarkoitus Tutkimusosion tarkoituksena oli tutkia rapuruton esiintymistä irtohaudonnalla tuotetuissa poikasissa, joiden emot ovat rapuruton kantajia. Täpläravun poikastuotanto tehtiin RKTL:n Evon laitoksella. Hankesuunnitelman mukaisesti irtohaudonnan merkitystä rutottomien poikasten tuotannossa tutkitaan tuottamalla poikasia numeroiduista emoista niin, että puolet poikasista siirretään irtohaudontaan ja puolet jätetään normaaliin haudontaan. Täpläravun poikasia suunniteltiin kerättäviksi näytteiksi kolmessa eri aikapisteessä mahdollisimman luotettavan rapuruton tunnistuksen aikaansaamiseksi. Eviran osuutena tutkimuksessa oli rapuruttokantojen eristäminen emoravuista, sekä rapuruton esiintymisen arviointi poikasissa rapuruton kantajien diagnostiikkaan kehitettävillä menetelmillä. 2 Tutkimusaineisto RKTL toimitti 19.1.2007 kaksikymmentä kpl täplärapuemoja ja yhden poolatun näytteen mätimunia alkutilanteen toteamiseksi. Emoista suurin osa, 17 kpl, oli silmämääräisesti rapuruton kantajia. Niillä esiintyi yhdestä useampaan melanisaatiolaikkua selkä- tai vatsakilvessä tai raajojen nivelissä. Seitsemässä ravussa ei todettu silmämääräisiä muutoksia. Emot eivät olleet mukana itse kokeessa, joten niitä ei ollut merkitty yksilöllisesti.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 19 RKTL toimitti vielä lisäerän emorapuja 3.5.2007 (14 kpl). Samassa yhteydessä toimitettiin ensimmäinen erä poikasnäytteistä. Poikasia oli 32 yksilöllisesti merkittyä erää, joissa kussakin useita poikasia. Poikaset olivat kolmesta eri ryhmästä: emon alta, irtohaudottuja ja irtohaudottuja, joissa jodikäsittely mätimunavaiheessa. Poikaset olivat vastakuoriutuneita ja muutaman mm pituisia. Koska poikasten tuotto ainakin joissakin ryhmissä oli odotettua huonompaa, päätettiin keskittää seuraava näytteenotto vain yhteen ajankohtaan riittävän otoskoon takaamiseksi. Kesänvanhat poikaset em. kolmesta ryhmästä saatiin tutkittavaksi syyskuun alussa. Poikasia oli kahdessa ryhmässä 33 kpl ja yhdessä 39 kpl. Poikasissa ei todettu silmämääräisesti kuorivaurioita. 3 Tutkimusmenetelmät 3.1 Emojen tutkiminen Emotutkimuksen pääasiallinen tarkoitus Evirassa oli todentaa emojen rapuruttotartunta sekä eristää mahdollisuuksien mukaan emojen kantamia rapuruttokantoja. Emojen tutkiminen tapahtui viljelymenetelmällä. Tutkittavat ravut säilytettiin jääkaappilämpötilassa ja tutkittiin kevään 2007 aikana. Itsekseen kuolleet ravut tutkittiin mahdollisimman nopeasti ja huonokuntoiset lopetettiin katkaisemalla pää. Ensimmäisen näyteryhmän ravut kuolivat aikavälillä 22.1-24.5. Ravuissa todettiin mikroskooppisesti rapuruttoa muistuttavaa rihmastoa melanisaatioläikissä. Rapuruton vaurioittamia kuorialueita leikattiin pieniksi paloiksi 70% alkoholin avulla desinfioidusta ravusta ja painettiin elatusaineeseen (PG-1, antibiootteja lisätty). Viljelmiä seurattiin mikroskoopin avulla vähintään viikon ajan tai kunnes kontaminaatiokasvu peitti ne. 3.2 Mätimunien tutkiminen Mätimunia säilytettiin ensin -70 ºC pakastimessa, kunnes tarvittava diagnostiikkamenetelmä oli riittävän pitkälle testattu. Mätimunat tutkittiin käyttäen kehitettävänä olevaa reaaliaikaista PCRmenetelmää. jota on tarkemmin selostettu jäljempänä osiossa 3 (Rapuruttodiagnostiikka). Mätimunia oli yksi erittelemätön ryhmä. Ryhmä jaettiin testausta varten kymmenen munan eriin, joista eristettiin DNA. Yhteensä tutkittiin 127 mätimunaa. 3.3 Poikasten tutkiminen Vastakuoriutuneet poikaset pakastettiin näytepurkeissaan odottamaan, että diagnostiikkamenetelmää oli testattu riittävästi. Poikaset tutkittiin käyttäen reaaliaikaista PCR-menetelmää. DNA eristettiin 3-5 poikasesta näytettä kohti. Tällöin otoskoko kussakin ryhmässä oli 30-48 rapua. Riippuen tutkittavan erän kokonaiskoosta, tautia voi vielä esiintyä yli 5% eläimistä, ilman että saataisiin yhtään positiivista tulosta. Otoksen suurentaminen ei kuitenkaan käytännössä ollut mahdollista, koska hautomistulos oli osittain huono, ja lisäksi käytettävä PCR-menetelmä rajoittaa tutkittavan materiaalin määrää. Vastaavalla tavalla käsiteltiin syksyllä näytteeksi tulleet kesänvanhat poikaset, paitsi että DNAeristys tehtiin yksilöllisesti kunkin ravun vatsakilvestä. Reaaliaikainen PCR testaus tehtiin 26 ravusta ryhmää kohti, jolloin saatiin ryhmä tutkittua kahdella testauskerralla. 4 Tulokset 4.1 Emot Täplärapuemot olivat silmämääräisesti ja mikroskooppisen tutkimuksen perusteella voimakkaasti rapuruton saastuttamia. Ne eivät kuitenkaan olleet akuutisti sairaita, koska aktiivista rapuruttorihmastoa melanisaatioalueiden ulkopuolella ei todettu. Rapuruttoa eristettiin viljelymenetelmällä kolme eri kasvustoa, jotka varmistettiin rapurutoksi spesifisellä PCR-menetelmällä. Viljelymenetelmä soveltuu huonosti rapuruton kantajien toteamiseen, koska rutto on yleensä paksun melanisaatiokerroksen peitossa. Vaurioalueilla viihtyvät bakteerit ja muut sienet ehtivät aloittaa kasvunsa ennen rutto-organismia, joka peittyy kontaminaatiokasvun alle tai ei lainkaan aloita kasvuaan.

Rapurutto hallintaan LOPPURAPORTTI 20 Kun rapuruton eristäminen ja varmistus oli saatu tehtyä, loput emoravut pakastettiin mahdollista myöhempää käyttöä varten (3.5. tullut erä). 4.2 Mätimunat Kaikissa tutkituissa mätimunaerissä todettiin todennäköisesti rapurutosta peräisin olevaa DNA:ta. Esiintymismäärissä ei ollut merkittäviä poikkeamia erien välillä. Esiintyvyys oli alhainen, lähellä alempana standardina käytettyä laskennallista 1 pikogramman määrää (kynnysarvo 43,55 sykliä, näytteet 39,63-43,28). 4.3 Poikaset Vastakuoriutuneista poikasista emoista irrotetut ryhmät, sekä kylvetetty että kylvettämätön, antoivat vain negatiivisia tuloksia. Emojen alta kuoriutuneissa poikasissa todettiin yksi heikosti positiivinen erä (kynnysarvo 42,81, alemmat standardit 1 pikogramma 41,46 ja 0,1 pikogrammaa 45,00). Kesänvanhoissa poikasryhmissä saatiin vastaavat tulokset. Kummastakaan emoista irrotetusta ryhmästä ei todettu rapuruton DNA:ta. Sen sijaan emojen alla kuoriutuneet poikaset olivat osittain positiivisia. Puolessa tutkituista poikasista (13 rapua) todettiin todennäköisesti rapurutosta peräisin olevaa DNA:ta. Kymmenessä näytteessä määrä oli 1pikogramman ja 100 nanogramman välillä, kolmessa 0,1 pikogramman ja 1 pikogramman välillä verrattaessa standardikäyriin. 5 Pohdinta Kokeen tarkoitus oli tutkia, voidaanko rapuruton siirtyminen emoista poikasiin estää irtohaudonnan avulla. Kokeessa käytettiin täplärapuemoja, jotka olivat voimakkaasti rapuruton saastuttamia. Emojen rapuruttotartunta varmennettiin viljelyllä ja spesifisellä PCR-testillä rapuruton puhdaskasvusta. Emojen kantama mäti tutkittiin uudella, rapuruton DNA:n osaa monistavalla menetelmällä, jonka herkkyys teoriassa riittää yhden itiön toteamiseen. Mädissä todettiin rapuruton DNA:ta sen irrotusvaiheessa. Vastakuoriutuneita poikasia tutkittaessa löydettiin rapuruton DNAta vain niistä poikasista, jotka olivat edelleen emon pyrstön alla. Sama tilanne säilyi kesän kasvatuksen aikana. Kesänvanhoista poikasista ainoastaan emojen alla kuoriutunut ryhmä antoi positiivisia tuloksia, sillä erolla että vastakuoriutuneissa tartunta oli hyvin alhaisella tasolla, kesänvanhoissa 50% ravuista näytti infektoituneilta, ja infektiotaso oli joissakin poikasissa jo melko korkea. Koska emokuolleisuus oli suurta ja poikasryhmät jäivät pieniksi, eri ryhmistä saatiin vain rajoitettu otos näytteenottokertaa kohti. Käytännössä tutkittiin noin kolmekymmentä rapua ryhmää kohti. Tällä otoskoolla saadaan 95% luotettavuudella ainakin yksi positiivinen rapu näytteeseen, jos taudin esiintyvyys on 5-10% populaatiotasolla, riippuen populaation koosta. Rapuruton kantajuutta tutkittaessa jo kesänvanhoista poikasista on valittava osa kuorta, koska poikanen on liian suuri käytettäväksi näytteeksi kokonaisuudessaan. Siksi heikosti infektoituneet ravut, joissa tartunta voi olla vain jossakin muussa osassa kuin nyt käytetyssä vatsakilvessä, voivat jäädä toteamatta. Tällä näytemäärällä ei siis voi kovinkaan luotettavasti osoittaa, että rapuruttoa ei ollut siirtynyt emon alta irrotettuihin poikasryhmiin. Koska kaikki irrotetusta mädistä peräisin olevat näytteet jäivät negatiivisiksi, voitiin kuitenkin osoittaa selkeä ero emon alle jätettyihin poikasiin, joilla jo kesänvanhoina oli selkeä rapuruttoinfektio. Sekä kylvettämättömästä että kylvetetystä mädistä saatiin vain negatiivisia tuloksia, joten näiden ryhmien välistä mahdollista eroa ei tällä koejärjestelyllä todettu. Poikastuotannon ollessa oletettua huonompaa otoskoot jäivät liian pieniksi, että kokeen kysymyksenasetteluun voitaisiin antaa luotettavaa vastausta. Rapuruton siirtyminen ruttoisista emoista poikasiin varmentui, ja infektoituminen näyttäisi tapahtuvan jo mätimunavaiheessa. Koska ryhmien välinen ero on selkeä kesänvanhojen poikasten kohdalla, emoista erillään kuoriutuneet poikaset näyttäisivät jollain tavoin pääsevän eroon tartunnasta tai ainakin kykenevän vähentämään sen määrää huomattavasti. Mahdollisesti puhdistautuminen tapahtuu jo kuoriutumisvaiheessa.