RAPURUTTO JA RAPUKANTOJEN HOITO

Transkriptio

1 RAPURUTTO JA RAPUKANTOJEN HOITO Satu Viljamaa-Dirks, ELL OIE rapuruton asiantuntija Tuotanto- ja villieläinterveyden tutkimusyksikkö, Kalajaosto Evira Kuopio OIE rapuruton vertailulaboratorio

2 Rapurutto-organismi Pohjois-Amerikkalaisten rapujen loinen Aphanomyces astaci (Schikora) Leväsienet Oomycetes-Saprolegniales- Aphanomyces Ekologien lokero ravun kuoressa Kasvulämpötila 4-24 ºC

3 Rapuruton elinkierto Kuva RKTL

4 Rapurutto isäntälajeissaan Pohjois-Amerikkalaiset lajit kantavat ruttoa yleensä oireettomasti: Pacifastacus leniusculus Procambarus clarkii Orconectes limosus ja noin 350 muuta lajia? Nopea puolustusreaktio rajoittaa rapuruton kasvua Lievässä tartunnassa täysin oireeton, mutta Suomen oloissa kehittyy typillisesti näkyviä melanisaatioita Puuttuvat raajat tyypillistä Akuutti tauti mahdollinen, kun tasapainotilanne horjuu: stressi, ruton runsastuminen

5 Oireet väärässä isäntälajissa Kaikki euroopalaiset,aasialaiset ja australialaiset rapulajit herkkiä sairastumaan akuutisti, oireena korkea kuolleisuus Usein näkyviä oireita ei ehdi kehittyä, sillä puolustusreaktio ei kerkiä reagoida ruton kasvuun Käytösmuuutokset: rapsutus,päiväaikainen aktiviteetti, halvaantuminen Kuolioisia (vaaleita) alueita vatsakilvessä Satunnaisesti myös melanisaatiota ja puuttuvia raajoja

6 Rapuruton tyypit Tunnetaan nykyään viisi erilaista genotyyppiä: As (group A): Astacus jokiraputyyppi. Alkuperäistä isäntälajia ei tunneta Ps1 (group B): Pacifastacus, Astacus, Austropotamobius täpläraputyyppi Ps2 (group C): Pacifastacus Pc (group D): Procambarus Or (group E): Orconectes Perustuu geneettiseen sormenjälkeen (RAPD- PCR) Olleet hyvin pysyviä (ei suvullista lisääntymistä!) (Huang et al 1994, Dieguez-Uribeondo et al 1995, Kozubikova et al 2011)

7 Rapuruton leviäminen Eurooppaan As PsI Pc Or 1984 Alkuperäinen piirros:martti Utriainen 1985

8 Rapuruttotapaukset Suomessa RKTL & Evira

9 Eri tyypit- erilainen taudinaiheutuskyky? Laboratoriotestit, jotka tehtiin Ps1-genotyypin kannalla, johtivat aina 100% kuolleisuuteen (Alderman et al 1987) Fürst (1995) ehdotti toistuvien istutusten epäonnistumisten syyksi Ruotsissa piilevää pysyvää rapuruttotartuntaa Suomessa todettiin eroja As ja Ps1 tyyppien aiheuttaman taudinkuvan välillä Piilevä As-tyypin rapurutto todettiin pienessä Taulajärvessä (Viljamaa-Dirks et al 2011)

10 Ympäristöolojen vaikutus rapuruton etenemiseen: Kemijoki Tartunta alajuoksulle 2005? As-tyypin rutto todettu loppukesästä 2006 Seuranta 2007: ruttoa löytyi Rovaniemen korkeudelle saakka, rapumäärät vähentyneet mutta ravustus jatkui Seuranta 2008: kolmea ruttoaluetta tutkittu (qpcr): Rovaniemi 11 / 29 positiivista Petäjäkoski 1/4 positiivista Taivalkoski 5 /26 positiivista Tilanne : ravut kadonneet Rovaniemeltä alavirtaan, yläpuolella edelleen rapuja ja ruttoa suuri joki, pohjoinen sijainti: suuri vesivolyymi harventaa itiömäärää, matala lämpötila vaikuttaa ruton kasvunopeuteen?

11 Rapuruttotutkimuksesta Paljon perustietoa aiheuttajasta ja rapujen puolustuskyvystä kerätty 1960-luvulta lähtien erityisesti ruotsalaisten englantilaisten ja saksalaisten tutkimusryhmien toimesta, silti: - Rapuruttodiagnostiikka oli epävarmaa ja hidasta -Istutusten epäonnistumisille ja krooniselle rutolle ei ollut selitystä -Eri rapuruttotyyppien ominaisuuksia ei tunnettu Tähän tarpeeseen yhteistyöprojektit Rapurutto hallintaan (RKTL, Evira ja Kuopion yliopisto) Rapurutto hallintaan II (Evira, RKTL, Metsähallitus)

12 Rapurutto hallintaan Tutkimus tähtäsi rapuruttotyyppien ominaisuuksien selvittämiseen ja rapuruttodiagnostiikan tehostamiseen. Projektissa oli kolme osakokonaisuutta: 1)Rapuruttotyyppien ja -kantojen ominaisuudet (epidemiologiset erot Evira, perinnölliset erot KuoY) 2)Rapurutto täpläravussa (RKTL koejärjestelyt,evira ja KuoY ruttoanalyysit) 3)Rapuruttodiagnostiikka (Evira uusien dg-menetelmien testaus, KuoY erotusdiagnostiikka) Projektia hallinnoi RKTL Raputalousohjelma

13 Hankkeen tuloksia: Tyypeillä ja kannoilla eroja taudinaiheutuskyvyssä Ps1-tyyppi virulentimpi Kuolleisuuden kehittyminen voi kestää kauan virulenssiltaan heikoilla ruttokannoilla Kitinaasigeenissä eroja eri tyyppien välillä, joka voi osaltaan selittää virulenssieroja

14 Rapuruton diagnostiikka Viljelymenetelmää sovellettu toimivammaksi Evirassa Molekyylibiologisia menetelmiä otettu käyttöön heti niiden tultua tietoon: Oidtmann et al 2004: 115 bp tuote ITS alueella, primerit 525 ja 640 Oidtmann et al 2006: 569 bp tuote samalla alueella (OIE metodi) primerit 42 ja 640, semi-nested 115 bp tuote kuten edellä Vrålstad et al (2009): Reaaliaikainen (kvantitatiivinen) PCR,59 bp tuote ITS-alueella, primerit APHArITS-44F ja APHArITS-102F, mittaus APHArITS-65T TaqMan minor grove binder (MGB) koetin. Tämä menetelmä otettiin käyttöön hankkeen aikana

15 Reaaliaikainen PCR Haasteita: Testattavan kuorenosan valinta DNA-eristyksen onnistuminen PCR-reaktion inhibiittorit, mm. melaniini Virheet testin suorittamisessa, mm. pipetoinnissa Laboratoriokontaminaatio Virhesitoutumiset reaktion loppupäässä Heikkojen positiivisten tulosten varmentaminen Negatiivisten tulosten varmentaminen

16 PCR-menetelmän testaus: altistuskoe Itiöpitoisuus 1 ja 10/ml, kolme ryhmää kussakin Altistuskanta As hidas 30 rapua 30 litrassa vettä, T C Yksi rapu kuollut 10 vrk kuluttua, jolloin koe päätettiin Jako ryhmiin A,B,C mikroskooppisen tutkimuksen perusteella, kaksi viimeistä vatsakilven jaoketta PCR-testiin A B C

17 number of crayfish Tulokset ryhmissä 1-3 (altistetut) ja 4 (kontrolli) A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A PCR not done PCR negative PCR weak positive PCR positive

18 Rutottomien täplärapujen tuotantomenetelmän testaus: M. Pursiainen, S. Viljamaa-Dirks, K. Määttänen. The production of plague-free crayfish offspring in aquaculture. International Association of Astacology 17 Symposium ( : Kuopio, Finland)

19 Raputalousohjelman osuudessa voitiin todeta täpläravuissa kroonisena esiintyvän ruton vaikuttavan merkittävästi mädin haudontatulokseen, kun mäti hautoutuu emojen pyrstön alla siten kuin luonnossa. Irrotettu mäti haudontalaitteissa, käsiteltiinpä sitä kylvetysaineella tai ei, säilyi puolestaan hengissä normaalisti myös ruttoisista emoista. Irtohaudotusta mädistä ja siitä kasvatetusta poikasista ei rapuruttoa voitu diagnosoida.

20 Rapuruton rooli jokirapukantojen hoidossa- vanhat käytännöt Rapuruton oletettiin hävittävän koko kannan Istutuksia tehtiin yleensä ilman tautitarkastuksia. Joskus makroskooppinen tai mikroskooppinen tutkimus Sumputuskokeita käytettiin lähinnä, kun rapukuolemien syyksi epäiltiin muuta kuin rapuruttoa Palautusistutukset mahdollisimman nopeasti UUDEN TIEDON MYÖTÄ TARVE MUUTTAA KÄYTÄNTÖJÄ- LISÄÄ KYSYMYKSIÄ

21 Rapurutto hallintaan II Hankkeessa testattiin edellytyksiä jokirapukantojen rapuruttotilanteen tutkimiselle istutusohjeistuksen perustaksi Tutkittavien populaatioiden valinta ja kuvaus RKTL Rapunäytteiden hankinta RKTL ja Metsähallitus Diagnostiikka ja hankkeen hallinnointi Evira Reaaliaikainen PCR (Vrålstad et al 2009) valittu diagnoosimenetelmäksi, koska herkin ja mahdollistaa myös ruton määrän arvioinnin

22 Jokirapukantojen tutkiminen rapuruton varalta Tiedetään, että jokiravut voivat kantaa latenttia tai kroonista As-typin rapuruttoa Istutusten onnistumiseksi vesistö on tutkittava piilevän ruton/taudinkantajien varalta, mutta myös siirrettävien rapujen taudittomuus on varmistettava Isäntä-loinen suhde on edelleen huonosti tunnettu jokiravun osalta Rapuruttotutkimuksen näytemäärän määrittämiseksi tunnettava paremmin

23 Tutkimukseen valittiin 10 populaatiota, joilla erilainen ruttotausta. Populaatiot jaettiin neljän luokkaan

24 Kaksi populaatiota tutkittiin kerran 2011, seitsemän kahdesti, 2010 ja 2011, ja yksi kolmesti, kerran 2010 ja kesä- ja elokuussa 2011 Luokasta riippuen satunnaisotos, koko saalis tai kohdistettu otanta Keskimäärin 54 rapua (9-93) Yhteensä 925 rapua

25 Populaatioiden ruttotilanteen kartoitus Rapuruttoa todettiin kaikissa luokan 4 kohteissa Ei löydetty luokista 1-3 Yksittäisiä positiivisia saatiin luokissa 1 ja 2, mutta tulkittiin vääriksi, koska ei muita tulosta tukevia löydöksiä joitakin mikroskooppisesti epäilyttäviä, mutta PCRnegatiivisia: muut oomykeetit?

26 Tuloksia prevalenssista Akuutti taudinpurkaus: Lamujoki /15 (93%) hitaasti etenevä: Simojoki: /52 (13%) /9 (0%) Kemijoki: /55 (4%) 2011/kesäkuu 3/67 (4%) 2011/elokuu 12/93 (13%) krooninen: Pyhäjärvi /58 (22%)

27 Oireellisten ja oireettomien vertailu population Symptomfree, pos/total % With spots, Pos/total % Simojoki 2/41 5% 5/11 45% Jokela /49 0% 2/6 33% Jokela 2011/6 2/53 4% 1/14 7% Jokela 2011/8 5/60 8% 7/33 21% Pyhäjärvi 4/48 8% 9/10 90%

28 Näytteenottokohdan valinta DNAn määrän vertaaminen A- ja B-näytteen välillä: sample Number of pos Ct, mean A without melanisation 24 36,55 B 17 28,72 A with melanisation 6 28,21

29 Päätelmät näytteenottoa varten Tarvittavaan näytemäärään vaikuttaa populaation koko, odotettu infektoituneiden määrä, ja testin herkkyys ja tarkkuus Luotettavuus kuitenkin aina alle 100% Jos oletetaan testin olevan 100% herkkä ja tarkka, populaation kooksi arvioidaan 5000 rapua ja odotettu tartunnan saaneiden määrä on 5%, luotettavuustasolla 95% täytyy testata 73 rapualiian kallis! Kohdennettu otanta samoissa olosuhteissa (odotus esiintyvyydestä 20%), vain 13 näytettä- 99% herkkyystasolla 20 näytettä

30 Suosituksia: Populaatioiden tutkiminen mahdollista, mutta rajallinen luotettavuus Lisätietoa tarvitaan ruton esiintymisestä erilaisissa ympäristöissä ja infektion eri vaiheissa Istutuksia varten vain luokan 1 luonnonvaraiset kannat suositeltavia Viljellyt ravut paremmin tutkittavissa, puhdasraputuotanto Diagnostiikan kehittäminen edelleen: itiöiden analysointi vedestä

31 Toimintatapoja rapuruton leviämisen ehkäisemiseksi Desinfektio itiöitä vastaan Istukkaiden terveystarkastukset Kroonisten ruttovesien tunnistaminen Tiedotus ja valistus Muiden vesistössä tapatuvien aktiviteettien huomioiminen: kalasiirrot, kalastusvälineet,veneily ym

32 Mitä tehdään kroonisille tartunnoille? Kun todetaan krooninen rapurutto heikossa jokirapukannassa: Korvataan täpläravulla? Istutetaan vain kaloja? Käytetään toista ruttokantaa hävittämään kantajat?

33 Kiitokset: Heinikainen Sirpa, Pelkonen Sinikka, Torssonen Hannu Pursiainen Markku, Mattila Jaakko, Rajala Joonas, Ruokonen Timo Laakkonen, Mika, Partanen Tapani, Sarajärvi Kari, Korhonen Pasi Ja lukuisat muut hankkeiden töihin osallistuneet Maa- Ja Metsätalousministeriö sekä Euroopan kalatalousrahasto hankkeiden rahoitukseen osallistumisesta Kiitos