Hevosen polven nivelruston mekaaniset veto-ominaisuudet Jarkko Iivarinen Luonnontieteiden kandidaatin tutkielma Fysiikan koulutusohjelma Kuopion yliopisto, Fysiikan laitos 10. maaliskuuta 2009
KUOPION YLIOPISTO, Luonnon- ja ympäristötieteiden tiedekunta Fysiikan koulutusohjelma, lääketieteellinen fysiikka Jarkko Iivarinen: Hevosen nivelruston mekaaniset ominaisuudet Luonnontieteiden kandidaatin tutkielma, 19 sivua Tutkielman ohjaaja: Rami Korhonen, FT, dosentti maaliskuu 2009 Avainsanat: hevonen, nivelrusto, mekaaniset ominaisuudet, vetokoe Tutkimuksessa verrattiin eri ikäisten hevosten nivelruston mekaanisia ominaisuuksia destruktiivisen vetotestauksen avulla. Sääriluun vartalonpuoleisen (proximal tibia) pään nivelrustoa mitattiin neljältä eri ikäryhmältä yhteensä 44 hevoselta. Mekaanisten ominaisuuksien määrittämiseksi mittauksista laskettiin seuraavat tunnusluvut: murtolujuus σ, murtovenymä ɛ, ruston katkeamiseen vaadittu energia W ja kimmokerroin E. Murtolujuus sai suurimmat arvonsa ikäryhmällä 5 kuukautta ja pienempiä sitä nuoremmilla ja vanhemmilla hevosilla. Murtovenymä sai pienimmät arvonsa vastasyntyneillä ja korkeampia arvoja vanhemmilla hevosilla. Kimmokertoimen arvo laski vastasyntyneistä lähtien hevosen vanhentuessa. Energia sai suurimmat arvonsa 11 kuukauden iässä ja pienempiä arvoja sitä nuoremmilla ja vanhemmilla hevosilla. Mekaaninen vetotestaus on tärkeä osa hevosen nivelruston biomekaanisten ominaisuuksien tutkinnassa, joten eläinkokeet ovat oikeutettuja.
Sisältö 1 Johdanto 4 2 Teoria 5 2.1 Ruston ominaisuuksista......................... 5 2.2 Ruston tutkiminen............................ 6 3 Tavoitteet 8 4 Materiaalit ja menetelmät 9 5 Tulokset 13 6 Pohdinta 16 Viitteet 18 3
1 Johdanto Nivelruston tutkimuskohteita sekä tapoja on useita. Mielenkiinnon kohteina ovat muun muassa iän, sukupuolen, ruokavalion, kuormituksen, ruston sijainnin ja paksuuden, näytteenottosyvyyden sekä nivelrikon vaikutukset nivelruston kemiallisiin, mekaanisiin ja anatomisiin ominaisuuksiin. Mekaaninen koestus on hyvä, mutta myös vaikea tapa tutkia ruston mekaanisia ominaisuuksia. Rustoa on tutkittu mekaanisesti puristamalla, vääntämällä sekä venyttämällä. Nyt käytetyssä destruktiivisessa in vitro -vetotestissä rustonäytettä venytettiin kunnes se katkesi. Mittaukset suoritettiin Kuopion yliopistossa BioMater-keskuksen ja anatomian laitoksen tiloissa. Tässä tutkimuksessa mitattiin hevosen nivelrustoa neljältä eri ikäryhmältä. Mittausten pohjalta määritettiin ruston mekaanisia ominaisuuksia neljän tunnusluvun avulla (murtolujuus σ, murtovenymä ɛ, kimmokerroin E ja energia W ). Hevosen nivelruston tutkimuksen tarkoituksena on sen ominaisuuksien ja niihin vaikuttavien asioiden tarkka ymmärtäminen. Tämä auttaa hevosen polvinivelten ongelmien (kuten nivelrikon) vähentämisessä ja ihanteellisten kasvatustapojen löytämisessä. Täten saadaan parannettua hevosten terveyttä. Eläinlajien välillä esiintyvän ruston samankaltaisuuden takia tuloksia voidaan soveltaa myös muihin eläimiin, sekä pohtia, voivatko samat tulokset päteä myös ihmisiin. Ruston monimutkainen rakenne ja ominaisuuksien suuri vaihtelevuus tarkoittaa, että ruston tutkimuksen saralla riittää työtä todella paljon niin biologeille, fyysikoille, kemisteille kuin myös lääkäreillekin. 4
2 Teoria 2.1 Ruston ominaisuuksista Rusto on tuki- ja liikuntaelimistön tärkeää tukikudosta. Elimistön kehityksen aikana rusto muodostaa mallin, mikä määrää kasvavien luiden muodon [25]. Myöhemmin rustoa esiintyy elimistön alueilla, missä vaaditaan kestävyyttä mekaanista kulutusta vastaan ja joustavaa, mutta kestävää kudosta, kuten luissa nivelien pinnoilla, kylkiluissa ja selkärangan nikamien välilevyissä. Nivelten pinnalla rusto toimii joustavana elementtinä, mikä suojelee luita rikkoontumiselta iskujen tai paineen seurauksena, sekä helpottaa nivelten liikkuvuutta. Rustosta puuttuu verisuonien lisäksi myös hermot. Siten ruston aineenvaihdunta perustuu diffuusioon. Nuorella iällä rusto voi kasvaa nopeasti, mutta kypsässä rustossa solut eivät jakaannu, joten sen korjaantuminen vaurioista on erittäin rajallista. Ikääntymisen yhteydessä rustoon saattaa lisäksi saostua mineraaleja, kuten kalsiumfosfaattia, mikä aiheuttaa ruston luutumista. Elimistöissä esiintyy kolmea eri rustotyyppiä: lasirusto (hyaliinirusto), keltainen elastinen rusto ja valkoinen syyrusto [7]. Tässä tutkielmassa tutkitaan lasirustoa, jota esiintyy esimerkiksi nivelrustossa, kylkirustossa sekä nenän ja henkitorven seinämissä. Lasirusto on rustotyypeistä yleisintä ja se muodostuu pääasiassa soluväliaineesta [26] eli matriksista, joka on kollageenisäikeiden ja proteoglykaanien (PG) muodostama verkosto. Matriksia muodostavat ja ylläpitävät rustosolut, kondrosyytit. Ne ovat pyöreitä ja sisältävät pääosin vettä, rasvaa ja glykogeenia. Rustossa solujen osuus on vain noin 1-10% koko ruston tilavuudesta [9]. Kollageenistä 90-95% on tyypin II kollageeniä. Nivelruston paksuus vaihtelee muutamasta mikrometristä (esimerkiksi hiirellä noin 50µm) pariin millimetriin (jopa 4-5mm ihmisellä), vaihdellen eläimestä ja luusta toiseen. Kollageenisäikeet tarjoavat rustolle kolmiulotteisen tukiverkon, joka sitoo PG-molekyylejä. PG:t ja kollageeni vaikuttavat ruston elastisiin ominaisuuksiin sekä sitovat ioneja ja vettä. Nivelrusto on elimistössä nivelpussissa, jossa on nivelnestettä (synovia). Nivelneste on viskoosia ainetta, jonka tehtävänä on voidella ja ravita nivelontelon rustoa. Nivelneste on korkealaatuista voiteluainetta, jonka tasolle on vaikea päästä teollisilla tuotteilla. Tämä takaa sen, että liikunnasta aiheutuva nivelen kuluminen on vähäistä. Niveltulehdus voi laskea nivelnesteen viskositeettiä ja aiheuttaa ruston nopeampaa kulumista. Kuvassa 1 on nivelruston poikkileikkauskuva. Sen pintavyöhyke on noin 5-10% ruston paksuudesta. Keskivyöhykkeen ja syvän vyöhykkeen suhteelliset osuudet vaihtelevat, mutta kumpikin alue voi olla jopa 45% ruston kokonaispaksuudesta [9]. Syvän vyöhykkeen ja kalkkeutuneen ruston välistä rajapintaa kutsutaan nimellä "tidemark". Kalkkeutuneen ruston matriksi on mineralisoitunutta ja sen tilavuus on noin 5-10% ruston kokonaistilavuudesta. Kollageenisäikeiden suunta riippuu etäisyydestä nivelruston pintaan. Syvällä rustossa (lähellä luuta) kollageenisäikeet ovat lähes pystysuorassa, kun taas lähellä ruston pintaa kollageenisäikeet kääntyvät pinnan suuntaisesti. Sen lisäksi ruston proteoglykaanipitoisuus on suhteellisesti vähäistä ruston pinnassa verrattaessa ruston syvempiin osiin. Sen lisäksi veden osuus pienenee syvyyden funktiona. Siten ruston mekaaniset ominaisuudet riippuvat syvyydestä. Nivelruston alhaisen liuoksen läpäisevyyden (permeabiliteetin) takia se vaimentaa tehokkaasti iskuja. Ruston sisältämä vesiliuos ei pääse virtaamaan nopeasti pois rus- 5
Kuva 1: Hahmotelma nivelruston poikkileikkauksesta. Kuvan merkinnät: 1. pintavyöhyke, 2. välivyöhyke, 3. syvävyöhyke, 4. kalkkeutunut rusto, 5. rustonalainen luu, 6. rustosoluja ja 7. kollageenisäie. tosta kuormituksen aikana, joten se kestää hyvin siihen kohdistuvien voimien aiheuttamia muodonmuutoksia. Mikäli kuormitus on pitkäaikaista, liuos pääsee hiljalleen virtaamaan pois rustosta sallien hitaan muodonmuutoksen. Tämä ruston sisältämän liuoksen virtausnopeus riippuu pääasiassa PG-konsentraatiosta [13] ja se suojaa nivelrustoa liian suurilta voimilta ja vaurioitumiselta [20]. 60-85% nivelruston märkäpainosta on tätä vesiliuosta [14]. 2.2 Ruston tutkiminen Ruston laatua voidaan tutkia mekaanisilla, yleensä in vitro -menetelmillä, erilaisilla in vitro - ja in vivo -kuvausmenetelmillä, mikroskopointiin perustuvilla in vitro - ja kemialliseen analyysiin perustuvilla menetelmillä. Mekaanisiin testeihin kuuluu puristus- ja vetotestaus, sekä myös lääkärin suorittama nivelten kunnon mekaaninen testaus, joka tosin on subjektiivinen testi, jolla havaitaan vain pitkälle edenneet nivelrikkotapaukset. Kuvausmenelmistä ruston tutkimisessa käytetyimmät ovat ultraäänija magneettikuvaus. Mikroskopointiin perustuvista menetelmistä ruston tutkimisessa tärkeimpiä ovat polarisaatiomikroskopointi ja safranin-o -värjäykseen perustuvat tutkimukset. Kemialliset analyysit kertovat ruston alkuaine- ja molekyylikoostumuksesta. Vetotestauksesta kerrotaan enemmän materiaalit ja menetelmät -osiossa. Puristuskokeissa tehdään yleensä sylinterin muotoinen rustonäyte, jota puristetaan mekaanisella tietokoneohjatulla laitteistolla. Ruston ominaisuuksia voidaan siten testata esimerkiksi tuottamalla rustoon siniaaltoista puristusta ja mittaamalla sen aiheuttamia voimia. Toinen mittaustyyppi (stress-relaksaatio) on puristaa rustoa esimerkiksi 6
2% ruston paksuuden verran ja mitata voimien muuttumista puristuksen jälkeen seuraavassa relaksaatiovaiheessa. Kolmas tapa (creep) mitata puristuskokeessa ruston ominaisuuksia on puristaa rustoa tietyllä vakiovoimalla ja mitata puristumaa [10]. Ruston laatua voidaan tutkia mekaanisen testauksen lisäksi myös esimerkiksi ultraäänen [15, 18, 22] sekä magneettikuvauksen [4] avulla. Ruston laadun tutkiminen tähtää sen rakenteen tarkkaan tuntemukseen ja ruston ongelmien (kuten nivelrikon) havaitsemiseen mahdollisimman varhaisessa vaiheessa. Nivelrikon havaitseminen varhaisessa vaiheessa voi olla hyödyllistä, koska nivelrikon etenemistä voi olla mahdollista hidastaa [2]. Ultraääni kulkee parhaiten kiinteässä aineessa, huonommin nesteissä ja heikosti ilmassa. Rustosta suurin osa on vettä, mitä voidaan pitää ultraäänimittauksia vaikeuttavana asiana. Invasiiviset menetelmät ovat siten myös ultraäänimittauksessa helpompia ja luotettavampia, mutta myös rajaavat mittausten kohderyhmää. Kollageenisäikeistön ominaisuuksia voidaan tutkia esimerkiksi polarisaatiomikroskoopilla [17] (kuva 2) ja proteoglykaanien määrää safranin-o -värjäyksellä [8]. Polarisaatiomikroskoopin avulla selville saaduista tunnusluvuista tärkeimmät ovat Kuva 2: Polarisaatiomikroskoopilla saatu kuva tibian nivelruston poikkileikkauksesta. Alimmaisin voimakkaasti haaroittunut kerros on luuta, välikerros rustoa, ja ylin musta kerros ilmaa. kollageenisäikeistön orientaatio ja anisotropia syvyyden suhteen. Orientaatio kertoo kollageenisäikeiden keskimääräisen suunnan ja anisotropia säikeistön suunnan tasalaatuisuuden. Safranin-O -värjäyksellä saadaan väriaineen positiiviset kationit tarttumaan anionisiin proteoglykaaneihin. Mikroskooppisilla menetelmillä voidaan siten mitata väriaineen kertymää ja saada suoraan kvantitatiivinen tulos proteoglykaanien määrästä ruston eri kerroksissa. Kemiallisilla analyyseillä voidaan selvittää ruston sisältämien aineiden määriä ja suhteellisia osuuksia. Esimerkiksi kollageenin ja proteoglykaanien määrät ja osuudet ovat suosittuja mittauskohteita. Nivelruston kuivapainosta kollageeni muodostaa 60-80% ja noin 20% märkäpainosta. Proteoglykaanit taas muodostavat 20-40% nivelruston kuivapainosta ja noin 5-10% märkäpainosta [19]. 7
3 Tavoitteet Työn tavoitteena oli tutkia kollageenin mekaanisten ominaisuuksien muutoksia ikääntymisen seurauksena. 8
4 Materiaalit ja menetelmät Tutkimuksessa oli käytössä neljä eri näyteryhmää: vastasyntyneet, 5 kuukauden, 11 kuukauden ja 6-10 vuoden ikäiset hevoset. Ikäryhmää 6-10 vuotta kutsutaan jatkossa aikuisten hevosten ryhmäksi. Hevosten annettiin laiduntaa vapaasti, eikä niitä valmennettu systemaattisesti. Rustonäytteiden kokonaismäärä (N) oli 44 ja näyteryhmien koot vaihtelivat välillä 9-15 näytettä. Rustoa kerättiin sääriluun vartalonpuoleisesta päästä (proximal tibia, kuva 3). Näytepalasista leikattiin mikrotomilla ruston pinnasta kaksi keskimäärin 155µm pak- Kuva 3: Rustonäytteiden keräyskohdat tibian proksimaalisesta päästä, merkattu numeroilla 1 ja 2. suista suorakulmion muotoista siivua, joista syvemmältä saatua käytettiin mittauksiin, koska pinnasta leikatun siivun tasapaksuisuudesta ja -laatuisuudesta ei voitu olla varmoja. Rei itetyn pleksilasilevyn ja 4mm stanssin avulla kuhunkin näytteeseen tehtiin keskialueelle ohuempi kohta (kuva 4) [6, 16], jota kutsutaan jatkossa kannakseksi. Kannaksen valmistumisen jälkeen mitattiin rustonäytteen paksuus ja kannaksen ohuimman kohdan leveys. Kannaksen keskimääräinen leveys oli 1860 µm. Kuva 4: Valmiin rustonäytteen hahmotelma. Näytteen mitat eivät ole oikeassa mittasuhteessa. Rustonäytteiden kannaksen leveys mitattiin tietokoneavusteisella stereomikroskoopilla (Leica MX75 stereomicroscope, Leica Microsystems Ltd., Heerbrugg, Switzerland; Nikon Camera Head DS-5M and Camera Control Unit DS-L1, Nikon Corporation, Tokyo, Japan). Näytteiden paksuus mitattiin standardipuristuksen takaavalla digitaalisella mikrometrillä (Mitutuyo 0-25mm, tarkkuus ±0.001mm, NO. 293-561-30 (7185929), Japan). Vetotestaus suoritettiin tietokoneohjatulla mekaanisella 9
koestuslaitteella (Lloyd LFPlus, Lloyd Instruments Ltd, An Ametek Company, 12 Barnes Wallis Road, Fareham, UK) (kuva 5). Matlab-ohjelmistoa (Matlab 7.0, The Kuva 5: Lloyd LFPlus -mittalaite, jolla suoritettiin ruston mekaaniset testaukset. Mathworks, 3 Apple Hill Drive, Natick, Massaschusetts 01760-2098, USA) käytettiin mittaustiedostojen analysointiin. Näytteitä säilytettiin näyteputkissa -20 C:n vakiolämpötilassa. Ennen vetotestausta näytteitä pidettiin huonelämpötilassa kunnes näyteputkissa ollut jää oli sulanut. Jään sulettua näytteet nostettiin vesihauteeseen odottamaan vetotestausta. Testauksen jälkeen näytteet jäädytettiin uudestaan. Näytteitä säilytettiin näyteputkissa koko prosessin ajan (paitsi mittausvaiheen aikana) fysiologisessa fosfaattipuskuroidussa liuoksessa, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (2mM EDTA, 5mM benzamidine HCL, 10mM N- ethylmaleimide, ph 7.0-7.5) [5]. Samaa liuosta käytettiin näytteen kosteuttamiseen valmistuksen ja mittausten ajan. Vetotestin aikana rusto asemoitiin näytepitimillä siten, siten että kannaksen alue sijaitsi pidinten välissä. Tällä pyrittiin maksimoimaan todennäköisyys sille, että ruston katkeaminen tapahtuisi kannaksen ohuimmalta kohdalta (kuva 6). Näytteen tiukan kiinnityksen takaamiseksi näytepidinten pintaan liimattiin hiekkapaperia (karkeus P360). Näytepidinten puristus tapahtui Lloyd-laitteistossa jousilla, jotka takasivat saman puristusvoiman jokaiselle näytteelle. Kaikki näytteet vedettiin poikki vakionopeudella 5mm/min. Näytepidinten välimatka ennen mittauksen aloittamista mitattiin jokaiselle näytteelle erikseen. Mittauksen aikana tallennettiin mittaustiedostoon jatkuvasti aikaa, voimaa sekä näytepidin10
Kuva 6: Rustonäytteen asemointi näytepitimillä, sekä oletettu katkeamiskohta. ten paikkaa (ruston venymistä). Voima-venymä -tietojen avulla laskettiin seuraavat tunnusluvut: ruston katkeamiseen vaadittu voima F ja venytys L (kuva 7). Näytteen Kuva 7: Käyrä katkeamiseen vaaditun voiman F ja venytyksen L määrittämiseksi. oletettiin olevan suorassa ja sopivassa alkukuormassa, kun 0.05N voima saavutettiin. Näytteen alkuperäinen pituus l 0 (kannaksen pituus) oli siten pidinten etäisyyden ennen testausta ja alkukuormaan vaaditun venytyksen summa. Näytteen suhteellinen venymä (strain) ɛ [21] saatiin kullekin näytteelle i yhtälöllä ɛ i = l i l 0,i. (1) Murtovenymän ɛ m (ultimate elongation) arvo saatiin pisteestä l = L, eli kohdassa, jossa näytteen pituuden muutos oli katkeamispituuden ja alkukuormapituuden 11
erotus. Jatkossa murtovenymää merkataan ɛ:llä. Poikkipinta-ala A saatiin kertomalla aiemmin mitatut kannaksen leveys ja näytteen paksuus keskenään. Jännitys (stress) σ on määritelty näytteeseen kohdistetun vetovoiman F ja näytteen i alkuperäisen poikkipinta-alan A osamääränä σ i = F i A i. (2) Murtolujuuden σ m (ultimate tensile strength) arvo saatiin pisteestä F = F max. Jatkossa murtolujuutta merkataan σ:lla. Kimmokerroin (Young s modulus) E laskettin jännitys-venymä -käyrien avulla (kuva 8). Suora sovitettiin jännitys-venymä -käyrän Kuva 8: Käyrä Youngin modulin E ja ruston katkeamiseen vaaditun energian W määrittämiseksi. lineaariselle osalle, minkä oletettiin olevan venymän 0-0.15 (0-15%) alue [1]. Sovitetun suoran kulmakerroin oli kimmokerroin. Ruston katkeamiseen vaadittu energia (toughness) W saatiin numeerisesti integroimalla jännitys-venymä -käyrää alkukuorman venymästä murtovenymään asti (kuva 8). [23, 24] Kunkin tunnusluvun vaihtelua arvioitiin keskihajonnan SD (standard deviation) avulla N x 2 i SD = ( x i ) 2. (3) N(N 1) SPSS-ohjelmiston (SPSS 16.0, SPSS Inc., 233 S. Wacker Drive, Chicago, Illinois 60606, USA) Mann-Whitney U -testillä etsittiin jokaisen tunnusluvun kohdalla eri ikäryhmillä statistisesti merkittäviä eroavaisuuksia. 12
5 Tulokset Saadut tulokset esitellään taulukoissa 1-3 ja kuvissa 9-12. Taulukko 1: Lasketut keskiarvot näytteen paksuudelle, leveydelle ja poikkipinta-alalle A, sekä keskihajonnat (±SD). N tarkoittaa näytteiden lukumäärää. N paksuus(µm) leveys(µm) A(mm 2 ) aikuiset 15 150 ± 50 1890 ± 140 0.27 ± 0.10 11kk 11 150 ± 20 1910 ± 90 0.28 ± 0.04 5kk 9 120 ± 20 1830 ± 110 0.23 ± 0.04 vastasyntyneet 9 140 ± 30 1910 ± 50 0.26 ± 0.07 Taulukko 2: Lasketut keskiarvot sekä keskihajonnat (±SD) eri ikäryhmille kullekin tunnusluvulle: murtolujuus σ, murtovenymä ɛ, kimmomoduli E ja energia W. N tarkoittaa näytteiden lukumäärä. N σ(mpa) N ɛ(%) N E(MPa) N W/A(kJ/m 2 ) aikuiset 15 8 ± 3 14 1.3 ± 0.3 14 6 ± 3 13 17 ± 4 11kk 11 15 ± 3 9 1.3 ± 0.3 9 11 ± 6 9 26 ± 6 5kk 9 17 ± 4 9 0.6 ± 0.2 9 22 ± 10 9 17 ± 6 vastasyntyneet 9 15 ± 6 9 0.37 ± 0.07 9 31 ± 14 9 7 ± 4 Taulukko 3: Mann-Whitney U -testillä lasketut merkittävyysarvot p tunnusluvuille murtolujuus σ, murtovenymä ɛ, kimmokerroin E ja energia W eri ikäryhmien välillä. Lihavoidut arvot kuvaavat ryhmiä, joiden välillä on statistisesti merkittävä eroavaisuus (p < 0.05). Ryhmä 1 tarkoittaa vastasyntyneitä, ryhmä 2 ikää 5kk, ryhmä 3 ikää 11kk ja ryhmä 4 aikuisia hevosia. ryhmät p σ p ɛ p E p W 1&2 0.508 0.003 0.171 0.001 1&3 0.790 0.000 0.004 0.000 1&4 0.009 0.000 0.000 0.000 2&3 0.138 0.012 0.005 0.009 2&4 0.000 0.002 0.000 0.920 3&4 0.000 0.378 0.068 0.002 13
Kuva 9: Mittausten perusteella lasketut tulokset murtolujuudelle σ eri ikäryhmissä. Tuloksista esitetty keskiarvo±sd. Aikuisten ikäryhmää merkattu 6-vuotiaina. Kuva 10: Mittausten perusteella lasketut tulokset murtovenymälle ɛ eri ikäryhmissä. Tuloksista esitetty keskiarvo±sd. Aikuisten ikäryhmää merkattu 6-vuotiaina. 14
Kuva 11: Mittausten perusteella lasketut tulokset kimmokertoimelle E eri ikäryhmissä. Tuloksista esitetty keskiarvo±sd. Aikuisten ikäryhmää merkattu 6-vuotiaina. Kuva 12: Mittausten perusteella lasketut tulokset ruston poikkipinta-alalla A normalisoidulle energialle W eri ikäryhmissä. Tuloksista esitetty keskiarvo±sd. Aikuisten ikäryhmää merkattu 6-vuotiaina. 15
6 Pohdinta Saatu murtolujuuden σ kuvaaja (kuva 9) kertoo, että hevosen ruston tapauksessa murtolujuus kasvaa noin viiden kuukauden ikään asti ja laskee sen jälkeen. Murtovenymä ɛ kasvaa nopeasti noin vuoden ikään asti, jonka jälkeen sen kehitys pysähtyy, ollen samana aikuiseksi asti (kuva 10). Kimmokerroin E kertoo, että ruston jäykkyys pienenee vauhdilla noin vuoden ikään asti ja sen jälkeen pienenee hitaasti aikuisikää lähestyttäessä (kuva 11). Ruston katkaisemiseen vaadittu energia W lisääntyy vastasyntyneiden rustosta aina noin vuoden ikään asti, kunnes sen arvo lähtee laskemaan aikuisikää lähestyttäessä (kuva 12). Yleisesti hevosen rusto muuttuu sitkeämmäksi ja sen elastinen jäykkyys pienenee. Eri eläimillä voidaan saada erilaisia tuloksia, joten nyt saatua tulosta ei voi yleistää. Tutkimusten mukaan nautaeläimillä rusto muuttuu jäykemmäksi sen vanhetessa [3]. Kyseisessä nautaeläinten tutkimuksessa käytettiin kuitenkin useiden tuntien pituisia puristuskokeita tasapainomoduulin selvittämiseksi, joten mitattiin PG:n ominaisuuksia. Tässä tutkimuksessa taas selvitettiin suurilla vetonopeuksilla instanttia moduulia, eli mitattiin kollageenin ominaisuuksia. Siten kyseisiä tutkimuksia ei kannata verrata keskenään. Puristuskokeissa ruston sisältämän liuoksen virtaus vaikuttaa saatuihin tuloksiin, siten että suurilla puristusnopeuksilla nesteen vaikutus on suurempi kuin pienillä. Vetokokeissa ruston sisältämän liuoksen vaikutus on merkityksetön [12]. Eri ikäryhmien mittauksista saatujen kuvaajien välillä ei havaittu selviä eroavaisuuksia näytteen venymisessä (esimerkiksi kuva 8). Siten esimerkiksi yhden ikäryhmän käyrät eivät olleet lineaarisesti kasvavia toisten kasvaessa eksponentiaalisesti, eli kaikki ikäryhmät käyttäytyivät mittauksessa samalla lailla. Nyt saatuja tuloksia voisi selittää ruston pintakerrosten muutoksilla ikääntymisen seurauksena. Siten olisikin hyödyllista tehdä Safranin-O- ja polarisaatiotutkimuksia kyseisille näytteille, jotta saataisiin selville, millaisia muutoksia kollageenin orientaatiossa ja proteoglykaanien määrässä tapahtuu eläimen ikääntyessä. Jokaisen tunnusluvun (kuvat 9-12) tapauksessa olisi ollut mielenkiintoista tutkia useampaa ikäryhmää viiden kuukauden ja kahden vuoden välillä, mikä olisi tarkentanut tietoa ruston ominaisuuksien kehittymisestä hevosen nuoruudessa. Olisi ollut myös hyödyllistä nostaa näytekoot yli viidentoista tulosten luotettavuuden parantamiseksi. Jatkossa olisi hyödyllistä tutkia myös tunnuslukujen riippuvuutta näytteenottosyvyydestä. Tästä saataisiin tarkempaa tietoa kollageenisäikeiden ja PG:n määrän muutosten vaikutuksesta ruston mekaanisiin ominaisuuksiin, varsinkin jos ne yhdistettäisiin kemiallisten testien tuloksiin. Tähän mennessä tehtyjen tutkimusten mukaan kimmokertoimen arvo kasvaa puristuskokeessa [11] ja laskee vetokokeessa [1] syvemmälle rustossa mentäessä. Voitaisiin tutkia myös hevosia, joita on kasvatettu eri kuormitusmäärillä. Ryhminä voisi olla esimerkiksi hevoset, joiden on annettu liikkua vapaasti, sekä ryhmä, jota on kasvatettu ammattimaisesti ravihevosiksi. Näistä tutkimusmenetelmistä saatavat tulokset saattaisivat antaa ohjeita hevosten kasvattajille, jotta saataisiin aikaan mahdollisimman tervettä ja hyvälaatuista rustoa. Siten saatavien tuloksien soveltuvuutta ihmisiin voitaisiin myös pohtia. Jatkossa voitaisiin tutkia myös onko nivelrikkoisten aikuisten hevosten nivelruston mekaanisissa ominaisuuksia eroavaisuuksia terveisiin nähden. Ongelmakohta vetokokeessa on aina näytteen kiinnitys. Tarkoituksena on käyttää kiinnitystapaa, joka takaa sen, ettei näyte ala liukua kesken venytyksen, mutta 16
on kuitenkin tarpeeksi hellä, ettei itse kiinnitys vaurioita näytettä muuttaen saatavaa mittaustulosta. Tässä kokeessa näytteiden kiinnitys oli tyydyttävä, koska näytteet olivat ohuita ja tasapaksuja ja näytepidinten pintoja oltiin karhennettu hiekkapaperilla, joten nähtiin kiinnitystapa helläksi, mutta luotettavaksi. Sen lisäksi Lloyd-laitteiston jousilla tapahtuva näytteiden puristus leukojen väliin takasi jokaiselle näytteelle tasalaatuisen kiinnityksen. Kunkin näyte-eläimen painosta tai liikunnan tarkemmasta määrästä ei ollut tietoa, joten eläinkohtaista analyysiä kuormituksen vaikutuksesta saatuihin tuloksiin ei pystytty tekemään. Siten ei voitu erotella vähän ja paljon liikkuvia yksilöitä toisistaan. Saatuja tuloksia voidaan olettaa tyydyttäviksi keskimääräisen kokoisen ja aktiivisen hevosen kohdalla. Ei ollut myöskään tietoa onko kaikkia hevosia ruokittu yhtä paljon vai ovatko jotkin hevoset saaneet enemmän esimerkiksi ravintolisiä, jotka ovat mahdollisesti voineet vaikuttaa ruston laatuun ja siten saatuihin mittaustuloksiin. Huoneen lämpötilalla on merkitystä luiden biomekaanisiin ominaisuuksiin (2-5% muutos kimmokertoimeen lämpötilan muuttuessa 37 C 23 C) [21], joten sillä voi olla vaikutusta myös ruston ominaisuuksiin. Pitkän mittaussession aikana huoneen lämpötila on voinut nousta useita asteita, koska mittaushuone oli pieni ja huonolla ilmanvaihdolla varustettu. Lämpötilaa ei mitattu missään vaiheessa, eikä sen tasalaatuisuutta tarkkailtu. Tosin kunkin näytteen mittausaika oli vain parin minuutin luokkaa, ja näytteitä säilytettiin jäähauteessa, joten huoneen lämpötilasta aiheutuneet virheet mittaustuloksiin olivat lähes olemattomia. Ruston lineaarisen venymisen alue on noin 0-15% ruston pituudesta, joten kimmokertoimen määrittämiseksi kyseinen alue sopii [1], mutta yleisesti muille materiaaleille olisi sopivampaa käyttää esimerkiksi 0-15% murtolujuudesta. Monet jäykät materiaalit eivät veny edes 5% ennen murtumista. Siten murtolujuuden käyttö skaalautuisi aina materiaalin ominaisuuksien mukaan tehden kyseisestä tunnusluvun määritelmästä yleiskäyttöisemmän. Näytteiden jäädytyksellä ei ole merkitystä ruston mekaanisiin ominaisuuksiin ihmisillä eikä nautaeläimillä [6]. Ruston samankaltaisuuden takia oletettiin siten ettei näytteiden jäädytyksellä ollut vaikutusta nyt saatuihin tuloksiin. 17
Viitteet [1] Akizuki S, Mow VC, Müller F, Pita JC, Howell DS, Manicourt DH. Tensile Properties of Human Knee Joint Cartilage: I. Influence of Ionic Condition, Weight Bearing, and Fibrillation on the Tensile Modulus. Journal of Orthopaedic Research 4:379-392, 1986. [2] Buckwalter JA, Martin J. Degenerative joint disease. Clin Symp 1995;47(2):1-32. [3] Charlebois M, McKee MD, Buschmann MD. Nonlinear tensile properties of bovine articular cartilage and their variation with age and depth. J Biomech Eng 2004;126(2):129-137. [4] Eckstein F, Adam C, Sittek H, Becker C, Milz S, Schulte E, Reiser M, Putz R. Non-Invasive Determination of Cartilage Thickness Throughout Joint Surfaces Using Magnetic Resonance Imaging. J Biomechanics 1997;Vol. 30, No.3:258-289. [5] Frank EH, Grodzinsky AJ, Koob TJ, Eyre DR. Streaming potentials: a sensitive index of enzymatic degradation in articular cartilage. J Orthop Res 1987;5:497-508. [6] Gratz KR, Wong VW, Chen AC, Fortier LA, Nixon AJ, Sah RL. Biomechanical assessment of tissue retrieved after in vivo cartilage defect repair: tensile modulus of repair tissue and integration with host cartilage. Journal of Biomechanics 2006;39:138-146. [7] Warwick R, Williams PL. Gray s anatomy, 35th edition. 1973. Longman. [8] Hyttinen MM, Arokoski JPA, Parkkinen JJ, Lammi MJ, Lapveteläinen T, Mauranen K, Király K, Tammi MI, Helminen HJ. Age matters: collagen birefringence of superficial articular cartilage is increased in young guinea-pigs but decreased in older animals after identical physiological type of joint loading. Osteoarthritis and Cartilage 2001;9:694-701. [9] Király K. Quantitative Microscopy of Proteoglykans and Collagen in Articular Cartilage. 1997. Kuopion yliopiston julkaisuja D. Lääketiede 138. ISBN 951-781- 658-8. [10] Korhonen R. Experimental Analysis and Finite Element Modeling of Normal and Degraded Articular Cartilage. Mechanical Response of Poroelastic, Anisotropic and Inhomogenous Tissue. 2003. Kuopion yliopiston julkaisuja C. Luonnontieteet ja ympäristötieteet 163. ISBN 951-781-301-5. [11] Laasanen MS, Töyräs J, Korhonen RK, Rieppo J, Saarakkala S, Nieminen MT, Hirvonen J, Jurvelin JS. Biomechanical properties of knee articular cartilage. Biorheology 2003;40(1-3):133-140. [12] Li LP, Herzog W. The role of viscoelasticity of collagen fibers in articular cartilage: Theory and numerical formulation. Biorheology 2004;41:181-194. [13] Mow VC, Holmes MH, Lai WM. Fluid transport and mechanical properties of articular cartilage: a review. J Biomech 1984;17(5):377-394. 18
[14] Mow VC, Ratcliffe A, Poole AR. Cartilage and diarthrodial joints as paradigms for hierarchical materials and structures. Biomaterials 1992;13(2):67-97. [15] Nieminen H. Acoustic Properties of Articular Cartilage: Effect of Composition, Structure and Mechanical Loading. 2007. Kuopion yliopiston julkaisuja C. Luonnontieteet ja ympäristötieteet 211. ISBN 978-951-27-0689-1. [16] Richmon JD, Sage AB, Wong VW, Chen AC, Pan C, Sah RL, Watson D. Tensile Biomechanical Properties of Human Nasal Septal Cartilage. American Journal of Rhinology 2005;Vol. 19, No. 6:617-622. [17] Rieppo J, Hallikainen J, Jurvelin JS, Kiviranta I, Helminen HJ, Hyttinen MM. Practical Consideration in the Use of Polarized Light Microscopy in the Analysis of the Collagen Network in Articular Cartilage. Microscopy Research and Technique 2008;71:279-287. [18] Saarakkala S, Laasanen MS, Jurvelin JS, Törrönen K, Lammi MJ, Lappalainen R, Töyräs J. Ultrasound indentation of normal and spontaneously degenerated bovine articular cartilage. Osteoarthritis and Cartilage 2003;11:697-705. [19] Saarakkala S. Pre-Clinical Ultrasound Diagnostics of Articular Cartilage and Subchondral Bone. 2007. Kuopion yliopiston julkaisuja C. Luonnontieteet ja ympäristötieteet 205. ISBN 978-951-27-0683-9. [20] Soltz MA, Ateshian GA. Experimental verification and theoretical prediction of cartilage interstitial fluid pressurization at an impermeable contact interface in confined compression. Journal of Biomechanics 1998;31:927-934. [21] Turner CH, Burr DB. Basic Biomechanical Measurements of Bone: A Tutorial. Bone 1993;14:595-608. [22] Töyräs J, Nieminen HJ, Laasanen MS, Nieminen MT, Korhonen RK, Rieppo J, Hirvonen J, Helminen HJ, Jurvelin JS. Ultrasonic characterization of articular cartilage. Biorheology 2002;39(1-2):161-169. [23] Teräsopas: http://www.elisanet.fi/harri.nevalainen/tietoisk/staattisetlsot.htm (viitattu 10.3.2009) [24] Mechanical Properties of Polymers: http://pslc.ws/mactest/mech.htm (viitattu 10.3.2009) [25] Kuopion yliopiston anatomian laitoksen histologian web-oppikirja: http://www.uku.fi/anatomia/histoweb/rusto.htm (viitattu 29.12.2008) [26] Wikipedia, vapaasti muokattava tietosanakirja: http://fi.wikipedia.org/wiki/tukikudos (viitattu 29.12.2008) 19