Fermentoinnin toteutustavat 1. Panosfermentointi

Transkriptio

1 Fermentoinnin toteutustavat 1. Panosfermentointi jokaista panosta varten tuotetaan oma siirroste (engl. inoculum; monikko inocula) siirrostelinjassa (inoculum train) varsinainen tuotantoreaktori (fermentori) valmistellaan panosta varten, siirrostetaan, solut kasvavat ja tuottavat tuotteen, fermentointi lopetetaan, tuote otetaan talteen (talteenottoprosessi eli jälkikäsittelyprosessi; DSP: downstream processing) fermentointipanoksen aikana fermentoriin ei lisätä (merkittäviä määriä) ravinteita eikä fermentorista oteta pois prosessilientä (= kasvuliuosta = fermentation broth) tuotettua solumassaa hyödynnetään vain kussakin panoksessa Missä kasvuvaiheessa kannattaa siirrostaa pienemmästä isompaan fermentoriin? 1

2 .Panosfermentointi yksinkertainen toteutus; sopii sekä prim. että sek. metaboliiteille pienin riski kontaminaatioille ja tuotantokannan muutoksille (esim. muutokset geenitasolla eli kannan degeneraatio, palautuminen tai plasmidilukumäärän pieneneminen vähäisiä) tuotettua solumassaa hyödynnetään huonosti tuotantoon liittyy paljon luppoaikaa (downtime): panoksen valmistelu, sterilointi, lag-vaihe, fermentorin tyhjennys panoksen jälkeen ja pesu panosfermentoinnissa ei solut tai prosessi ehdi olla steadystate tilassa juuri lainkaan useat panosprosessit on muutettu fed-batch toteutukseen Kaasujen syöttö ja poisto (aerobiset kasvatukset) ei muuta batch-luokitusta panosfermentointi sopii edelleen hyvin, kun prosessi sietää huonosti fed-batchissä syötettävien komponenttien paikallisia pitoisuuseroja (epähomogeenisuus) Miksi tämä korostuu fed-batchissä? 2

3 puolipanoskasvatus Fermentoinnin toteutustavat 2. Fed-batch -fermentointi sopii kaikentyyppisille tuotteille, erityisesti sek. metaboliiteille hyödyntää solumassaa hieman paremmin kuin panosfermentointi syötön avulla voidaan järjestää joidenkin muuttujien suhteen steadystate (= quasi-steady-state); usein tavoitteena välttää ns. overflowmetabolia tai solujen helposti käyttämän hiililähteen (carbon- eli C- source) aiheuttama kataboliittirepressio (ccr: carbon catabolite repression) sovelluksia runsaasti: entsyymien tuotto, antibioottien tuotto, indusoitu proteiinien heterologinen tuotto, aminohappojen tuotto, leivinhiivan tuotto 3

4 4

5 Fed-batch -fermentointi Aloitetaan panoksena Kun kasvu on edennyt haluttuun vaiheeseen, aloitetaan jonkin komponentin syöttö (korkeassa pitoisuudessa) fermentoriin Syöttö lopetetaan viimeistään fermentorin täytyttyä. Seuraavaksi fermentointi lopetetaan ja aloitetaan jälkikäsittelyprosessi. Ja sitten taas uusi fed-batch kasvatus samaan tyyliin Hiivafermentointi rehuvalmisteessa: Heterologisesti (vierasperäinen) fytaasientsyymin tuotto Bacillus subtilisbakteerilla panossyöttöprosessina. Panosvaihe kestää noin viisi tuntia minkä jälkeen alkaa syöttövaihe (vaiheet eivät erotu kuvassa). Fytaasin tuotto saadaan aikaan indusoimalla ja indusorina toimii fosfaatin loppuminen, mikä käynnistää fytaasientsyymin tuoton. 5

6 Fermentoinnin toteutus 3. Jatkuva fermentointi Fermentori valmistellaan ja siirrostetaan Jatkuva fermentointi aloitetaan panosfermentointina Kun esim. substraattikonsentraatio on laskenut, prosessiin aletaan syöttää ravinneliuosta ja vastaavasti otetaan fermentorista pois valmista kasvuliuosta Prosessia voi jatkaa periaatteessa loputtomasti; käytännössä viikkoja kuukausia vuosia Prosessi pyritään pitämään tasapainotilassa (steady-state) F in F out Tavallisin toteutus: kemostaatti, jossa F in = F out eli V = vakio V 6

7 jatkuva fermentointi sopii prim. metaboliiteille, parhaiten itse solumassan tuotolle ongelma prim. metaboliiteillakin: kun tuotteen muodostus vähentää solumassan saantoa substraatista, jatkuva fermentointi usein johtaa alhaiseen solupitoisuuteen, mikä taas alentaa volumetrista tuottavuutta Esim. biomassan volumetrinen tuottavuus (Q X ) = spesifinen kasvunopeus (r X ) tuotepitoisuus (X) pitkäkestoisena herkkä kontaminaatioille ja kannan muutoksille vähiten luppoaikaa; parantaa volumetristä tuottonopeutta (g L -1 h -1 ) jatkuva fermentointi, jossa on jatkuva ravinteiden syöttö ja samalla tilavuusvirtauksella kasvuliuoksen poisto fermentorista (kemostaatti) laittaa muuttujat steady-state tilaan (muuttujan arvo ei ole ajan funktio) sovelluksia: esim. SCP:n tuotto (SCP: single cell protein), jätevesien puhdistus muita harvemmin käytettyjä: turbidostaatti (sameus vakio), ph-staatti (ph vakio), A-stat (accelerostat) (laimennusnopeutta lisätään vakionopeudella), D-stat (D=vakio, mutta jonkin komponentin pitoisuutta muutetaan vakionopeudella) 7

8 Muita toteutustapoja Jatkuva fermentointi solujen (osittaisella) palautuksella: solujen erotus (=konsentrointi) poistovirrasta esim. kalvo-suodatuksella, laskeuttamalla tai keskipakoerotuksella (cell recycle) [lohkokaaviona kirjassa s. 115] Jatkuva fermentointi, jossa solut pidätetään fermentorissa (cell retention): esim. siivilän avulla (isot partikkelit), solujen flokkuloinnin avulla tai immobilisoimalla solut kiinteän kantajamateriaaliin Useampivaiheinen jatkuva (eri fermentoreissa erilaiset olosuhteet, esim. tilavuudet voivat poiketa toisistaan) Toistettu panos: panoksen loputtua jätetään pieni osa kasvuliuoksesta siirrosteeksi seuraavaan panokseen 8

9 Kasvun ja toteutusten matemaattisia kuvauksia (malleja) Yleisimmin käytetty kasvumalli: Monod n malli perustuen ajatukseen kasvua rajoittavasta substraatista (pitoisuus kasvuliuoksessa = S) Spesifinen kasvunopeus: dx µ = ( ) t 1 X ( t) X, S, P ovat prosessin tilasuureita Monod n yhtälö: µ = µ max S S + K S Panoskasvatus: dx = µ X X: solupitoisuus [esim. g L -1 ] Y XS : solusaanto S:stä [esim. g g -1 ] ds µ X = + m m S : ylläpitokerroin [esim. g g -1 h -1 ] S X YXS Y PX : kasvuun liittyvä tuotesaanto dp µ X m P : tuottoon liittyvä ylläpitokerroin = + mp X Y K S : kyllästysvakio [mg L -1 tai mm] PX 9

10 Matemaattisia malleja Yksinkertaisimmat mallit perustuvat ainetaseisiin (kokonaisainetase, komponentin ainetase, alkuainetase); voidaan käyttää myös energiataseita Solujen kasvuun liittyvä erityismenetelmä on elektronitase eli pelkistystase, jossa tarkastellaan summareaktioita solujen aineenvaihdunnassa. Aineenvaihduntaa voidaan myös mallittaa aineen ja alkuaineiden häviämättömyyden lakiin perustuen (kts. kirja s. 89) (nämäkin siis tasemalleja), kun metaboliareitit tunnetaan, (kts. metaboliareitit esim. ja 10

11 Bioprosessien mallinnus Mekanistiset ja empiiriset mallit Staattiset ja dynaamiset mallit Bioprosessi on monimutkainen kokonaisuus, jota usein yksinkertaistetaan mallinnuksen yhteydessä Yksinkertaistusten määrää voidaan kuvata solupopulaatioiden ja rakenteen huomioimisen kannalta tyypillisellä nelikentällä (kuva) 11

12 Jatkuva fermentointi Kemostaatissa laimennusnopeus (D) määrää spesifisen kasvunopeuden Kemostaatti on hyvä tutkimusmenetelmä, jossa prosessi ja solut ovat tasapainotilassa (S-S) => voidaan tutkia prosessin ja solujen käyttäytymistä eri tasapainotiloissa Miksi panoskasvatus ei ole tasapainotilassa? dv = F 0 + V in dx F out = 0 ; F = F = F (kemostaatti) = F X in out Solumassatase: d( V X ) Fin X in + = Fout X d( V X ) X in = 0; X out = X ; out V µ X = V dx + = F X X dv µ = = V F V = dx D Jokaisen prosessiin tehdyn muutoksen jälkeen on odotettava uuden tasapainotilan syntymistä; yleensä tämä aika = 5 x viipymäaika = 5 x (1/D) µ = dx 1 X S-S: steady-state = tasapainotila: muuttujien arvot f(t) 12

13 Jatkuva fermentointi Tilasuureet X ja S kemostaatissa Monod n yhtälön avulla: Solumassan tuottonopeus (merkitään Q X ) µ m Sout KS D µ = D D = Sout = K + S µ D S out m KS D X = YXS ( Sin Sout ) X = YXS ( Sin ) µ D KS D QX = D X = D YXS ( Sin ) µ D m m Miten on ratkaistu solumassan tuoton kannalta optimaalinen laimennosnopeus D opt kun oikea vastaus on: KS D opt = µ m (1 ) K + S S in 13

14 Jatkuva fermentointi 14

15 Jatkuva fermentointi solujen palautuksella Kemostaatissa D < µ max, muuten solut huuhtoutuvat ulos fermentorista Toimittaessa lähellä D = µ max on systeemi haavoittuva, koska häiriöt voivat johtaa uloshuuhtoutumiseen Tuotteen volumetrista tuottonopeutta voidaan parantaa palauttamalla osa ulosvirtauksen soluista takaisin fermentoriin solujen konsentroinnin jälkeen* Tyypillinen esimerkki: aktiivilieteprosessi jäteveden puhdistuksessa Mitä ongelmia voit kuvitella liittyvän solujen palautukseen? Kahoot!? 15

16 Perfuusioreaktori biomassan ulkoisella palautuksella Figure Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

17 Perfuusioreaktori biomassan sisäisellä palautuksella Figure Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

18 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 18

19 Jatkuva fermentointi solujen palautuksella (1+r)F F, S F Ilmastusallas (1+r)F V x dx/=µxv X, S Selkeytys (1-w)F X E, S E Ainetaseet: X:n suhteen/ilmastusallas: µxv + rfx R = (1+r)FX (1) X:n suhteen/koko prosessi: 0 + µxv = (1-w)FX E + wfx R (2) Oletetaan että ylite on puhdasta vettä eli: X E = 0 (1) : µxv + rfx = ( 1+ r)fx R rf, X R, S R F F X µxv = (1 + r) FX rfx R µ = (1 + r) r V V X F XR XR µ = (1 + r r ) µ = D [1 + (1 ) r] V X X F D = = nimellinen laimennusnopeus V R (2) : wf, X R, S R µxv = 0 + wfx R <=> kaikki muodostunut solumassa poistuu ylijäämälietteenä X R 19

20 Fed-batch Usein syöttö on solujen hiililähdettä (esim. glukoosi) hyvin korkeassa pitoisuudessa ja pyrkimyksenä on pitää ko. komponentin pitoisuus fermentorissa lähellä 0 g/l Kaksi tyypillistä tapausta: 1) syöttönopeus on vakio 2) µ on vakio; Mitä on tällöin puolestaan: 1) µ =? 2) F =? 1) V 0 = alkutilavuus fermentorissa F = syöttönopeus X total = solumassan kokonaismäärä (g); X=biomassan pitoisuus (g/l) fermentorissa 2) dx total dv V ( ) Xtotal ( ) X total dx Vt () = V0 + Ft X= = 2 V V dx dv F d(1 / V ) 1 dv = µ X ja = F ja D= huom! = total total V 2 V dx dx F F = ( µ D) X = 0 µ = D D= = V V + F t µ = D V V 0 dv V = µ F = µ V t 0 F V = µ ln kun V V F = µ V e 0 0 dv = µ t µ t = F dv V = V e 0 = µ V µt 0 t t µt 0 µt e e µt µ 0 0 V = F = µ V e = µ V = V ( e 1) feed kts. sivu 801 µ pienenee kasvatuksen edetessä, sillä tilavuus V kasvaa ja siten suhde F/V pienenee 20

21 Hyvin perinteinen käymisprosessi teekkarikylässä: 21