Solu tuotantolaitoksena Cell factory

Transkriptio

1 Solu tuotantolaitoksena Cell factory Bioteknisiä prosesseja, joissa biokatalyyttinä toimivat solut kutsutaan fermentoinniksi / fermentaatioksi / fermentointiprosesseiksi Tuotteena voi olla solumassa itse ja/tai solujen tuottama yhdiste Toteutuksen/tuotteen mukaan: olutfermentaatio, aseptinen/epäaseptinen fermentaatio, bakteeri/hiiva/home/levä / mammaalisolu/kasvisolufermentaatio, panos/fed-batch/jatkuva fermentointi etanoli/maitohappo fermentointi submerssi/solid-state fermentointi Mitä sana fermentaatio alun perin tarkoittaa? vrt. Pasteur Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 1

2 Solu tuotantolaitoksena Cell factory Historiaa: 1. aikakausi: spontaani hyödyntäminen (olut, viini, leipä, hapatetut tuotteet) 2. teollinen fermentointi; aseptiikka tuntematon käsite (hapot, liuottimet) 3. submerssiteknologia; 1940-luku (antibiootit) 4. geenitekniikan aikakausi; 1980 (solujen muokkaus, terapeuttiset prot.) penisilliinin tuoton kehittyminen Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 2

3 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 3

4 Primaari- vs. sekundaarimetaboliitit Metaboliitti = aineenvaihduntatuote Primaarimetaboliitit muodostuvat solujen kasvuvaiheessa Esimerkkejä: maitohappo (LAB:lla), sitruunahappo, MSG Sekundaarimetaboliittien muodostuminen ei liity solujen kasvuun Vastaavaa muodostumista esiintyy indusoituvilla entsyymeillä Esimerkkejä: antibiootit, useat entsyymit, monet heterologisesti tuotetut proteiinit Glukoosi Fosfaatti Solut α-amylaasi Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena

5 Prim. vs. sek. metaboliitit Insinöörin tapa esittää näiden erot : dp dt 1 X = r P = f ( µ ) P: tuotepitoisuus (g/l, U/L ) t: aika µ: spesifinen kasvunopeus (h -1 ) Tuotteen spesifistä muodostumisnopeutta (r P ) voidaan arvioida prosessin aikana peräkkäisistä pitoisuusmittauksista ja jälkikäteen P(t) ja X(t) käyriltä eri ajankohtina Heterologisessa proteiinituotossa on usein edullista toteuttaa tuotteen muodostuminen kasvusta riippumattomana (ns. indusoitu tuotto vastakohtana konstitutiivinen tuotto) => tuotteen muodostus ei haittaa solujen kasvua eli solumassan tuottovaihetta Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 5

6 Aineenvaihdunta (metabolia): katabolia = energian, pelkistysvoiman ja prekursorien tuotto Proteolytic enzymes C, H, N, O,. Miksi solut tuottavat entsyymejä ulkopuolelleen? Lipolytic enzymes Amylolytic enzymes CH a O b N c Precursors : Transport CO 2 H2 O Yhdisteiden hapettuminen vapauttaa elektroneja (= energiaa); elektronit voidaan siirtää joko hapelle tai metabolian välituotteille Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 6

7 Aineenvaihdunta (metabolia): anabolia = synteesitoiminta Yleisesti näissä reaktioissa tarvitaan: prekursori (välimetaboliitti tai ravinne) pelkistysvoimaa (yleensä NADPH) energiaa (ATP tai yleisemmin NTP) Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 7

8 Hiivat Zymomonas mobilis bakteeri Glykolyysi Entner- Doudoroff Tuotteelle voi olla useampia aineenvaihduntareittejä: Esim. etanolin tuotto Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 8

9 Aineenvaihdunnan eri vaiheille voidaan laskea ja mitata vuoarvoja eri olosuhteissa tai erilaisille mutanteille. Substraattihiilen jakautuminen eri aineenvaihduntatuotteille selviää kun tarkastellaan erilaisten metaboliittien suhteellisia osuuksia 9

10 Saantokertoimet: Y XS : solumassan (teoreettinen) saanto substraatista Y XS : solumassan havaittu saanto substraatista Y PS : tuotteen saanto substraatista Y PX : tuotteen saanto soluista Y XO : solumassan saanto hapesta Y XH : solumassan saanto tuotetusta lämmöstä Tuottonopeudet: Prosessin kvantitointi R i : volumetrinen tuotto/kulutusnopeus; i: X, S, P, O, H perusajatus: kasvuun verrannollinen osa + ylläpito r i : spesifinen tuotto/kulutusnopeus = R i / X k D : kuolemisnopeusvakio [h -1 ] m S : ylläpitoon menevä substraatin kulutus [g g -1 (soluja) h -1 ] X YXS = S dx Y ' XS = ds R = µ X k X X XS XO XH R = OUR; R = HER O H met D µ X RS = + ms X Y µ X RO = + mo X Y µ X RH = + mh X Y Käytännön merkitykset: saantokertoimet => raaka-ainekustannukset (S), hapensiirtokustannukset (O), lämmönsiirtokustannukset (H) volumetriset tuottonopeudet => investointikustannukset, hapensiirtokustannukset(o), lämmönsiirtokustannukset (H) spesifiset tuotto/kulutusnopeudet => prosessin optimointi Panos ja fed-batch fermentoinneissa joko keskimääräiset tai hetkelliset arvot X: solumassa; S: substraatti; O: happi; H: lämpö; OUR: volumetrinen hapenkulutusnopeus; HER: volumetrinen lämmöntuottonopeus 10

11 Kasvun ja tuoton stoikiometria Useat mikrobit pystyvät kasvamaan hyvin yksinkertaisilla ravinteilla tai ainakin kasvua ja tuotteen muodostusta voidaan approksimoida. Esim. solumassan kertoimeksi voidaan merkitä 1 kuten tässä: α CH O + βnh + l m 3 + γo2 CH aob Nc + δch poq Nr + εh 2O κco2 C : α = 1+ δ + κ l α + 3 β = p δ + ε + 2 κ Tästä saadaan alkuainetase Veden muodostumista on lähes aina mahdoton mitata O : m α + 2γ = b + q δ + ε + 2 κ N : β = c + r δ H- ja O-taseet laskennallisia 4 yhtälöä, 6 tuntematonta (kertoimet α,β,γ, ε, δ,κ) tarvitaan mittausdataa, jotta kertoimien arvot selviävät; esim. soluhengityssuhde = RQ = CER/OUR = κ/γ (poistokaasumittauksista) sekä saantokertoimien arvot (kokemus tai mittaus); esim. Y XS =1/α, Y XO =1/γ. Huom! Tuotteen muodostumisen kytkentä kasvuun edellytys, sekundäärimetaboliteille erilliset taseet, kts. oppikirja s.122) Lisäksi kannattaa hyödyntää pelkistystasetta (eli elektronitasetta) H : a + Huom: kirjassa erilaiset merkinnät (s. 116-) Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 11

12 Jokaiselle komponentille ja yhdisteelle voidaan laskea pelkistysaste (degree of reduction, γ): se kertoo kuinka monta elektronia komponentti tai yhdiste voi luovuttaa hapelle palaessaan täydellisesti (esim. C CO 2 ) (usein hiiliyhdisteet esitetään per yksi C-atomi). Alkuaineille: C: +4 per yksi C-atomi H: +1 O: -2 N: -3 [kun NH 3 on N-lähde] +5 [kun NO 3-1 on N-lähde] Pelkistystase Solut: Tuote: Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena γ = 4+ a 2b 3c s b Substraatti: γ p γ = 4+ l 2m α γ 4 γ = γ + δ γ s = 4+ p 2q 3r esim. glukoosi C 6 H 12 O 6 : γ= =24 tai CH 2 O: γ= 24/6=4 (per yksi C-atomi) 3 + γo2 CH aob Nc + δch poq Nr + εh 2O κco2 α CH O + βnh + l m Tyypillinen mikrobisolun pelkistysaste: 4.291±0,172 (usein: CH 1.8 O 0.5 N 0.2 : MW 24.6 ) b p 12

13 Kahoot!-paussi Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 13

14 Pelkistystase:esimerkki Hiiva kasvaa aerobisesti glukoosilla (kasvua rajoittava C-lähde) kemostaatissa ja tuottaa 0,37 g solumassaa per g kulutettua glukoosia. 0,88 g happea kuluu per g muodostunutta solumassaa. Typen lähteenä toimii ammoniakki. Solumassan koostumus on CH 1.79 N 0.17 O Muodostuuko sivutuotteita? Kts. kasvun ja tuoton stokiometria-kalvon yhtälöt läpi. Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 14

15 Pelkistystase:esimerkki jatkuu.. C H O + bnh + ao cch O N + fch O N + dh O + eco p q r 2 2 f = 0? 0,37 g X / MWX 0,37 g / (25,13 g / molx) molx YXS = 0,37 gx / gs = = = 2, 65 = c 1 g / MW 1 g / (180 g / mol ) mol MW = 25,13 g / mol Y = 0,88 g / g = X X X OX O X 0,88 25,13mol 32mol a = 0, 69 2, 65 = 1,83 glyseroli X O = 0,69 mol / mol = a / c S S S S 0,88g MW Pelkistystase: 24 1,83 4 = 2, 65 4,16??? γ = 4,16 O O O MW g 16,68 = 11,02 f 0 Olisiko mahdollisesti glyseroli se tuote? γ = ((3x4) + (8x1) + (3 x( 2)) / 3 = 14 / 3 C-atomia kohti 14 3 f Pelkistystase nyt 24 1,83 4 = 2, 65 4,16 + f = 0, 4 3 X X X X = Glyserolisaanto olisi: 0,4x92 g/180 g = 0,2 g/g. Glyserolia kyllä yleensä muodostuu hiivan kasvaessa, koska sen muodostus tasapainottaa ylimäärin muodostuneen NADH:n. Tämä on kyllä liikaa käytännössä.

16 Pelkistystase:esimerkki jatkuu Olisiko mahdollisesti etanoli se tuote? γ etanoli = ((2x4) + (6x1) + (1x ( 2))/2= 6 C-atomia kohti 12 2 f Pelkistystase nyt 24 1,83 4= 2,65 4,16+ 2 f = 0,47 Etanolisaanto olisi: 0,47x46 g/180 g = 0,12 g/g. Etanolia muodostuu myös hiivan kasvaessa, varsinkin korkeassa glukoosikonsentraatiossa. Lisäksi muodostuu asetaattia ja kaikki kuluvat lopulta pois, joten lopetusajankohta ratkaisee myös mitä eri tuotekonsentraatiot ovat. Biotechnology and Bioprocess Engineering 16: (2011)

17 Ravinteiden tarve Tyypilllinen mikrobisolujen koostumus: CH 1,8 O 0,5 N 0,2 Kaikki solujen alkuaineet ovat peräisin ravinteista; eri lajien vaatimukset ravinteiden kemiallisesta laadusta vaihtelevat suuresti Teollinen rikas kasvualusta Melassi 198 kg Ammoniakki 10,5 kg Kaliumdivetyfosfaatti 8,75 kg Magnesiumsulfaatti 0,75 kg Biotiini 50 mg Kalsiumpantotenaatti 10 mg Inositoli 10 g Synteettinen alusta yhteensä noin 20 eri yhdistettä esim: Glukoosi Ammoniumsulfaatti 12 eri hivenainetta 6 vitamiinia Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 17

18 Ravinteiden tarve <= solujen alkuainekoostumus esim. tyypillinen mikrobisolu: Alkuaine % k.a. Hiili 50 Happi 20 Typpi 14 Vety 8 Kalium 1 Fosfori 3 Magnesium 0.5 Kalsium 0.5 Rikki 1 Muuta 2 Hivenaineita: Zn, Fe, Cu, Na, Mn, Mo Esim. usein maaperän C:N-suhde on noin 10: 1 C:N-suhde pyrkii vähenemään ajan myötä, kun orgaaninen aine hajoaa. Tämä johtuu hiilidioksidin häviämisestä päästöinä ja siten typen osuuden noususta Maaperän C:N-suhde heijastaa useimpien maaperän mikrobien tasapainoarvoa (bakteerit 3:1-10:1, sienet 10: 1 ). Sienissä keskimäärin vähemmän typpeä kuin bakteereissa Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 18

19 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 19

20 Biomassan maksimisaanto kun kaikki elektronit siirtyvät substraatista biomassaan (biomassan pelkistysluku tässä 4,19) (w = hiilimoolien lukumäärä substraatissa) Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 20

21 Ravinnekomponentteja Hiilen/energian lähteitä Melassi Mallasuute Tärkkelys Sulfiittijäteliemi Lignoselluloosa Hera Metanoli, etanoli Biomassa Typen/vitamiinien, hivenaineiden lähteitä Ammoniumsuolat, ammoniakki Urea Hiivauute Autolyysi, o C Plasmolyysi, NaCl Peptonit (proteiinihydrolysaatit) Liha-, kaseiini- Soijajauho 50% proteiinia, 30% hiilihydraattia Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 21