Fermentoinnin toteutustavat Panosfermentointi

Transkriptio

1 Fermentoinnin toteutustavat Panosfermentointi jokaista panosta varten tuotetaan oma siirroste (engl. inoculum; monikko inocula) siirrostelinjassa (inoculum train) varsinainen tuotantoreaktori (fermentori) valmistellaan panosta varten, siirrostetaan, solut kasvavat ja tuottavat tuotteen, fermentointi lopetetaan, tuote otetaan talteen (talteenottoprosessi eli jälkikäsittelyprosessi; P: downstream processing) fermentointipanoksen aikana fermentoriin ei lisätä (merkittäviä määriä) ravinteita eikä fermentorista oteta pois prosessilientä ( kasvuliuosta fermentation broth) tuotettua solumassaa hyödynnetään vain kussakin panoksessa Missä kasvuvaiheessa kannattaa siirrostaa pienemmästä isompaan fermentoriin? 1

2 Toteutustavat - sovelluksia Panosfermentointi yksinkertainen toteutus; sopii sekä prim. että sek. metaboliiteille pienin riski kontaminaatioille ja tuotantokannan muutoksille (esim. muutokset geenitasolla eli kannan degeneraatio, palautuminen tai plasmidilukumäärän pieneneminen vähäisiä) tuotettua solumassaa hyödynnetään huonosti tuotantoon liittyy paljon luppoaikaa (downtime): panoksen valmistelu, sterilointi, lag-vaihe, fermentorin tyhjennys panoksen jälkeen ja pesu panosfermentoinnissa ei solut tai prosessi ehdi olla steady-state tilassa juuri lainkaan useat panosprosessit on muutettu fed-batch toteutukseen Kaasujen syöttö ja poisto (aerobiset kasvatukset) ei muuta batch-luokitusta panosfermentointi sopii edelleen hyvin, kun prosessi sietää huonosti fedbatchissä syötettävien komponenttien paikallisia pitoisuuseroja (epähomogeenisuus) Miksi tämä korostuu fed-batchissä? 2

3 Toteutustavat Fed-batch -fermentointi puolipanoskasvatus sopii kaikentyyppisille tuotteille, erityisesti sek. metaboliiteille hyödyntää solumassaa hieman paremmin kuin panosfermentointi syötön avulla voidaan järjestää joidenkin muuttujien suhteen steady-state ( quasi-steady-state); usein tavoitteena välttää ns. overflow-metabolia tai solujen helposti käyttämän hiililähteen (carbon- eli C-source) aiheuttama kataboliittirepressio (ccr: carbon catabolite repression) sovelluksia runsaasti: entsyymien tuotto, antibioottien tuotto, indusoitu proteiinien heterologinen tuotto, aminohappojen tuotto, leivinhiivan tuotto 3

4 4

5 Fed-batch -fermentointi aloitetaan panoksena kun kasvu muuttaa olosuhteet halutuiksi, aloitetaan jonkin komponentin syöttö korkeassa pitoisuudessa fermentoriin yleensä syöttö lopetetaan vasta fermentorin täytyttyä ja fermentointi lopetetaan ja aloitetaan jälkikäsittelyprosessi ja sitten taas uusi fed-batch kasvatus samaan tyyliin Kuvassa 5

6 Fermentoinnin toteutus Jatkuva kasvatus fermentori valmistellaan ja siirrostetaan prosessi ajetaan ylös panosfermentointina tämän jälkeen prosessiin aletaan syöttää ravinneliuosta ja vastaavasti otetaan fermentorista pois valmista kasvuliuosta prosessia jatketaan periaatteessa loputtomasti; käytännössä viikkoja kuukausia vuosia prosessi pyritään pitämään tasapainotilassa (steady-state) tavallisin toteutus: kemostaatti, jossa F in F out eli vakiojatkuva fermentointi: F in F out 6

7 Jatkuva fermentointi sopii prim. metaboliiteille, parhaiten itse solumassan tuotolle ongelma prim. metaboliiteillakin: kun tuotteen muodostus vähentää solumassan saantoa substraatista, jatkuva fermentointi usein johtaa alhaiseen solupitoisuuteen, mikä taas alentaa volumetrista tuottavuutta volumetrinen tuottavuus (R) spesifinen tuottonopeus (r) x solupitoisuus () pitkäkestoisena herkkä kontaminaatioille ja kannan muutoksille vähiten luppoaikaa; mahdollistaa suurimman volumetrisen tuottonopeuden (g L -1 h -1 ) jatkuva fermentointi, jossa on jatkuva ravinteiden syöttö ja samalla tilavuusvirtauksella kasvuliuoksen poisto fermentorista (kemostaatti) johtaa muuttujien steady-state tilaan (muuttujan arvo ei ole ajan funktio) sovelluksia: esim. CP:n tuotto (CP: single cell protein), jätevesien puhdistus muita harvemmin käytettyjä: turbidostaatti (sameus vakio), ph-staatti (ph vakio), A-stat (accelerostat) (laimennusnopeutta lisätään vakionopeudella), -stat (vakio, mutta jonkin komponentin pitoisuutta muutetaan vakionopeudella) 7

8 Muita toteutustapoja Jatkuva fermentointi solujen (osittaisella) palautuksella: solujen erotus (konsentrointi) poistovirrasta esim. kalvo-suodatuksella tai keskipakoerotuksella (cell recycle) [lohkokaaviona kirjassa s. 115] Jatkuva fermentointi, jossa solut pidätetään fermentorissa (cell retention): esim. siivilän avulla (isot partikkelit), solujen flokkuloinnin avulla tai immobilisoimalla solut kiinteän kantajamateriaaliin Useampivaiheinen jatkuva (eri fermentoreissa erilaiset olosuhteet, esim. tilavuudet voivat poiketa toisistaan) Toistettu panos: panoksen loputtua jätetään pieni osa kasvuliuoksesta siirrosteeksi seuraavaan panokseen 8

9 Kasvun ja toteutusten matemaattisia kuvauksia (malleja) Yleisimmin käytetty kasvumalli: Monod n malli perustuen ajatukseen kasvua rajoittavasta substraatista (pitoisuus kasvuliuoksessa ) pesifinen kasvunopeus: d µ ( ) t 1 ( t),, P ovat prosessin tilasuureita Monod n yhtälö: µ µ max + K Panoskasvatus: d µ : solupitoisuus [esim. g L -1 ] Y : solusaanto :stä [esim. g g -1 ] d µ + m m : ylläpitokerroin [esim. g g -1 h -1 ] Y Y P : kasvuun liittyvä tuotesaanto dp µ m P : tuottoon liittyvä ylläpitokerroin + mp Y K : kyllästysvakio [mg L -1 tai mm] P 9

10 Matemaattisia malleja Yksinkertaisimmat mallit perustuvat ainetaseisiin (kokonaisainetase, komponentin ainetase, alkuainetase); voidaan käyttää myös energiataseita olujen kasvuun liittyvä erityismenetelmä on elektronitase eli pelkistystase, jossa tarkastellaan summareaktioita solujen sisällä ( aineenvaihdunnassa) Aineenvaihduntaa voidaan myös mallittaa aineen ja alkuaineiden häviämättömyyden lakiin perustuen (kts. kirja s. 89) (nämäkin siis tasemalleja), kun metaboliareitit tunnetaan, (kts. metaboliareitit esim. ja 10

11 Bioprosessien mallinnus Mekanistiset ja empiiriset mallit taattiset ja dynaamiset mallit Bioprosessi on monimutkainen kokonaisuus. Yksinkertaistusten määrää voidaan kuvata solupopulaatioiden ja rakenteen huomioimisen kannalta tyypillisellä nelikentällä (kuva) 11

12 Jatkuva fermentointi Kemostaatissa laimennusnopeus () määrää spesifisen kasvunopeuden Kemostaatti on hyvä tutkimusmenetelmä, jossa prosessi ja solut ovat tasapainotilassa (-) > voidaan tutkia prosessin ja solujen käyttäytymistä eri tasapainotiloissa Miksi panoskasvatus ei ole tasapainotilassa? d F 0 + in d F out 0 ; F F F (kemostaatti) F in out olumassatase: d( ) Fin in + Fout d( ) in 0; out ; out µ d + F d µ F d Jokaisen prosessiin tehdyn muutoksen jälkeen on odotettava uuden tasapainotilan syntymistä; yleensä tämä aika 5 x viipymäaika 5 x (1/) µ d 1 -: steady-state tasapainotila: muuttujien arvot f(t) 12

13 Tilasuureet ja kemostaatissa Monod n yhtälön avulla: olumassan tuottonopeus (merkitään Q tai R ) Miten ratkaistaan solumassan tuoton kannalta optimaalinen? Ratkaise. Oikea vastaus on: 13 ) ( µ m µ K Y µ K K µ m in m out out out + Jatkuva fermentointi ) ( R µ K Y m in ) (1 0 K K µ m opt +

14 Jatkuva fermentointi 14

15 Jatkuva fermentointi solujen palautuksella Kemostaatissa < µ max, muuten solut huuhtoutuvat ulos fermentorista Toimittaessa lähellä µ max on systeemi haavoittuva, koska häiriöt voivat johtaa uloshuuhtoutumiseen Tuotteen volumetrista tuottonopeutta voidaan parantaa palauttamalla osa ulosvirtauksen soluista takaisin fermentoriin solujen konsentroinnin jälkeen* Tyypillinen esimerkki: aktiivilieteprosessi jäteveden puhdistuksessa Mitä ongelmia voit kuvitella liittyvän solujen palautukseen? Kahoot!? 15

16 Figure Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

17 Figure Copyright 2012, Elsevier Inc. All rights Reserved.

18 Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 18

19 Jatkuva fermentointi solujen palautuksella F, F (1+r)F (1+r)F (1-w)F E, E x d/µ, µ Ainetaseet: :n suhteen/ilmastusallas: µ + rf R (1+r)F (1) :n suhteen/koko prosessi: 0 + µ (1-w)F E + wf R (2) Oletetaan että ylite on puhdasta vettä eli: E 0 (1) : µ + rf F F (1 + r r ( 1+ r)f µ (1 + r) F rf R R rf, R, R ) nimellinen laimennusnopeus R F F µ (1 + r) r R µ [1 ( 1) r] R (2) : wf, R, R µ 0 + wf R <> kaikki muodostunut solumassa poistuu ylijäämälietteenä R 19

20 Fed-batch Usein syöttö on solujen hiililähdettä (esim. glukoosi) hyvin korkeassa pitoisuudessa ja pyrkimyksenä on pitää ko. komponentin pitoisuus fermentorissa lähellä 0 g/l Kaksi tyypillistä tapausta: 1) syöttönopeus on vakio 2) µ on vakio; Mitä on tällöin puolestaan: 1) µ? 2) F? 1) 0 alkutilavuus fermentorissa F syöttönopeus total solumassan kokonaismäärä (g); biomassan pitoisuus (g/l) fermentorissa d total d ( ) d total ( ) total ( t) 0 + F t 2 d total d F µ total ja F ja d d F F ( µ ) 0 µ + F t 0 µ pienenee kasvatuksen edetessä, sillä tilavuus kasvaa ja siten suhde F/ pienenee 2) µ 0 d µ F µ t 0 F µ ln kun F µ e 0 0 d µ t µ t F d e 0 µ µt feed t 0 µ t 0 µt e e µt µ 0 e µ 0 0 ( e 1) µ 20

21 ideoita aiheeseen liittyen Hyvin perinteinen käymisprosessi Amerikkalainen rehun valmistaja Bioprosessitekniikka - olu tuotantolaitoksena 21