Solu tuotantolaitoksena Cell factory

Transkriptio

1 Solu tuotantolaitoksena Cell factory Bioteknisiä prosesseja, joissa biokatalyyttinä toimivat solut kutsutaan fermentoinniksi / fermentaatioksi / fermentointiprosesseiksi Tuotteena voi olla solumassa itse ja/tai solujen tuottama yhdiste Toteutuksen/tuotteen mukaan: olutfermentaatio, aseptinen/epäaseptinen fermentaatio, bakteeri/hiiva/home/levä / mammaalisolu/kasvisolufermentaatio, panos/fed-batch/jatkuva fermentointi etanoli/maitohappo fermentointi submerssi/solid-state fermentointi Mitä sana fermentaatio alun perin tarkoittaa? vrt. Pasteur 1

2 Solu tuotantolaitoksena Cell factory Historia: 1. aikakausi: spontaani hyödyntäminen (olut, viini, leipä, hapatetut tuotteet) 2. teollinen fermentointi; aseptiikka tuntematon käsite (hapot, liuottimet) 3. submerssiteknologia; 1940-luku (antibiootit) 4. geenitekniikan aikakausi; 1980 (solujen muokkaus, terapeuttiset prot.) penisilliinin tuoton kehittyminen 2

3 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 3

4 Primaari- vs. sekundaarimetaboliitit Metaboliitti = aineenvaihduntatuote Primaarimetaboliitit muodostuvat solujen kasvuvaiheessa Esimerkkejä: maitohappo (LAB:lla), sitruunahappo, MSG Sekundaarimetaboliittien muodostuminen ei liity solujen kasvuun Vastaavaa muodostumista esiintyy indusoituvilla entsyymeillä Esimerkkejä: antibiootit, useat entsyymit, monet heterologisesti tuotetut proteiinit Glukoosi Fosfaatti Solut α-amylaasi

5 Prim. vs. sek. metaboliitit Insinöörin tapa esittää näiden erot : dp dt 1 = r P = f ( µ ) P: tuotepitoisuus (g/l, U/L ) t: aika µ: spesifinen kasvunopeus (h -1 ) Tuotteen spesifistä muodostumisnopeutta (r P ) voidaan arvioida prosessin aikana peräkkäisistä pitoisuusmittauksista ja jälkikäteen P(t) ja (t) käyriltä eri ajankohtina Heterologisessa proteiinituotossa on usein edullista toteuttaa tuotteen muodostuminen kasvusta riippumattomana (ns. indusoitu tuotto vastakohtana konstitutiivinen tuotto) => tuotteen muodostus ei haittaa solujen kasvua eli solumassan tuottovaihetta 5

6 Fermentoinnin toteutus (mode of fermentation) Panosfermentointi: jokaista panosta varten tuotetaan oma siirroste (engl. inoculum; monikko inocula) siirrostelinjassa (inoculum train) varsinainen tuotantoreaktori (fermentori) valmistellaan panosta varten, siirrostetaan, solut kasvavat ja tuottavat tuotteen, fermentointi lopetetaan, tuote otetaan talteen (talteenottoprosessi eli jälkikäsittelyprosessi; DSP: downstream processing) fermentointipanoksen aikana fermentoriin ei lisätä (merkittäviä määriä) ravinteita eikä fermentorista oteta pois prosessilientä (= kasvuliuosta = fermentation broth) tuotettua solumassaa hyödynnetään vain kussakin panoksessa Missä kasvuvaiheessa kannattaa siirrostaa pienemmästä isompaan fermentoriin? 6

7 Aineenvaihdunta (metabolia): katabolia = energian, pelkistysvoiman ja prekursorien tuotto Proteolytic enzymes C, H, N, O,. Miksi solut tuottavat entsyymejä ulkopuolelleen? Lipolytic enzymes Amylolytic enzymes CH a O b N c Precursors : Transport CO 2 H2 O Yhdisteiden hapettuminen vapauttaa elektroneja (= energiaa); elektronit voidaan siirtää joko hapelle tai metabolian välituotteille 7

8 Aineenvaihdunta (metabolia): anabolia = synteesitoiminta Yleisesti näissä reaktioissa tarvitaan: prekursori (välimetaboliitti tai ravinne) pelkistysvoimaa (yleensä NADPH) energiaa (ATP tai yleisemmin NTP) 8

9 Hiivat Zymomonas mobilis bakteeri Glykolyysi Entner- Doudoroff Tuotteelle voi olla useampia aineenvaihduntareittejä: Esim. etanolin tuotto 9

10 Aineenvaihdunnan eri vaiheille voidaan laskea ja mitata vuoarvoja eri olosuhteissa tai erilaisille mutanteille. Substraattihiilen jakautuminen eri aineenvaihduntatuotteille selviää kun tarkastellaan erilaisten metaboliittien suhteellisia osuuksia 10

11 Prosessin kvantitointi Saantokertoimet: Y S : solumassan saanto substraatista Y PS : tuotteen saanto substraatista Y P : tuotteen saanto soluista Y O : solumassan saanto hapesta Y H : solumassan saanto tuotetusta lämmöstä Tuottonopeudet: RO = + mo YO R i : volumetrinen tuotto/kulutusnopeus; i:, S, P, O, H perusajatus: kasvuun verrannollinen osa + ylläpito µ R r i : spesifinen tuotto/kulutusnopeus = R i / H = + mh Y k D : kuolemisnopeusvakio [h -1 H ] RO = OUR; RH = HER Käytännön merkitykset: saantokertoimet => raaka-ainekustannukset (S), hapensiirtokustannukset(o), lämmönsiirtokustannukset (H) volumetriset tuottonopeudet => investointikustannukset, hapensiirtokustannukset(o), lämmönsiirtokustannukset (H) spesifiset tuotto/kulutusnopeudet => prosessin optimointi Panos ja fed-batch fermentoinneissa joko keskimääräiset tai hetkelliset arvot : solumassa; S: substraatti; O: happi; H: lämpö; OUR: volumetrinen hapenkulutusnopeus; HER: volumetrinen lämmöntuottonopeus 11 R R S = µ k µ = Y S µ D + m S met

12 Kasvun ja tuoton stoikiometria Useat mikrobit pystyvät kasvamaan hyvin yksinkertaisilla ravinteilla tai ainakin kasvua ja tuotteen muodostusta voidaan approksimoida (esim. solumassan kertoimeksi voidaan merkitä 1): α CH O + βnh + l m Tästä saadaan alkuainetase Veden muodostumista on lähes aina mahdoton mitata H- ja O-tase hyödyttömiä 3 + γo2 CH aob Nc + δch poq Nr + εh 2O κco2 α = 1+ δ + κ l α + 3 β = β = c + r δ 2 yhtälöä, 5 tuntematonta (kertoimet α,β,γ,δ,κ) p δ + ε + 2 κ m α + 2γ = b + q δ + ε + 2 κ tarvitaan mittausdataa, jotta kertoimien arvot selviävät; esim. soluhengityssuhde = RQ = CER/OUR = κ/γ (poistokaasumittauksista) sekä saantokertoimien arvot (kokemus tai mittaus); esim. Y S =1/α, Y O =1/γ Lisäksi voidaan hyödyntää pelkistystasetta eli elektronitasetta C : H O : N : : a + Huom: kirjassa erilaiset merkinnät (s. 116) 12

13 Jokaiselle komponentille ja yhdisteelle voidaan laskea pelkistysaste (degree of reduction, γ): kertoo kuinka monta elektronia komponentti tai yhdiste voi luovuttaa hapelle palaessaan täydellisesti (esim. C CO 2 ) (hiiliyhdisteet esitetään per C-atomi) alkuaineille: C: +4 per yksi C-atomi H: +1 O: -2 N: -3 [kun NH 3 on N-lähde] +5 [kun NO 3-1 on N-lähde] Pelkistystase Solut: Tuote: γ = 4+ a 2b 3c s b Substraatti: esim. glukoosi C 6 H 12 O 6 : γ= ( )/6=4 per yksi C-atomi γ p γ = 4+ l 2m α γ 4 γ = γ + δ γ s = 4+ p 2q 3r 3 + γo2 CH aob Nc + δch poq Nr + εh 2O κco2 α CH O + βnh + l m Tyypillinen mikrobisolun pelkistysaste: 4.291±0,172 (usein: CH 1.8 O 0.5 N 0.2 : MW 24.6 ) b p 13

14 Kahoot!-paussi Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 14

15 Pelkistystase:esimerkki Hiiva kasvaa aerobisesti glukoosilla (kasvua rajoittava C-lähde) kemostaatissa ja tuottaa 0,37 g solumassaa per g kulutettua glukoosia. 0,88 g happea kuluu per g muodostunutta solumassaa. Typen lähteenä toimii ammoniakki. Solumassan koostumus on CH 1.79 N 0.17 O Muodostuuko sivutuotteita? Kts. kasvun ja tuoton stokiometria-kalvon yhtälöt läpi. 15

16 C f 6 12 = 0? MW 0,88 25,13mol 32mol Pelkistystase : 24 1,83 4 = 16,68 = 11,02 glyseroli 6 + bnh = 25,13g Pelkistystase nyt 24 1,83 4 = 3 Pelkistystase:esimerkki jatkuu.. = 0,37g + ao / mol a = 0,69 2,65 = 1,83 γ H O Y S O 2 / g = 0,69mol f 0 cch ,37g = MW = 0,88g / mol MW 1g / g = a / c 2,65 4,16??? = ((3x4) + (8x1) + (3x( 2)) / 3 = 14 / 3 S Y O O O O N S + fch 0,37 180mol = 25,13mol 0,88gO = MW 4,16 Olisiko mahdollisesti glyseroli se tuote? = O 14 3 f 2,65 4, S γ p O q N MW g C - atomia kohti r + dh S f x = 2 O + eco = 0,4 2 = 2,65 = c Glyserolisaanto olisi: 0,4x92 g/180 g = 0,2 g/g. Glyserolia kyllä yleensä muodostuu hiivan kasvaessa, koska sen muodostus tasapainottaa ylimäärin muodostuneen NADH:n. Tämä on kyllä liikaa käytännössä.

17 Pelkistystase:esimerkki jatkuu Olisiko mahdollisesti etanoli se tuote? γ etanoli = ((2x4) + (6x1) + (1x ( 2))/2= 6 C-atomia kohti 12 2 f Pelkistystase nyt 24 1,83 4= 2,65 4,16+ 2 f = 0,47 Etanolisaanto olisi: 0,47x46 g/180 g = 0,12 g/g. Etanolia muodostuu myös hiivan kasvaessa, varsinkin korkeassa glukoosikonsentraatiossa. Lisäksi muodostuu asetaattia ja kaikki kuluvat lopulta pois, joten lopetusajankohta ratkaisee myös mitä eri tuotekonsentraatiot ovat. Biotechnology and Bioprocess Engineering 16: (2011)

18 Ravinteiden tarve Tyypilllinen mikrobisolujen koostumus: CH 1,8 O 0,5 N 0,2 Kaikki solujen alkuaineet ovat peräisin ravinteista; eri lajien vaatimukset ravinteiden kemiallisesta laadusta vaihtelevat suuresti Teollinen rikas kasvualusta Melassi 198 kg Ammoniakki 10,5 kg Kaliumdivetyfosfaatti 8,75 kg Magnesiumsulfaatti 0,75 kg Biotiini 50 mg Kalsiumpantotenaatti 10 mg Inositoli 10 g Synteettinen alusta yhteensä noin 20 eri yhdistettä esim: Glukoosi Ammoniumsulfaatti 12 eri hivenainetta 6 vitamiinia 18

19 Ravinteiden tarve <= solujen alkuainekoostumus Hiili 50 % dw Happi 20 Typpi 14 Vety 8 Kalium 1 Fosfori 3 Magnesium 0.5 Kalsium 0.5 Rikki 1 Muuta 2 Hivenaineita: Zn, Fe, Cu, Na, Mn, Mo Sienissä keskimäärin vähemmän typpeä kuin bakteereissa 19

20 Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 20

21 Biomassan maksimisaanto kun kaikki elektronit siirtyvät substraatista biomassaan Bioprosessitekniikka - Solu tuotantolaitoksena 21

22 Ravinnekomponentteja Hiilen/energian lähteitä Melassi Mallasuute Tärkkelys Sulfiittijäteliemi Lignoselluloosa Hera Metanoli, etanoli Biomassa Typen/vitamiinien, hivenaineiden lähteitä Ammoniumsuolat, ammoniakki Urea Hiivauute Autolyysi, o C Plasmolyysi, NaCl Peptonit (proteiinihydrolysaatit) Liha-, kaseiini- Soijajauho 50% proteiinia, 30% hiilihydraattia 22