Molekyylikaryotyypitys kehitysvammaisuuden

Alkuperäistutkimus Sakari Knuutila, Linda Siggberg, Sirpa Ala-Mello, Carina Wallgren- Pettersson, Aki Mustonen, Maila Penttinen ja Jaakko Ignatius Molekyylikaryotyypitys kehitysvammaisuuden diagnostiikassa TAUSTA: Molekyylikaryotyypitys mahdollistaa kromosomipoikkeavuuksien toteamisen jopa geenien eksonitasolla. POTILAAT JA MENETELMÄT: Molekyylikaryotyypitys suoritettiin oligonukleotidipohjaisella 244 000 koettimen mikrosirulla 114 kehitysvammaiselle potilaalle. TULOKSET: 104:llä oli normaali peruskaryotyyppi ja kymmenellä tarkemmin määrittämätön kromosomipoikkeavuus. Valtaosalla esiintyi henkisen kehityshäiriön lisäksi rakennepoikkeavuuksia. Lähes 20 %:lla normaalin karyotyypin omaavista potilaista löydettiin taudin selittävä mikrotason kromosomimuutos. Molekyylikaryotyypitys täsmensi löydöksen kaikille niille kymmenelle potilaalle, joilla oli tarkemmin määrittämätön merkkikromosomi, kääntymä tai komplisoitunut poikkeavuus. PÄÄTELMÄT: Suosittelemme molekyylikaryotyypitystä kaikille niille kehitysvammaisille, joiden tavanomaisen kromosomitutkimuksen tulos on normaali. Tutkimus korvaa FISHja prometafaasitutkimukset, ja lähitulevaisuudessa siitä tulee ensisijainen sytogenetiikan menetelmä kehityshäiriöiden diagnostiikassa. N oin 1 %:lla väestöstä on älyllisenä kehitysvammana ilmenevä kehityksen viivästymä. Suunnilleen 10 %:lla sen syynä on kromosomipoikkeavuus, joka tulee esiin tavanomaisessa kromosomitutkimuksessa. Yli puolella etiologia on avoin. Tavanomainen kromosomitutkimus on varsin karkea geneettisten muutosten osoittamismenetelmä. Jotta kromosomistossa eli karyotyypissä nähdään muutos, tulee poikkeavuuden olla ainakin kymmenen miljoonan emäsparin suuruinen, siis satoja geenejä sisältävä. Menetelmän karkeuden vuoksi osa kromosomitason muutoksista jää toteamatta. Viime vuosien aikana on bioinformatiikan menetelmien ja ennen muuta DNA-sirutekniikan Duodecim 2008;124:1029 39 nopean kehityksen myötä toteutunut geneetikkojen mielissä vuosikymmeniä elänyt toive molekyylitason kromosomitutkimuksista. DNA-sirututkimukseen perustuva molekyylikaryotyypitys on aloittanut uuden aikakauden kehitysvammaisuuden ja syöpien geneettisessä tutkimuksessa ja diagnostiikassa. Menetelmän periaatetta, mahdollisuuksia ja rajoituksia on hiljan kuvattu tässä lehdessä (Tyybäkinoja ja Knuutila 2006). Lyhyesti: koko perimän kattavien DNA-koettimien avulla saadaan tieto jokaisen geenin kopiomäärästä yhdellä ainoalla analyysillä. Kehityshäiriöpotilaiden molekyylikaryotyypityksistä on julkaistu kahden viime vuoden aikana kymmenittäin raportteja ja tutkittujen potilaiden määrä ylittää 10 000. Menetelmäl 1029

lä on kuvattu monia uusia mikrohäviämiä ja kahdentumia (www.cangem.org). Suurimmissa aineistoissa on ollut yli 8 000 potilasta (Shaffer ym. 2007), ja useita noin 100 potilaan aineistoja on julkaistu (Shaw-Smith ym. 2004, Schoumans ym. 2005, Friedman ym. 2006, Rosenberg ym. 2006). Kehityshäiriön selittäviä kromosomien mikrohäviämiä ja kahdentumia omaavien karyotyypiltään normaalien kehityshäiriöpotilaiden osuus on vaihdellut näissä aineistoissa potilaiden valintaperusteiden mukaan välillä 7 24 % (Shaw-Smith ym. 2004, Schoumans ym. 2005, Friedman ym. 2006, Rosenberg ym. 2006). Muutamalta prosentilta potilaista on löydetty jopa miljoonan emäsparin suuruisia geenien kopiomäärämuutosalueita, jotka on peritty terveenä pidettävältä vanhemmalta (Shaffer ym. 2007). Näiden muutosten kliininen merkitys on jäänyt avoimeksi. Suomalaisista kehityshäiriöpotilaista ei ole tähän mennessä esitetty tutkimustuloksia. Suoritimme tässä tutkimuksessa molekyylikaryotyypityksen 114 suomalaiselle kehityshäiriöpotilaalle. Aineisto ja menetelmät Tutkimukseen valittiin ensimmäiset 114 kehityshäiriöpotilasta, joiden diagnostisena tutkimuksena oli välillä 1.9.2005 1.9.2007 molekyylikaryotyypitys. Peruskaryotyyppitutkimuksen tulos oli 104 potilaalla normaali ja kymmenellä potilaalla tulkinnaltaan epäselväksi jäänyt kromosomipoikkeavuus. Valtaosalla karyotyypiltään normaaleista potilaista oli sekä kehitysviive että rakennepoikkeavuus tai poikkeavat kasvonpiirteet tai molemmat. Internet-oheisaineiston taulukossa 1 on esitetty poikkeavan tuloksen saaneista potilaista lähinnä lähetetietoihin perustuva kliininen kuvaus. Joidenkin potilaiden kliinisiä tietoja on tarkennettu jälkikäteen. Yhdellä potilaalla (potilas 12) oli epätyypillinen Cowdenin tauti ja yhdellä potilaalla (7) epätyypillinen Sotosin oireyhtymä. Neljällä karyotyypiltään poikkeavista potilaista oli tuntematonta alkuperää oleva merkkikromosomi, kahdella epäiltiin kääntymää ja kahdentumaa ja neljällä oli komplisoitunut kromosomimuutos. Kolmea potilasta (potilaat 30, 36 ja 38) lukuun ottamatta käytettiin molekyylikaryotyypitykseen DNA:ta, joka oli eristetty tavanomaiseen tapaan postitse tai muuten toimitetusta (1 2 vrk) EDTA-verinäytteestä (8 ml). Analyysi tehtiin oligonukleotidipohjaisella mikrosirulla (Agilent 244K), joka sisälsi 244 000 koetinta. Menetelmä ja sen rajoitukset on hiljan kuvattu (Tyybäkinoja ja Knuutila 2006). Tulokset Normaalin karyotyypin omaavista 104 potilaasta 29:ltä (27 %) löytyi poikkeavuus (taulukko, kuva 1). Poikkeavuutta pidettiin 18 potilaalla (17 %) kehitysviiveen syynä (Internet-oheisaineiston taulukko 1). Häviämä eli deleetio (del) oli 12 potilaalla ja kahdentuma eli duplikaatio (dup) kuudella. Häviämien koot vaihtelivat 0,4 Mb:n ja 17,7 Mb:n välillä ja kahdentumien 0,8 Mb:n ja 9 Mb:n välillä. Kuvaan 1 on koottu poikkeavuuksien paikat kromosomissa. Kuvissa 2 4 näkyy tyypillisiä poikkeavuuksia. Häviämäpotilaista neljällä oli tunnettuun oireyhtymään liittyvä muutos. Potilaalla 16 todettiin del17q-mapt-oireyhtymään viittaava poikkeavuus del17q21.31. Kahdentumapotilaista yhden (potilas 14) löydös viittasi dup16p13.2p13.3-kahdentumaan. Epätyypillistä Cowdenin tautia sairastavalla (12) oli del10q23.31 PTEN-geenialueella ja poikkeuksellisen vaikeaa Sotosin oireyhtymää sairastavalla (7) del5q35.2-poikkeavuus NSD1-geenialueella (kuva 2). Lievästi kehitysvammaisella pojalla (8), hänen kehityshäiriöisellä äidillään ja siskollaan todettiin periytyvä dup6p22.3 geenilokuksissa DCDC2-, KIAA0319- ja ALDH5A1. Kehitysvammaisella pojalla (17) ja hänen kehitysvammaisella sisarellaan todettiin periytyvä geenien kopiomäärämuutosalue dup22q13.1q13.2. Lievästi kehitysvammaisella pojalla (18) oli kantajaäidiltä peritty dupxq11.q13.1 (kuva 3). Uusia tähän asti toistumattomiksi kuvattuja muutoksia olivat del2q31.1.q32.1, del3q24q25.32, del4p15.2pter, del4q31.1q34.1, del5p14.1p14.3, del5q11.1q12.3, del6q26qter, Taulukko. Karyotyyppilöydösten jakauma aineistossamme. Tutkittuja potilaita 114 Normaali peruskaryotyyppi 104 normaali molekyylikaryotyyppi 75 poikkeava molekyylikaryotyyppi 29 taudin syynä 18 syy-yhteyttä selvitetään 11 Poikkeava peruskaryotyyppi 10 1030 S. Knuutila ym.

Kuva 1. Molekyylikaryotyypityksellä kuvattujen poikkeavuuksien sijainti kromosomissa. Häviämäalueet on merkitty punaisella kromosomin vasemmalle puolelle ja kahdentuma-alueet vihreällä oikealle. del10q11.22q11.23, dup10q22.3q23.2, del12q24.31 ja dup17p13.1p13.3. Poikkeavan peruskaryotyypin ryhmässä kaikilla todettiin kopiomäärämuutoksia (taulukko 3). Löydökset eivät yhdessäkään tapauksessa olleet ristiriidassa peruskaryotyypityksen tulosten kanssa. Jokaisen tapauksen alkuperäinen löydös tarkentui merkittävästi molekyylikaryotyypityksessä. Merkkikromosomin alkuperä selvisi jokaisessa tapauksessa. Yhdeltä potilaalta (32) löytyi täysin uutena poikkeavuutena kromosomin 21 pitkästä haarasta 4 Mb:n suuruinen kahdentuma, joka vahvistettiin FISH:lla. Kissansilmäoireyhtymään liittyvä dup22q11.2 havaittiin sikiöllä (36) (kuva 4) ja pojalla (37), joiden kromosomitutkimuksessa oli todettu pieni ylimääräinen merkkikromosomi. Molekyylikaryotyypitys kehitysvammaisuuden diagnostiikassa Pohdinta Uuden menetelmän tuomat haasteet. Molekyylikaryotyypitykseen voidaan käyttää mikrosiruja, jotka sisältävät erilaisia koettimia ja koetinmääriä (Ylstra ym. 2006). Yleisesti käytetään nk. BAC-, oligonukleotidi- tai SNP-koettimia, joiden lukumäärä vaihtelee tuhannesta jopa neljään miljoonaan. Valitsimme tutkimukseemme suhteellisen herkän 244 000 oligonukleotidikoettimen mikrosirun. Kun valtaosa oligonuleotidikoettimista tunnistaa koodaavia geeniosia, voidaan osoittaa yksittäisen geenin ja jopa geenin osan muutos. Kopiomäärämuutosten selvittäminen koodaavista geeneistä helpottaa löydöksen tulkintaa. Tämä on merkittävää arvioitaessa, onko kopiomäärämuutoksella syy-yhteys taudin klii 1031

Potilas no 12 del(10q23.31) Potilas no 7 PTEN del(5q35.2) NSD1 Kuva 2. Potilaalla 12 todettiin molekyylikaryotyypityksessä Cowdenin taudin PTEN-geenin häviämä ja potilaalla 7 Sotosin oireyhtymän NSD1-geenin häviämä. Geenimutaatiot (ympyröity) varmistettiin PCR:llä. niseen kuvaan vai onko kyseessä harmiton normaaliin muunteluun kuuluva muutos. Käyttämämme menetelmä on laajoissa validointikokeissamme osoittautunut toistettavaksi. Niinkin pienet kuin 0,5 Mb:n muutokset voidaan todeta luotettavasti ja toistettavasti. Pienten, alle miljoonan emäsparin suuruisten muutosten kliinisen merkityksen arviointia hankaloittaa hiljan havaittu geenien normaali kopiomäärämuuntelu. Laajat kansainväliset tuhansia henkilöitä käsittävät populaatiotutkimukset ovat osoittaneet, että yksittäisten nukleotidipolymor 1032 S. Knuutila ym.

Potilas no 2 3 9 del(3q24q25.32) del(4pterp16.2) del(6q26qter) Potilas no 10 13 14 del(10q11.22q11.23) del(12q24.31) dup(16p13.3p13.2) Potilas no 15 17 18 dup(17p13.3p13.1) dup(22q13.1q13.2) dup(xq11.1q13.1) Kuva 3. Molekyylikaryotyypityksen osoittamia mikrohäviämiä ja kahdentumia, joita ei todettu tavanomaisella kromosomitutkimuksella. Molekyylikaryotyypitys kehitysvammaisuuden diagnostiikassa 1033

fismien lisäksi geenien ja jopa geenirykelmien kopiomäärän periytyvä muuntelu on paljon aiemmin luultua yleisempää ja että tämä muuntelu on merkittävä genomin monimuotoisuutta aiheuttava mekanismi. Kopiomäärämuutosten osuuden on osoitettu kattavan jopa 12 % koko genomista (Redon ym. 2006). Koska suurin kuvattu muuntelualue on yli 2 Mb:n suuruinen ja sisältää useita geenejä, on pienten muutosten kliinisen merkityksen tulkitseminen ongelmallista. Keskeisiä tulkinnassa huomioon otettavia seikkoja ovat muutosalueen koon lisäksi sen geenisisältö (tunnetaanko yksittäisissä geeneissä polymorfismia) ja onko muutos periytynyt terveeltä vanhemmalta vai de novo syntyinen. Omiin kokemuksiimme ja uusimpiin ulkomaisiin tutkimuksiin (Ylstra ym. 2006) tukeutuen valitsimme seuraavat kriteerit. 1) Vähintään 2,5 Mb:n muutosta pidetään kehitysviiveen syynä, eikä lisätutkimuksia tällöin tarvita. Tämän raja-arvon valintaa tukee laaja polymorfismia käsittelevä Redonin ym. (2006) tutkimus, jossa ei löydetty yli 2,3 Mb:n suuruisia polymorfisia alueita. 2) 1 2,5 Mb:n muutosta pidetään kehitysviiveen syynä, jos vanhempien tulos on normaali eikä vastaavaa poikkeavuutta ole kuvattu polymorfisena. 3) Alle 1 Mb:n muutos tulee varmistaa esimerkiksi PCR:llä tai FISH:lla, ja myös vanhemmat tulee tutkia. Kliinisen merkityksen tulkinta saattaa silti jäädä epävarmaksi, sillä toistaiseksi suomalaisesta väestöstä ei ole tehty laajoja populaatiotutkimuksia geenien kopiomääräpolymorfismeista. Yksittäisen geenin tai geenin osan kopiomäärän muutoksen kliinisessä arvioinnissa auttaa tieto tunnetusta kehitysvammaisuutta aiheuttavasta geenistä ja sen yhdistämisestä kliiniseen kuvaan. Molekyylikaryotyypityksen tuloksen arvioiminen näissä tapauksissa edellyttää siis tietokantoihin perehtymistä ja kiinteää vuorovaikutusta perinnöllisyyslääkärin kanssa. Vaikka kopiomäärämuunteluun liittyvät geenialueet jäävät huomioimatta diagnostisen tutkimuksen lausunnossa, jossa arvioidaan löydöksen kliinistä merkitystä, tulisi tutkimusmielessä selvittää tarkkaan jokaisen potilaan tapauksessa genomin muuntelualueet. Erityisen tärkeää on selvittää muuntelualueen suuruus ja geenisisältö. Sinänsä harmiton muuntelualue voi johtaa patogeeniseen muutokseen. Tästä hyvänä esimerkkinä on 17q21-MAPT-oireyhtymä, jossa MAPT-geenin mikrohäviämä alkaa tunnetulta kahdentuma- tai puuttuma-alueelta (Koolen ym. 2006, Shaw-Smith ym. 2006). Alueeseen liittyvä ns. kääntymäpolymorfismi voi johtaa kopiomäärän harmittomaan muutokseen mutta joskus oireyhtymän aiheuttavaan MAPT-häviämään. Genomin useisiin muuntelualueisiin (harmittomiin polymorfismeihin) liittyykin uskoaksemme alttius synnyttää patogeenisia kopiomäärämuutoksia. Uusia ja tunnettuja mikromuutoksia. Tutkimiemme 104:n karyotyypiltään normaalin potilaan joukossa kehitysvammaisuuden etiologinen syy löytyi molekyylikaryotyypityksellä 18:lta ja mahdollinen syy 11:ltä. Poikkeavien löydösten osuus vastaa melko hyvin muissa vastaavissa aineistoissa havaittuja (7 24 %) (Shaw-Smith ym. 2004, Friedman ym. 2006, Shaffer ym. 2007). Näinkin suuri vaihtelu johtunee suurimmaksi osaksi potilasaineistojen valintakriteereistä ja käytetystä menetelmästä. Laajin on Shafferin ym. (2007) tutkimus lähes 9 000 kehityshäiriöpotilaasta. Potilaiden kliininen kuva vaihteli suuresti, mutta heidän perussytogeneettinen (myös subtelomeeri-fish, spesifisen kromosomialueen FISH ja fragiili-x:n määritys) löydöksensä oli normaali. Aineistossa todettiin kliinisesti merkittäviä muutoksia noin 7 %:lla potilaista ja poikkeavuuksia, joiden kliininen merkitys jäi avoimeksi, 2,5 %:lla. Poikkeavuuksien pieni osuus tässä aineistossa verrattuna meidän ja eräiden muiden kansainvälisten tutkimusten osoittamaan osuuteen voi johtua Shafferin ym. (2007) käyttämästä BAC-mikrosirusta. Me käytimme suuremman erottelukyvyn omaavaa oligonukleotidimikrosirua. Sekä oma potilasaineistomme että Shafferin ym. (2007) aineisto koostuivat hyvinkin erilaisista potilaista, joille yhteistä oli kromosomipoikkeavuus kliinisten piirteiden mahdollisena syynä. Shafferin ym. näytteistä oli tehty FISH- ja kromosomien raita-analyysit, kun taas meidän aineistostamme oli tehty ainoastaan raita-analyysi. Joillakin potilaistamme poikkeavuus olisi 1034 S. Knuutila ym.

A 47, XY, +mar(idic(22)) B dup(22q11.2) Kuva 4. Sikiön (potilas 36) merkkikromosomin alkuperäksi paljastui kissansilmäoireyhtymän kriittinen alue. Moniväri-FISH paljasti merkkikromosomin sisältävän materiaalia kromosomista 22 (A), ja molekyylikaryotyypityksellä se varmistui kissansilmäoireyhtymän 22q-kahdentumaksi (B). Molekyylikaryotyypitys kehitysvammaisuuden diagnostiikassa 1035

saattanut tulla esiin tarkemmalla sytogeneettisellä menetelmällä. Noin 5 Mb:n suuruiset häviämät on periaatteessa mahdollista havaita kromosomien tarkennetulla raita-analyysillä. Poikkeavuuksien suuren osuuden aineistossamme saattaa selittää myös sen, että suomalaiseen väestöön on kasautunut»suomi-neidon geeneihin» liittyviä kopiomäärämuutoksia. Jäljempänä käsiteltävät potilaat, joilla todettiin periytyvät kopiomäärämuutokset, ja suurin osa muista tutkimistamme potilaista oli Oulun alueelta. Osa kuvaamistamme poikkeavuuksista on uusia ja osa muiden tutkijoiden aiemmin raportoimia. Äskettäin on kuvattu useita 16p13-kahdentumapotilaita, joten tätä kahdentumaa voidaan pitää uutena kromosomioireyhtymänä (Friedman ym. 2006). Niin Poikkeavuuden tunnistaminen on tärkeää uusiutumisriskin ja mahdollisen sikiödiagnostiikan kannalta ikään 17q21-MAPT oireyhtymän on hiljan esitetty olevan yleinen, ellei jopa yleisin häviämäoireyhtymä (Koolen ym. 2006, Shaw-Smith ym. 2006). Aineistossamme oli kolme potilasta, joilla todettiin 17q21-MAPT-alueen häviämä. Toistaiseksi vain yhden vanhemmat on tutkittu ja potilaan kromosomipoikkeavuus varmistettu PCR-menetelmällä. PCR tuotti molekyylikaryotyypitystä tukevan löydöksen. Kummallakaan vanhemmalla ei havaittu mikrohäviämää. Näin ollen MAPT-geenin häviämä on de novo syntyinen ja voidaan päätellä, että se on potilaan kliinisten oireiden ja löydösten syy. MAPT-häviämäoireyhtymän kliininen kuva ja kliiniset tyyppipiirteet ovat vasta hahmottumassa (Koolen ym. 2006, Shaw-Smith ym. 2006, Varela ym. 2006). Näitä ovat pieni syntymäpaino, vastasyntyneisyyskauden velttous tai syömisvaikeudet, liikunnallisen ja älyllisen kehityksen viive ja dysmorfiset kasvonpiirteet. Potilaallamme oli ensin mainittujen oireiden ja löydösten lisäksi pitkänomaiset kasvot, leveät kulmakarvat, epikantuspoimut, leveä ja kaksiosainen nenänkärki, pienet nenänsiivekkeet, uurteinen ylähuulivako, kapea suulaki, leveä alahuuli ja täyteläinen leuka. Vartalo suhteessa raajoihin oli pitkä, peukalot olivat leveät, ja jaloissa oli sandaalivaot. Kahdelle muulle potilaalle emme vielä ole suorittaneet kriteereittemme edellyttämiä vanhempien tutkimuksia emmekä poikkeavuuden varmistamista muulla menetelmällä, joten muutoksen kliininen merkitys jää arvioitavaksi jatkotutkimusten jälkeen. Uskomme kuitenkin, että muutokset ovat syy-yhteydessä potilaiden oireisiin. Toisella näistä potilaista on edellä mainitut oireyhtymän tyyppipiirteet. Tämän lisäksi hänellä on suurten nivelten synnynnäiset jäykistymät, pehmytosiltaan osittain yhteen kasvaneet sormet, nivustyrä, laskeutumattomat kivekset ja alikehittyneet ulkoiset sukupuolielimet, joita ei ole todettu muilla potilailla. Sotosin oireyhtymä ja Cowdenin tauti ovat tyypillisesti geenimutaation aiheuttamia. Ensin mainitussa mutaatio on NSD1-geenin 5q35.2- raidassa ja jälkimmäisessä PTEN-geenin 10q23.31-raidassa. Aineistossamme mainitut oireyhtymät esiintyivät epätyypillisinä: erityisesti Sotos-potilaan oireet olivat poikkeuksellisen vaikeat. Poikkeavat oireet selittää monien geenien häviämä. Näiden oireyhtymien ja varmaan monien muidenkin kliinisten piirteiden vaihtelevuus selittyy genomisen poikkeavuuden erilaisuudesta: osalla potilaista on pelkkä kohdegeenin mutaatio kun taas toisilla on mukana erisuuruisia useiden geenien häviämiä tai kahdentumia. Nähtäväksi jää, kuinka moneen molekyylikaryotyypityksen perusteella todettuun muutokseen (Internet-oheisaineiston taulukko 1 ja taulukko 2) liittyy yhtenäinen oireyhtymä. Uusien mikrohäviämä- ja mikrokahdentumaoireyhtymien löytämisen kannalta on tärkeää, että yksittäisiä tapauksia raportoidaan ja tiedot potilaiden poikkeavuuksista viedään kansainvälisiin tietokantoihin. Vaikka poikkeavuuksien tulkitsemiskriteerien on syytä olla tiukat, ne eivät saisi sulkea pois epävarmojenkaan löydöksien mainitsemista. Koska uusien asioiden löytäminen on lähes aina alkanut epämääräisistä havainnoista, täytyisi muitakin kuin vankkaan näyttöön perustuvia muutoksia ja ilmiöitä raportoida. Periytyvät kopiomäärämuutosalueet kehitysvammasuvuissa. Löysimme ainakin kaksi tai mahdollisesti neljä kopiomäärämuutosta, jotka aiheuttavat periytyvää kehitysviivästymää (potilaat 8, 17, 22 ja 23). Lievästi kehitysvam 1036 S. Knuutila ym.

maisella pojalla (8) sekä hänen äidillään ja siskollaan todettiin dup6p22.3. Kymmenen tällä alueella sijaitsevan geenin joukkoon kuuluvat DCDC2, KIAA0319 ja ALDH5A1. DCDC2- ja KIAA0319-geenien tiedetään liittyvän dysleksiaan (Cope ym. 2005, Schumacher ym. 2006), ja ALDH5A1 on yhdistetty kehitysvammaan (Pearl ym. 2003, Knerr ym. 2007). Periytyvä kahdentuma dup(22q13.1q13.2) todettiin kehitysvammaisilla sisaruksilla (17), joilla oli yhtenäisiä rakennepoikkeavuuksia. Edellä mainituissa perheissä voitiin periytyvän kopiomäärämuutoksen katsoa olevan kehityshäiriön syy. Ensimmäisessä perheessä havaittu löydös varmistettiin PCR-menetelmällä, ja lisäksi tiedetään DCDC2-, KIAA0319- ja ALDH5Ageenien aiheuttavan oppimisvaikeuksia ja kehityshäiriöitä (Pearl ym. 2003, Cope ym. 2005, Schumacher ym. 2006, Knerr ym. 2007). Jälkimmäisessä perheessä todettua 4 Mb:n suuruista aluetta, joka sisältää 66 koodaavaa geeniä, ei ole kuvattu normaalina genomisena muunteluna. Koska molemmat poikkeavuudet ovat luotettavasti todettavissa molekyylikaryotyypityksellä, on löydöksellä luonnollisesti suuri merkitys perinnöllisyysneuvontaa ajatellen. Kolmella miespuolisella potilaalla (18, 28 ja 29) oli äidiltä peritty X-kromosomin kahdentuma- tai häviämäalue (kuva 3) ja yhdellä (27) kahdentuma-alue. Äskettäin on osoitettu, että äidin poikkeava X-kromosomi ei aiheuta sairautta (Tzschach ym. 2008). Kehityshäiriöisillä pojilla nämä hyvinkin pienet kahdentumat ja häviämät näyttävät olevan paljon yleisempiä kuin aiemmin on luultu. Poikkeavuuden tunnistaminen on tärkeää uusiutumisriskin ja mahdollisen sikiödiagnostiikan kannalta. Molekyylikaryotyypitys tarkensi kromosomitutkimuksen tuloksen. Sen enempää tavanomainen sytogenetiikka kuin FISH-menetelmätkään eivät paljasta pienten merkkikromosomien tarkkaa alkuperää. Tutkimuksessamme voitiin selvittää täsmällisesti merkkikromosomien geenisisältö. Aiemmin jo korostettiin, että sikiödiagnostiikan kannalta molekyylikaryotyypitys osoittautui ensisijaisen tärkeäksi potilaalle, jolla merkkikromosomiin osoitettiin sisältyvän kissansilmäoireyhtymän kriittinen alue. Käyttämämme oligonukleotidipohjaisen sirun etu tuli esille erityisesti tässä tapauksessa, jossa se välittömästi paljasti poikkeavat geenit. Monissa muissa tutkimuksissa käytetyllä BACpohjaisella mikrosirulla ei välttämättä saada suoraa tietoa geeneistä, poikkeavasta alueesta kylläkin. Sekä merkkikromosomien että kromosomikääntymien tutkiminen tavanomaisella kromosomien raita-analyysillä on ollut vaikeaa, eikä muutosta ole juuri pystytty määrittämään tarkasti. Kahdella potilaallamme (30 ja 33) peruskaryotyypin tulkintana inv dup, mikä tarkoittaa kromosomikääntymään (inversio) liittyvän kromosomiaineksen kahdentumaa (duplikaatio) ja häviämää (deleetio). Molemmissa tapauksissa poikkeavuus varmistui ja voitiin osoittaa tarkalleen, mikä kromosomialue oli kahdentunut ja mikä puuttui. Potilaalla 32 (Internet-oheisaineiston taulukko 2) todettiin synnynnäisiä rakennepoikkeavuuksia, jotka kliinisesti sopivat okulo-aurikulo-vertebraali- eli OAV-kirjoon. Komplisoituneen synnynnäisen kromosomipoikkeavuuden y d i n a s i a t Molekyylikaryotyypityksellä löydetään jopa alle miljoonan emäsparin suuruisia mikrohäviämiä ja kahdentumia, joita ei voida todeta tavanomaisilla sytogenetiikan menetelmillä. Kehityshäiriön selittävä mikromuutos havaittiin yli 15 %:lla tutkimistamme potilaista. Molekyylikaryotyypitys ehdotetaan tehtäväksi kehityshäiriöiselle potilaalle silloin, kun tavanomaisen kromosomitutkimuksen tulos on normaali. Molekyylikaryotyypitys korvaa prometafaasikokeet ja suurimman osan FISH-tutkimuksista. Molekyylikaryotyypitys kehitysvammaisuuden diagnostiikassa 1037

molekulaarinen selvittäminen molekyylikaryotyyppauksella avasi mahdollisuuden 5p- ja 21qhäviämissä sijaitsevien geenien määritykselle ja pohdinnalle 5p-häviämän osuudesta OAV-kirjon taustalla. OAV-kirjoon kuulumattomana löydöksenä esiintyi etenevä luuytimen hypoplasia, joka koski kaikkia luuytimen solulinjoja. Kromosomialueella 21q22 molekyylikaryotyypitys paljasti uutena löydöksenä neljän miljoonan emäsparin suuruisen kahdentuman. Kahdentuma-alueella sijaitsevien geenien tunnistaminen antoi mahdollisuuden pohtia niiden merkitystä luuydinhypoplasian synnyssä. Muun muassa hyvin tunnettu syöpägeeni AML1 oli yksi monistuneista geeneistä. Downin oireyhtymän ilmiasulle kriittinen alue on äskettäin rajattu kromosomialueelle 21q22.13-q.22.2 (Ronan ym. 2007), jonka ulkopuolelle potilaalla todettu kahdentuma jää. Molekyylikaryotyypityksen kustannus-hyötysuhde. Moneen muuhun uuteen menetelmään verrattuna voidaan molekyylikaryotyypityksen kustannus-hyötysuhdetta pitää erinomaisena. Etiologinen diagnoosi on jo sinänsä perheelle tärkeä. Lisäksi on taloudellisesti merkittävää, että etiologian selvittyä voidaan lopettaa muiden, hyvinkin hintavien diagnostisten tutkimusten jatkaminen. Kahdessa tapauksessa tarkka molekulaarinen diagnoosi molekyylikaryotyyppauksella oli avainasemassa vanhempien harkitessa raskauden jatkamista tai keskeyttämistä sikiöllä todetun merkkikromosomin tai perheessä esiintyvän kromosomikääntymän vuoksi. Potilaalla 36 (sikiö) merkkikromosomiin todettiin sisältyvän kissansilmäoireyhtymän kriittinen monistuma-alue (kuva 4) ja potilaan nro 30 sukulaisen sikiötutkimuksessa todettiin perheessä esiintyvän kromosomikääntymän olevan tasapainoisessa muodossa. Milloin molekyylikaryotyypitys? Noin 20 %:lla aineistomme karyotyypiltään normaaleista kehityshäiriöpotilaista löytyi taudin selittävä poikkeavuus, ja kaikki muilla sytogeneettisillä menetelmillä osoitetut poikkeavuudet täsmentyivät. Molekyylikaryotyypitys tulisikin tehdä karyotyypiltään normaaleille potilaille, joilla on kehitysviivästymä, vaihtelevia rakenneanomalioita tai poikkeavat ulkoiset piirteet. Molekyylikaryotyypitys korvaa prometafaasi- ja FISH-tutkimukset, myös mikrohäviämien ja kahdentumien selvittämisessä. Lisäksi molekyylikaryotyypitys on aiheellinen, jos kehityshäiriöpotilaalla on alkuperältään tunnistamaton merkkikromosomi, inversio tai tasapainossa oleva kromosomitranslokaatio. Kuten monet uudet raportit osoittavat, eivät kaikki kromosomitutkimuksissa havaittavat tasapainottuneilta näyttävät siirtymät ja kääntymät olekaan tasapainossa, vaan molekyylikaryotyypitys osoittaa katkoskohdan häviämän tai kahdentuman (Hayashi ym. 2007, Simovich ym. 2007). Lopuksi Tarvitaanko tavanomaista kromosomitutkimusta enää lainkaan? Voidaanko tavanomaisella menetelmällä havaita jotakin, mitä molekyylikaryotyypityksellä ei löydettäisi? Molekyylikaryotyypityksellä ei ole mahdollista todeta tasapainossa olevaa kromosomien rakennepoikkeavuutta, kuten siirtymää tai kääntymää. Koska kehityshäiriöpotilaan etiologisessa selvittelyssä ei tasapainossa olevan siirtymän osoittaminen ole kuitenkaan diagnostiikan kannalta merkityksellistä, jää siirtymän syy-yhteys tautiin avoimeksi. Periytyvän siirtymän löytymisellä on kuitenkin suuri merkitys uusiutumisriskin arvioimisessa. Kun molekyylikaryotyypitys maksaa saman verran kuin muut tutkimukset, se on kehityshäiriöiden ensisijainen sytogeneettinen diagnosointimenetelmä. Löydöksen mukaan tutkimusta täydennetään tavanomaisella kromosomitutkimuksella tasapainossa olevien siirtymien löytämiseksi. Toistaiseksi molekyylikaryotyypityksen hinta on kaksinkertainen tavanomaiseen kromosomitutkimukseen verrattuna mutta samalla tasolla kuin FISH- tai prometafaasi- ja tavanomainen kromosomitutkimus yhdessä. Viime vuoden aikana tutkimuksen hinta on laskenut 30 %, ja hintojen voidaan odottaa laskevan edelleen. 1038 S. Knuutila ym.

Kirjallisuutta Castellví-Bel S, Milá M. Genes responsible for nonspecific mental retardation. Mol Genet Metab 2001;72:104 8. Cope N, Harold D, Hill G, ym. Strong evidence that KIAA0319 on chromosome 6p is a suspectibility gene for developmental dyslexia. Am J Hum Genet 2005;76:581 91. Friedman JM, Baross A, Delaney AD, ym. Oligonucleotide microarray analysis of genomic imbalance in children with mental retardation. Am J Hum Genet 2006;79:500 13. Hayashi S, Ono M, Makita Y, ym. Fortuitous detection of a submicroscopic deletion at 1q25 in a girl with Cornelia-de Lange syndrome carrying t(5;13)(p13.1;q12.1) by array-based comparative genomic hybridization. Am J Med Genet A 2007;143:1191 7. Knerr I, Gibson K, Ganesh J, ym. Diagnostic challenges in a severely delayed infant with hypersomnolence, failure to thrive and arteriopathy: a unique case of γ-hydroxybutyric aciduria and Williams syndrome. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet 2007;144:946 8. Koolen DA, Vissers LE, Pfundt R, ym. A new chromosome 17q21.31 microdeletion syndrome associated with a common inversion polymorphism. Nat Genet 2006;38:999 1001. Pearl PL, Gibson KM, Acosta MT, ym. Clinical spectrum of succinic semialdehyde dehydrogenase deficiency. Neurology 2003;60:1416 7. Redon R, Ishikawa S, Fitch KR, ym. Global variation in copy number in the human genome. Nature 2006;444:444 54. Ronan A, Fagan K, Christie L, ym. Familial 4.3 Mb duplication of 21q22 sheds new light on the Down syndrome critical region. J Med Genet 2007;44:448 51. Rosenberg C, Knijnenburg J, Bakker E, ym. Array-CGH detection of micro rearrangements in mentally retarded individuals: clinical significance of imbalances present both in affected children and normal parents. J Med Genet 2006;43:180 6. Schoumans J, Ruivenkamp C, Holmberg E, Kyllerman M, Anderlid BM, Nordenskjöd M. Detection of chromosomal imbalances in children with idiopathic mental retardation by array based comparative genomic hybridisation (array-cgh). J Med Genet 2005;42:699 705. Schumacher J, Anthoni H, Dahdouh F, ym. Strong evidence of DCDC2 as a susceptibility gene for dyslexia. Am J Hum Genet 2006;78:52 62. Shaffer LG, Bejjani BA, Torchia B, Kirkpatrick S, Coppinger J, Ballif BC. The identification of microdeletion syndromes and other chromosome abnormalities: cytogenetic methods of the past, new technologies for the future. Am J Med Genet C Semin Med Genet 2007;145:335 45. Shaw-Smith C, Pittman AM, Willatt L, ym. Microdeletion encompassing MAPT at chromosome 17q21.3 is associated with developmental delay and learning disability. Nat Genet 2006;38:1032 7. Shaw-Smith C, Redon R, Rickman L, ym. Microarray based comparative genomic hybridisation (array-cgh) detects submicroscopic chromosomal deletions and duplications in patients with learning disability/mental retardation and dysmorphic features. J Med Genet 2004;41:241 8. Simovich M, Yatsenko S, Kang S-H, ym. Prenatal diagnosis of a 9q34.3 microdeletion by array-cgh in a fetus with an apparently balanced translocation. Prenat Diagn 2007;27:1112 7. Tyybäkinoja A, Knuutila S. Molekyylikaryotyypitys raja sytogenetiikan ja molekyylibiologian väliltä häviämässä. Duodecim 2006;122:2018 22. Tzschach A, Chen W, Erdogan F, ym. Characterization of interstitial Xp duplications in two families by tiling path array CGH. Am J Med Genet A 2008;146:197 203. Varela MC, Krepischi-Santos AC, Paz JA, ym. A 17q21.31 microdeletion encompassing the MAPT gene in a mentally impaired patient. Cytogenet Genome Res 2006;114:89 92. Ylstra B, van den Ijssel P, Carvalho B, Brakenhoff RH, Meijer GA. BAC to the future! or oligonucleotides: a perspective for micro array comparative genomic hybridization. Nucleic Acids Res 2006;34:445 50. SAKARI KNUUTILA, FT, professori LINDA SIGGBERG, FM Helsingin yliopisto, Haartman-instituutti ja HUSLAB, molekyylipatologian laboratorio PL 400, 00029 HUS SIRPA ALA-MELLO, LT, erikoislääkäri HUSLAB, perinnöllisyyslääketieteen osasto PL 140, 00029 HUS MAILA PENTTINEN, LL, erikoislääkäri TYKS:n lastenklinikka perinnöllisyyspoliklinikka PL 52, 20521 Turku AKI MUSTONEN, LT, erikoislääkäri JAAKKO IGNATIUS, LT, professori, ylilääkäri OYS:n perinnöllisyyspoliklinikka 90029 OYS CARINA WALLGREN-PETTERSSON, dosentti, vastaava lääkäri Folkhälsanin perinnöllisyysklinikka ja Helsingin yliopiston lääketieteellisen genetiikan osasto PL 211, 00251 Helsinki Sidonnaisuudet: Ei ilmoitusta sidonnaisuuksista Molekyylikaryotyypitys kehitysvammaisuuden diagnostiikassa 1039