Suomalaisesta broilerintuotantoketjusta, broilerinlihasta ja koirista eristettyjen AmpC-positiivisten Escherichia coli -bakteerien

Suomalaisesta broilerintuotantoketjusta, broilerinlihasta ja koirista eristettyjen AmpC-positiivisten Escherichia coli -bakteerien resistenssiplasmidien ja genomin tyypittäminen Heli Tamminen Pro gradu -tutkielma Jyväskylän Yliopisto Bio- ja ympäristötieteiden laitos Solu- ja molekyylibiologia 29.5.2014

Alkusanat Tämän työn kokeellinen osa suoritettiin Elintarviketurvallisuusvirasto Eviran Eläintautibakteriologian tutkimusyksikössä Kuopiossa syksyn 2012 ja kesän 2013 aikana. Kirjoitusprosessi tapahtui pääosin syksyn 2013 ja kevään 2014 välisenä aikana työn ja muun opiskelun ohella. Pro gradu -työn tekeminen oli haastavaa mutta erittäin antoisaa. Haluan kiittää yksikönjohtajaa Sinikka Pelkosta, joka myös toimi ohjaajanani, mahdollisuudesta tehdä tämä pro gradu -työ Kuopion Eviran tutkimusyksikössä. Haluan antaa myös ison kiitoksen toiselle ohjaajalleni erikoistutkija Tarja Pohjanvirralle, joka on ohjannut ja valvonut graduprosessini etenemistä alusta loppuun asti. Kiitos kuuluu myös koko laboratorion väelle ja erityisesti laborantti Riitta Paldanius-Vidgrénille sekä laborantti Riikka Luukkaselle, jotka ovat opastaneet minua käytännön töissä. Suurta tukea olen saanut myös tutkija Nella Vähänikkilältä, jonka kanssa graduun liittyviä asioita on monesti puitu yhdessä, ja jolta olen saanut apua myös laboratoriossa. Lisäksi haluan kiittää perhettäni tuesta ja kannustuksesta tässä pitkässä projektissa ja avopuolisoani, joka on jaksanut olla vierelläni turhautumisien hetkillä sekä iloinnut kanssani onnistumisista. Suuri kiitos kuuluu myös avopuolisoni vanhemmille, jotka ovat majoittaneet ja pitäneet huolta minusta Kuopiossa asuessani.

Jyväskylän yliopisto Matemaattis-luonnontieteellinen tiedekunta Pro gradu tutkielman tiivistelmä Tekijä: Heli Tamminen Tutkielman nimi: Suomalaisesta broilerintuotantoketjusta, broilerinlihasta ja koirista eristettyjen AmpC-positiivisten Escherichia coli -bakteerien resistenssiplasmidien ja genomin tyypittäminen English title: Plasmid and genomic typing of AmpC producing Escherichia coli from Finnish broiler production, broiler meat and dogs Päivämäärä: 29.5.2014 Sivumäärä: 49 Laitos: Bio- ja ympäristötieteiden laitos Oppiaine: Solu- ja molekyylibiologia Tutkielman ohjaajat: Professori ELT Sinikka Pelkonen, ELL Tarja Pohjanvirta Tiivistelmä: Plasmidivälitteistä AmpC-beetalaktamaasia tuottavia Escherichia coli -bakteereja on löydetty suomalaisesta broilerintuotantoketjusta, broilerinlihasta ja koirista. Nämä bakteerit ovat resistenttejä kolmannen polven kefalosporiineille, joita käytetään yleisesti ihmisten lääkkeenä. Koska resistenssi ilmenee plasmidissa, on mahdollista, että plasmidit siirtyvät konjugaation avulla ihmisille harmittomista bakteereista patogeenisiin bakteereihin. Nämä bakteerit voivat puolestaan siirtyä suoraan ruoan välityksellä tai lemmikkieläimistä ihmisiin ja aiheuttaa vaikeasti hoidettavia infektioita. Tämän tutkielman tarkoitus oli tyypittää yhteensopimattomuus eli inkompatibiliteetti (Inc) ryhmään I1 kuuluvia konjugatiivisia resistenssiplasmideja plasmidien multilokus-sekvenssityypityksen (pmlst) avulla sekä ryhmään K kuuluvia plasmideja restriktioentsyymianalyysin avulla. Nämä menetelmät sopivat plasmidien samankaltaisuuden ja alkuperän tutkimiseen. Resistenssiplasmidien lisäksi tässä työssä tutkittiin fylogeniaryhmiin B2 ja D kuuluvien AmpC-positiivisten E. coli -bakteerien koko genomia multilokussekvenssityypitys (MLST)-analyysillä. Plasmideja konjugoitiin vastaanottajakantaan, jonka jälkeen plasmidit tyypitettiin polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla Inc-ryhmiin. Transkonjuganteista E. coli -bakteereista eristettiin yhteensä 24 IncI1- ja 10 IncKtyypin plasmidia. Plasmidien multilokus-sekvenssityypitystä (pmlst) varten plasmideista monistettiin PCR:n avulla viittä spesifistä geenilokusta, jotka sekvensoitiin. Jokaisen geenilokuksen alleelivariantti tunnistettiin ja plasmidi tyypitettiin alleelivarianttien yhdistelmän mukaan. Restriktioentsyymianalyysissä plasmidit katkaistiin käyttämällä BamHI- ja HindIII-restriktioentsyymejä. Restriktioprofiilit saatiin erottelemalla näytteet agaroosigeelielektroforeesissa. Bakteerien koko genomin tyypitys toteutettiin samaan tapaan kuin pmlst-analyysissä, mutta määrittäen bakteerin genomin seitsemää spesifistä geenilokusta. Suurin osa broilerintuotannosta eristetyistä E. coli -kannoista sisälsi konjugatiivisen resistenssiplasmidin, joka kuului IncI1-tyyppiin. Broilerinlihasta eristettyjen kantojen konjugatiiviset plasmidit kuuluivat sen sijaan suurimmaksi osaksi IncK-tyyppiin. Koirien konjugatiiviset plasmidit kuuluivat IncI1-tyyppiin. pmlst-analyysin mukaan kaikki broilerintuotantoketjun ja broilerinlihan bakteereista eristetyt IncI1- plasmidit kuuluivat samaan sekvenssityyppiin 12. Tästä voidaan olettaa, että plasmidit ovat siirtyneet vertikaalisesti bakteerien mukana yhteisestä lähteestä broilerintuotantoketjussa alaspäin. Plasmidit ovat levittäytyneet tuotantoketjussa todennäköisesti myös horisontaalisesti konjugaation avulla. Restriktioentsyymianalyysin mukaan IncK-plasmideja oli ainakin viittä eri tyyppiä. Broilerintuotannon eri vaiheista ja broilerinlihasta eristetyistä E. coli -bakteereista löydettiin samanlaisesti pilkkoutuneita IncKplasmideja, ja onkin mahdollista, että plasmidit ovat siirtyneet bakteerien välityksellä broilerintuotannosta broilerinlihaan. Koirien E. coli -kannoista eristetyissä plasmideissa oli pieniä eroavaisuuksia. Koska broilerinlihan plasmidit kuuluivat suurimmaksi osaksi IncK-tyyppiin, on kuitenkin hyvin epätodennäköistä, että koirien bakteerien plasmidit olisivat peräisin broilerinlihasta. Lopuksi bakteerien koko genomin tyypityksestä selvisi, että bakteerit kuuluivat sekvenssityyppeihin 131 ja 38. Sekvenssityyppiin ST131 kuuluva E. coli -kanta on resistentti monille antibiooteille ja aiheuttaa ihmisille suoliston ulkopuolisia infektioita. Onkin huolestuttavaa, että tällaisia kantoja löytyy suomalaisesta broilerintuotannosta. Tämän työn tuloksia voidaan hyödyntää suunniteltaessa toimenpiteitä antibioottiresistenssin leviämisen ehkäisemiseen suomalaisessa broilerintuotannossa. Avainsanat: Escherichia coli, plasmidi, AmpC, pmlst

University of Jyväskylä Faculty of Mathematics and Science Abstract of Master s Thesis Author: Heli Tamminen Title of thesis: Plasmid and genomic typing of AmpC producing Escherichia coli from Finnish broiler production, broiler meat and dogs Finnish title: Suomalaisesta broilerintuotantoketjusta, broilerinlihasta ja koirista eristettyjen AmpC-positiivisten Escherichia coli -bakteerien reistenssiplasmidien ja genomin tyypittäminen Date: 29.5.2014 Pages: 49 Department: Department of Biological and Environmental Science Chair: Cell and Molecular Biology Supervisors: Professor VMD Sinikka Pelkonen, VML Tarja Pohjanvirta Abstract: Plasmid mediated AmpC beta-lactamase producing Escherichia coli (E. coli) have been found from Finnish broiler production chain, broiler meat and dogs. These bacteria are resistant to third generation cephalosporins that are frequently used to treat human infections. Because these resistance genes are carried in plasmids they can transfer from commensal bacteria to pathogenic bacteria by conjugation. These bacteria can in turn transfer from food or pets to humans and cause infections that are difficult to treat. The aim of this study was to characterize resistance plasmids belonging to the incompatibility (Inc) group I1 by using plasmid multilocus sequence typing (pmlst) and plasmids belonging to Inc group K by using restriction enzyme analysis. With the help of these methods it is possible to study plasmid similarity and origin. In addition genomes of AmpC positive E. coli -bacteria belonging to phylogenetic groups B2 and D were studied by using multilocus sequence typing (MLST). Plasmids were conjugated to recipient strain and typed to Inc groups using polymerase chain reaction (PCR). A total of 24 IncI1 and 10 IncK plasmids were isolated from E. coli transconjugants. pmlst was performed by amplifying and sequencing five specific plasmid loci. Allele variants for each sequenced loci were identified and plasmids were typed according to the combinations of allele variants. Restriction enzyme analysis was performed by digesting plasmids using HindIII and BamHI restriction enzymes. Samples were resolved on agarose gel to get restriction profiles. The bacterial whole genome typing was performed like plasmid multilocus sequencing but by using seven specific loci of bacterial genome. Most E. coli strains isolated from broiler production chain carried conjugative resistance plasmid belonging to type IncI1. Most strains isolated from broiler meat carried conjugative plasmids belonging to type IncK. E. coli isolated from dogs carried conjugative plasmids belonging to type inci1. According to pmlst all IncI1 plasmids in E. coli isolated from broiler production and broiler meat had the same sequence type 12. This suggests that the plasmids come from a common source and have then transferred vertically via bacteria in the broiler production chain. Plasmids have also probably spread out in the production chain horizontally by conjugation. Restriction enzyme analysis revealed that IncK plasmids belonged to at least five different types. The same restriction profiles were found in bacteria isolated from broiler production chain and broiler meat. It is possible that these plasmids have transferred from broiler production to broiler meat via bacteria. Plasmids in E. coli isolated from dogs had minor differences but because most plasmids from broiler meat were IncK it is quite unlikely that these plasmids originated from broiler meat. Finally bacterial whole genome typing revealed that studied bacteria belonged to sequence types 131 and 38. Sequence type 131 E. coli strain is multi-drug resistant and pathogenic to humans causing extra intestinal infections. It is worrisome that these strains have been found from Finnish broiler production. These results can be useful when planning actions to prevent antibiotic resistance from spreading in Finnish broiler production. Key words: Escherichia coli, plasmid, AmpC, pmlst

Sisällysluettelo Alkusanat Tiivistelmä Englanninkielinen tiivistelmä Lyhenteet 1 Johdanto... 8 1.1 Plasmideista... 8 1.1.1 Konjugatiiviset plasmidit... 8 1.1.2 Plasmidien luokittelu... 9 1.2 Beetalaktaamiantibiootit... 10 1.2.1 Yleistä beetalaktaamiantibiooteista... 10 1.2.2 Beetalaktaamiresistenssi... 11 1.3 ESBL... 12 1.4 AmpC... 12 1.5 ESBL- ja AmpC-geenien yleisyys tuotantoeläimissä, ruoassa ja seuraeläimissä. 14 1.6 Siipikarjassa ja ihmisissä esiintyvien ESBL- ja AmpC-geenien, plasmidien ja E. coli -kantojen yhtäläisyydet... 15 1.7 Broilerinkasvatus Suomessa... 16 1.8 Multilokus-sekvenssityypitys-menetelmä bakteerien ja plasmidien tutkimisessa 17 2 Tutkimuksen tavoitteet... 19 3 Materiaalit ja menetelmät... 20 3.1 E. coli -kannat... 20 3.2 Konjugaatiokoe... 20 3.3 CIT-PCR... 21 3.4 Inc-tyypitys-PCR... 22

3.5 Plasmidien eristys transkonjuganteista... 25 3.6 Plasmidien eristys villin tyypin bakteerikannoista... 26 3.7 pmlst... 26 3.8 Restriktioentsyymianalyysi... 28 3.9 MLST... 29 4 Tulokset... 32 4.1 Konjugaatio... 32 4.2 CIT-PCR ja Inc-tyypitys... 32 4.3 IncI1-plasmidien pmlst... 35 4.4 IncK-plasmidien eristys ja restriktioentsyymianalyysi... 35 4.5 MLST... 37 5 Tulosten tarkastelu... 38 5.1 Konjugaatio... 38 5.2 AmpC-geeni ja Inc-tyypit... 39 5.3 pmlst ja restriktioentsyymianalyysi... 40 5.4 MLST... 42 5.5 Tulosten hyödyntäminen... 43 5.6 Yhteenveto... 43 6 Lähdeluettelo... 45

Lyhenteet AmpC BHI ESBL Inc LB MLST PBP PFGE pmlst ST TSA AmpC-luokan beetalaktamaasi brain-heart infusion laajakirjoinen beetalaktamaasi yhteensopimattomuus eli inkompatibiliteetti Luria-Bertani multilokus-sekvenssityypitys penisilliiniin sitoutuva proteiini pulssikenttäelektroforeesi plasmidien multilokus-sekvenssityypitys sekvenssityyppi tryptic soy-agar

8 1 Johdanto Escherichia coli on gram-negatiivinen bakteeri, joka elää tavallisesti ihmisten ja eläinten suolistossa. E. coli -bakteeri voi olla myös patogeeninen ja aiheuttaa suolitulehduksia sekä suoliston ulkopuolella muun muassa virtsatieinfektioita ja aivokalvontulehdusta. E. coli - bakteerin aiheuttamia infektioita hoidetaan ihmisillä pääasiassa laajakirjoisilla beetalaktaamiantibiooteilla. Näille antibiooteille vastustuskykyiset bakteerikannat ovat lisääntyneet ja levinneet ympäri maailmaa viime vuosikymmeninä (EFSA 2011). Resistenttiys laajakirjoisille beetalaktaamiantibiooteille on liitetty laajakirjoisiin beetalaktamaasi (ESBL) -geeneihin sekä AmpC-luokan beetalaktamaasigeeneihin. Tuotantoeläimissä ESBL- ja AmpC-geenejä on todettu erityisesti siipikarjassa ja ne mahdollisesti toimivat näiden geenien varastoina (Smet ym., 2008; Börjesson ym., 2013b). Myös suomalaisista broilerintuotantoketjun näytteistä ja broilerinlihasta sekä koirien ulosteista on löydetty plasmidivälitteistä AmpC-entsyymiä tuottavia E. coli -kantoja (Evira ja THL julkaisematon). Koska plasmidit voivat siirtyä konjugaation avulla bakteerista toiseen, voi resistenttiys levitä sopivissa olosuhteissa nopeasti. Tämä on uhka ihmisten terveydelle, sillä resistenttien bakteerien aiheuttamia infektioita on vaikea hoitaa. Vaikka ei ole olemassa paljon näyttöä resistenttien bakteerien siirtymisestä ruoan välityksellä tai lemmikkieläimistä ihmisiin, tätä pidetään kuitenkin todennäköisenä (EFSA 2011). 1.1 Plasmideista 1.1.1 Konjugatiiviset plasmidit Antibioottiresistenssigeenit, kuten ESBL- ja AmpC-geenit, ilmenevät usein plasmideissa (ks. yleiskatsaus Carattoli 2003). Plasmidit ovat kaksijuosteisia DNA-molekyylejä, jotka sijaitsevat bakteerin kromosomin ulkopuolella solulimassa useimmiten rengasmaisina rakenteina. Plasmidit voivat olla kooltaan vain muutamasta tuhannesta emäsparista useaan sataan kiloemäspariin ja ne pystyvät replikoitumaan itsenäisesti (ks. yleiskatsaus Couturier ym., 1988). Isäntäbakteeri tulee toimeen ilman plasmidia, sillä plasmidi ei sisällä isännälle välttämättömiä geenejä. Sen sijaan plasmideissa voi olla isännälle hyödyllisiä

9 ominaisuuksia, joita antibioottiresistenssin lisäksi ovat muun muassa virulenssitekijät, myrkkyjen eritys ja kyky metaboloida tiettyjä molekyylejä (ks. yleiskatsaus Couturier ym., 1988). Plasmidit siirtyvät vertikaalisesti bakteerisukupolvelta toiselle, mutta useat plasmidit pystyvät lisäksi konjugoitumaan eli siirtymään bakteerista toiseen jopa eri bakteerilajien välillä. Konjugaatio on yksi horisontaalisen geenien siirtymisen mekanismeista transformaation ja transduktion lisäksi (ks. yleiskatsaus Thomas ja Nielsen 2005). Konjugatiiviset plasmidit ovat merkittäviä antibioottiresistenssin leviämisen kannalta, sillä konjugaation avulla plasmidit voivat levitä varsin nopeasti bakteeripopulaatiossa (Dionisio ym., 2002). Konjugaatio on yleistä gram-negatiivisissa bakteereissa, mutta sitä esiintyy myös grampositiivisissa bakteereissa (Willets 1988). Mekanismi on kuitenkin hieman erilainen. Seuraavaksi esitän pääpiirteittäin, miten konjugaatio tapahtuu gram-negatiivisessa E. coli - bakteerissa. Konjugatiiviset plasmidit ovat F-plasmideja, joilla on tarvittavat geenit plasmidin siirtämistä varten. Tällaisia geenejä ovat muun muassa piluksesta vastaavat geenit sekä DNA:n synteesistä ja kuljetuksesta vastaavat geenit (Holmes ja Jobling 1996). Konjugoituakseen bakteerien pitää olla läheisessä kontaktissa toisiinsa. Bakteerit muodostavat piluksen avulla mating-parin, jossa F-plasmidin kaksijuosteinen DNA katkaistaan replikaation aloituskohdasta relaksaasin välityksellä (ks. yleiskatsaus Lanka ja Wilkins 1995). Yksijuosteinen DNA siirtyy bakteerien välille muodostunutta huokosta pitkin vastaanottajasoluun Rolling circle-replikaation tapaan. Sekä vastaanottaja että luovuttajasolussa yksijuosteinen DNA täydennetään lopuksi kaksijuosteiseksi. 1.1.2 Plasmidien luokittelu Koska plasmideilla on suuri merkitys antibioottiresistenssin leviämisessä, on plasmidien tunnistaminen ja luokittelu tarpeellista. Plasmideja voidaan luokitella yhteensopimattomuus- eli inkompatibiliteetti (Inc) -ryhmiin sen perusteella pystyvätkö ne lisääntymään samassa bakteerisolussa yhtäaikaisesti muiden plasmidien kanssa (ks. yleiskatsaus Couturier ym., 1988). Kaksi plasmidia, joilla on samanlaiset replikaatio- ja jakautumistekijät, eivät pysty lisääntymään samassa solussa, sillä ne kilpailevat näistä toiminnoista keskenään. Kyseiset plasmidit kuuluvat tällöin samaan Inc-ryhmään. Luokittelun avulla tiettyjä plasmidityyppejä on pystytty yhdistämään erilaisiin antibioottiresistenssigeeneihin (Johnson ym., 2007b). Tällä hetkellä Enterobacteriaceae-

10 heimon bakteereilla tunnetaan 27 Inc-ryhmää. Suurimmat plasmidiperheet ovat HI2, HI1, I1-γ, X, L/M, N, FIA, FIB, FIC, W, Y, P, A/C, T, K ja B/O. Inc-tyypitystä varten on kehitetty PCR-menetelmä, jolla voidaan tunnistaa suurimpiin plasmidiperheisiin kuuluvat plasmidit (Carattoli ym., 2005). 1.2 Beetalaktaamiantibiootit 1.2.1 Yleistä beetalaktaamiantibiooteista Beetalaktaamit ovat yleisiä bakteeri-infektioiden hoitoon käytettäviä antibiootteja. Niiden rakenteelle on tyypillistä laktaamisidoksella muodostunut rengas. Yleisimpiin beetalaktaamiantibiootteihin kuuluvat penisilliinit, penisilliinin johdannaiset, kefalosporiinit, kefamysiinit, karbapeneemit, monobaktaamit ja monokarbaamit (ks. yleiskatsaus Essack 2001). Penisilliinit tehoavat hyvin erityisesti gram-positiivisiin bakteereihin. Penisilliinin johdannaiset, joita ovat muun muassa laajakirjoiset aminopenisilliinit, tehoavat sen sijaan kapeakirjoisia penisilliinejä paremmin gramnegatiivisiin bakteereihin. Kefalosporiinit jaotellaan eri sukupolviin sen mukaan, miten hyvin ne sietävät niitä hydrolysoivaa beetalaktamaasia tai milloin ne on löydetty (Koulu ja Tuomisto 2001). Kefalosporiineja on hyvin monenlaisia ja ne eroavat toisistaan erilaisten sivuketjujen tai rakenteen perusteella. Ensimmäisen polven kefalosporiinit eivät tehoa kovinkaan hyvin gram-negatiivisiin bakteereihin toisin kuin toisen, kolmannen ja neljännen polven kefalosporiinit. Karbapeneemeillä on kaikista laajin antimikrobinen spektri ja ne tehoavat useimpiin patogeenisiin bakteereihin (ks. yleiskatsaus Essack 2001). Monobaktaamit poikkeavat rakenteeltaan hieman muista beetalaktaameista ja ne tehoavat vain gram-negatiivisiin bakteereihin. Beetalaktaamiantibioottien vaikutus perustuu bakteerin soluseinän peptidoglykaanisynteesin estoon. Peptidoglykaanikerros ylläpitää solun muotoa ja suojaa bakteeria osmoottiselta paineelta. Beetalaktaamit vaikuttavat penisilliiniä sitovaan proteiiniin (PBP). PBP osallistuu peptidoklykaanisynteesiin linkittämällä soluseinän peptidiketjut yhteen. Beetalaktaami antibiootti sitoutuu PBP:n aktiiviseen kohtaan ja estää näin sen toiminnan ja peptidoglykaanisynteesin (Spratt 1994).

11 Beetalaktaameja käytetään yleisesti ihmisten lääkkeenä, mutta niitä on käytetty ja käytetään edelleen myös tuotantoeläinten hoidossa. Koska antibioottien käyttö luo bakteereille valintapaineen, resistentit kannat pääsevät helposti lisääntymään. Beetalaktaamiantibioottien käytön uskotaankin lisänneen näille antibiooteille resistenttien bakteerikantojen kasvua tuotantoeläimissä (EFSA 2011). Kefalosporiinien käyttö siipikarjanhoidossa on EU-maissa kiellettyä, mutta niitä käytetään jonkun verran nautojen, sikojen ja hevosten infektioiden hoitoon. Monissa Euroopan maissa eläinten hoitoon sallittuja beetalaktaamiantibiootteja ovat kapeakirjoiset penisilliinit sekä laajakirjoiset aminopenisilliinit (EFSA 2011). Kymmentä Euroopan maata koskevasta tutkimuksesta selviää että Suomessa, Ruotsissa ja Norjassa tuotantoeläinten hoidossa käytetyistä antibiooteista suurin osa kuuluu juuri beetalaktaamiantibiootteihin (Grave ym., 2010). Toisaalta monissa muissa Euroopan maissa antibioottien kokonaiskulutus on huomattavasti suurempaa kuin Suomessa. EU-maiden ulkopuolella antibioottien käyttö eläimillä on vaihtelevaa. Joissakin maissa antibioottien käytölle eläinten hoidossa ei ole lainkaan rajoituksia (Maron ym., 2013). 1.2.2 Beetalaktaamiresistenssi Bakteerit voivat olla luonnostaan resistenttejä eri antibiooteille. Esimerkiksi mykoplasmoilla ei ole peptidoglykaanista koostuvaa soluseinää, jolloin ne ovat resistenttejä kaikille beetalaktaamiantibiooteille (ks. yleiskatsaus Normark ja Normark 2002). Bakteereilla tunnetaan myös muita resistenssimekanismeja beetalaktaamiantibiootteja vastaan. Bakteerilla voi olla mutaatio PBP:tä koodittavassa geenissä tai muuten muuttunut muoto kyseisestä proteiinista, jolloin beetalaktaamien affiniteetti PBP:hen on pienentynyt (ks. yleiskatsaus Georgopapadakou 1993). Toinen resistenssiä aiheuttava syy voi olla soluseinän läpäisevyyden muutos, jolloin lääke ei pääse vaikuttamaan (ks. yleiskatsaus Nikaido 1989). Kolmas ja yleisin resistenssimekanismi gram-negatiivisilla bakteereilla on kuitenkin beealaktamaasientsyymien tuotto (ks. yleiskatsaus Poole 2004; ks. yleiskatsaus Smet ym., 2009). Beetalaktamaasit pystyvät pilkkomaan antibioottien beetalaktaamirenkaan, jolloin näiden antibioottien teho häviää.

12 1.3 ESBL ESBL-entsyymit antavat bakteerille vastustuskyvyn muun muassa penisilliineille, toisen, kolmannen ja neljännen polven kefalosporiineille sekä monobaktaameille (ks. yleiskatsaus Bradford 2001). Yleensä ESBL-entsyymit eivät kuitenkaan aiheuta vastustuskykyä karpabeneemeille tai kefamysiineille. ESBL-geenit ilmentyvät plasmidissa ja ovat yleisiä E. coli- ja Klebsiella pneumoniae -bakteereissa. ESBL-geenit kuuluvat yleisimmin TEM-, SHV- tai CTX-M-geeniperheisiin (ks. yleiskatsaus Paterson ja Bonomo 2005). Suurin osa TEM-ryhmän geeneistä tuottaa ESBLentsyymejä. TEM-1-, TEM-2- ja TEM-13-entsyymit hydrolysoivat kuitenkin vain penisilliinejä eikä niitä lasketa kuuluviksi ESBL-entsyymeihin. Jotkin TEM-ryhmän mutantit pystyvät hydrolysoimaan kolmannen polven kefalosporiinien lisäksi myös beetalaktamaasi-inhibiittoreita (Fiett ym., 2000). SHV-1-tyypin beetalaktamaasientsyymi on löydetty ensimmäisen kerran K. pneumoniae -bakteereista (ks. yleiskatsaus Gupta 2007). Tämä entsyymi antaa vastustuskyvyn vain laajakirjoisille penisilliineille. Vuonna 1983 K. pneumoniae -bakteerista löydettiin SHV-2 -tyypin beetalaktamaasi, joka hydrolysoi myös kefotaksiimia. CTX-M-ryhmän beetalaktamaasit ovat kaikki ESBLentsyymejä ja ryhmä on nimetty sen mukaan, että niillä on kyky hydrolysoida kefotaksiimia. CTX-M -ryhmän geenit ovat peräisin Kluyvera-suvun bakteerin kromosomista, josta geenit ovat insertiosekvenssien avulla hypänneet plasmidiin (ks. yleiskatsaus Cantón ja Coque 2006). CTX-M-ryhmän geenit ovat levinneet nopeasti luultavasti siksi, että geenit ilmentyvät plasmideissa joissa on useita resistenssi- ja virulenssigeenejä. CTX-M onkin tällä hetkellä yleisin ESBL-geeniperhe. OXA-ryhmän beetalaktamaasit eivät pääsääntöisesti ole ESBL-entsyymejä, koska ne eivät hydrolysoi kefalosporiineja. OXA-10, OXA-13 ja OXA-19 ovat kuitenkin poikkeuksia (Toleman ym., 2003). 1.4 AmpC AmpC-geenit voivat sijaita bakteerin kromosomissa tai plasmidissa. AmpC-entsyymit ovat aktiivisia penisilliinejä kohtaan, mutta vielä aktiivisemmin ne hydrolysoivat kefalosporiineja (ks. yleiskatsaus Jacoby 2009). Lisäksi AmpC-entsyymit hydrolysoivat kefamysiinejä ja monobaktaameja. AmpC-entsyymit inhiboituvat klavulaanihapolla. On

13 tavallista, että AmpC-plasmidit tuottavat lisäksi entsyymejä, jotka tuhoavat muihin antibioottiryhmiin kuuluvia antibiootteja kuten esimerkiksi kinoloneja (Rodrigues- Martinez 2003). AmpC-entsyymejä koodaavat geenit voivat sijaita bakteerien kromosomissa ja näin onkin monissa gram-negatiivisissa bakteereissa kuten Citrobacter, Serratia ja Enterobactersuvuissa (ks. yleiskatsaus Smet ym., 2009). AmpC-geeni indusoituu yleensä beetalaktaamiantibiooteista ja tuottaa AmpR-säätelytekijän säätelemänä beetalaktamaasia. Mutaatiot AmpD-repressorissa voivat puolestaan johtaa beetalaktamaasien ylituottoon (Schmidtke ym., 2006). E. coli -bakteerien AmpC-geenit eivät indusoidu, sillä E. coli - bakteereilta puuttuu AmpR-säätelytekijä (Peter-Getzlaff ym., 2011). Jos E. coli -bakteerilla on kromosomissaan AmpC-geeni, se ei yleensä ilmenny tai ilmentyy vain hyvin vähän (Jaurin ym., 1981). Plasmidivälitteiset AmpC-geenit ovat yleisiä E. coli- ja Klebsiella - bakteereissa. Kromosomaaliset AmpC-geenit ovat todennäköisesti karanneet kromosomista plasmideiksi insertiosekvenssien ja transposonien avulla (ks. yleiskatsaus Jacoby 2009). Plasmidien AmpC-geenit eivät yleensä ole indusoituvia, sillä niissä ei ole AmpR-säätelytekijää. AmpC-entsyymien ylituotto johtuukin luultavasti muutoksista tai mutaatioista geenin promoottorialueella (Reisbig ym., 2003). AmpC-beetalaktamaasit jaetaan viiteen ryhmään niiden sekvenssivertailujen perusteella (ks. yleiskatsaus Walther-Rasmusen ja Høiby 2002; ks. yleiskatsaus Poole 2004). Ensimmäiseen ryhmään kuuluu hyvin läheisesti sukua olevia beetalaktamaaseja. Näitä ovat CMY-2 7, LAT-1 4 ja BIL-1. C1-ryhmän geenien, uskotaan olevan peräisin C. freundii - bakteerin kromosomaalisesta AmpC-lokuksesta. Ryhmään C2 kuuluvat keskenään vähemmän samanlaiset CMY-1, CMY-8 11, MOX-1 2 ja FOX-1 6. Ryhmään C3 kuuluvat ACT-1 sekä MIR-1 ja ryhmään C4 DHA-1 sekä DHA-2. Ryhmään C5 kuuluu vain yksi beetalaktamaasi ACC-1, jota on löydetty K.pneumoniae-, S. enterica- sekä E. coli -bakteereista. Eri geeniperheiden tunnistamista varten on kehitetty multiplex-pcrmenetelmä (Perez-Perez ja Hanson 2002). PCR-mentelmän avulla geeniperheet voidaan jakaa kuuteen ryhmään, jossa FOX on eroteltu omaksi ryhmäkseen.

14 1.5 ESBL- ja AmpC-geenien yleisyys tuotantoeläimissä, ruoassa ja seuraeläimissä ESBL/AmpC-entsyymejä tuottavia bakteereja on löydetty sairaalahoidossa olevilta potilailta jo 1980-luvulta alkaen. Ensimmäinen lemmikkieläimestä löydetty ESBLentsyymejä tuottava E. coli -bakteeri löydettiin toistuvista virtsatulehduksista kärsivältä koiralta vuonna 1998 (Teshager ym., 2000). ESBL/AmpC-geenien yleisyyttä tuotantoeläimissä ja ruoassa on alettu kartoittaa vasta 2000-luvulta lähtien. Tiedot eri maiden välillä eivät ole kuitenkaan suoraan vertailtavissa, sillä tilastojen keräämiseen käytetyt menetelmät ovat vaihdelleet. ESBL/AmpC-positiivisten bakteerikantojen määrä on kuitenkin selvästi kasvanut, vaikka antibioottien käyttöä on rajoitettu monissa maissa. Ensimmäiset tuotantoeläimistä esiintyvät ESBL/AmpC-geenit löydettiin terveistä kanoista eristetyistä E. coli -bakteereista vuosina 2000 2001 Espanjassa suoritetussa antibioottiresistenssin valvontatutkimuksessa (Brinas ym., 2003). Ulostenäytteiden E. coli - bakteereista 1,6 % oli ESBL-positiivisia ja 0,8 % AmpC-positiivisia. Tällä hetkellä ESBL/AmpC-entsyymejä on löydetty kasvavassa määrin ympäri maailmaa tuotantoeläimistä ja ruoasta. Erityisen yleisiä nämä entsyymit ovat siipikarjassa ja siipikarjatuotteissa, mutta myös sioista ja naudoista on löydetty ESBL/AmpC-entyymejä tuottavia bakteereja (EFSA 2011). ESBL-geenejä on myös löydetty siipikarjan E. coli - bakteereista EU-maiden ulkopuolella muun muassa Kiinasta, Japanista, Yhdysvalloista sekä Tunisiasta. Euroopasta löydetyt ESBL-geenit ovat kuuluneet yleisimpiin CTX-M-, SHV- ja TEM-geeniperheisiin (ks. yleiskatsaus Cantón ym., 2008). AmpC-geenejä on löydetty myös maailmanlaajuisesti siipikarjasta ja siipikarjatuotteista eristetyistä E. coli - bakteereista. Selvästi yleisin AmpC-geeni on CMY-2 (EFSA 2011). Hollannissa vuonna 2010 tehdystä tutkimuksesta selvisi, että jopa 94 % tutkituista siipikarjanlihan E. coli - bakteereista oli ESBL- tai AmpC-positiivisia (Dierikx ym., 2010). Ruotsissa vuonna 2012 tutkitusta broilerinlihasta löydettiin E. coli -bakteereja, joista 44 % tuotti AmpC/ESBLentsyymejä (Börjesson ym., 2013b). Yleisin geeni oli CMY-2. Tanskassa vuonna 2011 tutkituista broilerinlihanäytteistä niin ikään 44 % sisälsi ESBL/AmpC-entsyymejä tuottavia E. coli -bakteereja (Agerso ym., 2012). Suomessa vuonna 2010 2011 tutkituista broilerinlihasta eristetyistä E. coli -kannoista löytyi myös AmpC-positiivisia kantoja ja löydösten määrä kasvoi vuonna 2012 (Evira ja THL, julkaisematon). ESBL positiivisia E.

15 coli -bakteereja ei löydetty vuosina 2010 2011 lainkaan, mutta vuotta myöhemmin niitä kuitenkin löydettiin pienestä osasta näytteitä. Lemmikkieläinten ESBL/AmpC taakkaa on tutkittu selvästi vähemmän, mutta myös lemmikit voivat toimia ESBL/AmpC-geenien varastoina (ks. yleiskatsaus Guardabassi ym., 2004). Koirista, kissoista ja hevosista otetuista ulostenäytteistä on löytynyt ESBL/AmpC-entsyymejä tuottavia Enterobacteriaceae-heimon bakteereja, erityisesti E. coli -bakteereja (Gibson ym., 2010). Hollannissa tehdyssä tutkimuksessa sairaiden koirien ja kissojen ulostenäytteistä 25 55 % sisälsi ESBL/AmpC-positiivisia bakteereja (Hordijk ym., 2013). Myös Suomesta on löydetty ESBL/AmpC-positiivisia E. coli -bakteereja koirien ulosteista (Evira ja THL, julkaisematon). 1.6 Siipikarjassa ja ihmisissä esiintyvien ESBL- ja AmpC-geenien, plasmidien ja E. coli -kantojen yhtäläisyydet Siipikarja ja siipikarjatuotteet voivat toimia ESBL/AmpC-geenien varastoina ja edesauttaa geenien siirtymistä ihmisiin. Geenit voivat siirtyä suoraan ruoan välityksellä tai siipikarjan kasvatusympäristöstä. Yhdysvalloissa Minnesotassa ja Wisconsinissa vuosina 2002 2004 tehdyssä tutkimuksessa havaittiin, että ihmisistä eristetyissä ESBL-entsyymejä tuottavissa E. coli -näytteissä oli enemmän yhtäläisyyksiä siipikarjasta eristettyjen ESBL-entsyymejä tuottavien E. coli -kantojen kanssa kuin ihmisistä eristettyjen herkkien E. coli -kantojen kanssa (Johnson ym., 2007a). Tästä pääteltiin, että ihmisissä esiintyvät resistenssibakteerit ovat mahdollisesti peräisin siipikarjasta. Myös Hollannissa on tehty useita tutkimuksia siipikarjan ja ihmisten ESBL-geenien, plasmidien ja E. coli -kantojen yhtäläisyyksistä. Leverstein-van Hall ym. (2011) löysivät ihmisten ja siipikarjanliha näytteistä ESBLentsyymejä tuottavia E. coli -bakteereja, jotka kuuluivat samaan sekvenssityyppiin, sisälsivät samanlaisen resistenssiplasmidin ja ESBL-geenin. Yhteiset bakteerikannat kuuluivat sekvenssityyppeihin ST10, ST117 ja ST58. Suurin osa plasmideista kuului IncI1- tyyppiin ja ne sisälsivät CTX-M-1- tai TEM-52 -geenejä, jotka ovat hyvin yleisiä sekä ihmisissä että siipikarjassa. Tutkimustulokset osoittivat, että on hyvin todennäköistä, että ESBL-geenit/plasmidit ovat voineet siirtyneet ruoan välityksellä siipikarjanlihasta ihmiseen. Myös Kluytmans ym. (2013) osoittivat, että broilerinlihasta ja ihmisistä löytyi samoja ESBL-entsyymejä tuottavia bakteerikantoja. Lisäksi myös bakteerien

16 virulenssitekijöissä oli yhtäläisyyksiä. Ihmisille erittäin virulentin multiresistentin ST131- E. coli -kloonin on osoitettu levinneen maailmanlaajuisesti niin ihmisiin kuin eläimiin. Ihmisistä, siipikarjasta ja lemmikkieläimistä eristetyiltä ST131-klooniin kuuluvilta kannoilta on löydetty myös huomattavia yhtäläisyyksiä resistenssiominaisuuksien suhteen (ks. yleiskatsaus Platell ym., 2011). Ruoan lisäksi ESBL/AmpC-entsyymejä tuottavat bakteerit voivat siirtyä ihmiseen myös siipikarjatuotannon ympäristöstä. Tätä hypoteesia tukee Hollannissa tehty tutkimus, jonka mukaan siipikarjatilalla työskentelevillä on selvästi suurempi riski olla ESBL/AmpC-kantaja kuin muulla väestöllä keskimäärin (Dierikx ym., 2013). 1.7 Broilerinkasvatus Suomessa Broilerinkasvatus on Suomessa hyvin valvottua ja tapahtuu sopimustiloilla, jotka ovat sitoutuneet noudattamaan hyviä tuotantotapoja (Suomen Siipikarjaliitto ry ja Suomen Broileryhdistys ry). Isovanhempaispolven linnut tuodaan Suomeen untuvikkoina Skotlannista ja kasvatetaan karanteenissa tautiriskin pienentämiseksi. Isovanhempaispolven kasvatuksen jälkeen niiden munista haudotaan ja kasvatetaan tuotantopolven emot. Tuotantopolven emojen munista puolestaan haudotaan ruoaksi tarkoitetut tuotantopolven broilerit. Tuotantopolven broilerit kasvatetaan sopimustiloilla, jonka jälkeen broilerit teurastetaan ja toimitetaan kauppoihin. Tautien leviämistä broilerintuotantoon pyritään ehkäisemään hyvän hygienian ja oikeiden kasvatusolosuhteiden avulla. Suomessa on käytössä all-in all-out -kasvatusmenetelmä, jossa kaikki tuotantopolven untuvikot tuodaan kasvatustilalle samanaikaisesti ja lähetetään teurastukseen myös yhtä aikaa (Suomen Siipikarjaliitto ry ja Suomen Broileryhdistys ry). Kasvatustilat puhdistetaan hyvin ennen uutta erää. Suomalaiset broilerit ovat varsin terveitä, mutta joskus infektioiden hoitoon joudutaan käyttämään antibiootteja. Tällöin koko parvi täytyy lääkitä. Eniten käytetyt mikrobilääkkeet broilerin hoidossa ovat V- penisilliini ja aminopenisilliini amoksisilliini (ETT ry). Niitä käytetään broilereilla yleisimmin kuolioisen suolistotulehduksen sekä nivel- ja jännetupentulehduksen hoitoon. ETT ry:n vuosina 2007 2012 tekemän raportin mukaan 0 17,1 % broileriparvista jouduttiin lääkitsemään antibiootilla. Vuosina 2010 2012 broilerintuotantopolven lintuja ei

17 tarvinnut lääkitä lainkaan. Antibioottien käyttö broilerintuotannossa Suomessa on siis hyvin vähäistä ja perustuu aina diagnosoitujen infektioiden hoitoon. 1.8 Multilokus-sekvenssityypitys-menetelmä bakteerien ja plasmidien tutkimisessa Antibioottiresistenssigeenit voivat levittäytyä bakteeripopulaatiossa siirtymällä vertikaalisesti bakteerisukupolvelta toiselle tai horisontaalisesti resistenssiplasmidien välityksellä. Bakteerit puolestaan kulkeutuvat ihmisten ja eläinten mukana kaikkialle, minne ne liikkuvat ja voivat levittävät resistenssiä edelleen. Bakteerien ja plasmidien alkuperää sekä levittäytymistä voidaan tutkia multilokus-sekvvenssityypitys (MLST)- menetelmän avulla. MLST-menetelmä sopii hyvin epidemiologisesti kaukaisten bakteerikantojen geneettisen sukulaisuuden tutkimiseen. MLST-tyypityksessä tutkitaan bakteerin koko genomia 5 8 konservoituneen ylläpitogeenin suhteen (Maiden ym., 1998). Geeneistä monistetaan PCR:n avulla tavallisesti noin 400 500 bp kokoinen DNA-pätkä, joka sekvensoidaan. Sekvensoinnin jälkeen jokaisen geenin alleelivariantti numeroidaan sekvenssitietokannan mukaan ja näiden alleelivarianttien yhdistelmä tuottaa tietyn sekvenssityypin (ST). MLST:n avulla voidaan verrata saman lajin bakteerikantoja eri maiden ja ajanjaksojen välillä. MLST on suhteellisen nopea toteuttaa ja se on myös helposti toistettavissa. MLST:tä voidaan käyttää muun muassa antibioottiresistenttien bakteerien vertailussa sekä virulenssigeenien ja genotyyppien yhteyden selvittämisessä. (ks. yleiskatsaus Urwin ja Maiden 2003). MLST:n avulla voidaan myös selvittää patogeenisten bakteerien epidemiologiaa, evoluutiota ja populaatiobiologiaa. Tällä hetkellä MLST-menetelmä on saatavilla monelle eri bakteerilajille ja eri lajien sekvenssityypit sekä alleeliprofiilit on helposti saatavissa Internetissä olevista tietokannoista. Plasmideja voidaan tyypittää PCR:n avulla eri Inc-ryhmiin, kuten aiemmin on mainittu. IncI1-, IncF-, IncHI-, IncH2- ja IncN-ryhmien plasmideja voidaan edelleen karakterisoida plasmidien multilokus-sekvenssityypitys (pmlst) menetelmällä (pubmlst). pmlsttyypityksen periaate on samanlainen kuin MLST-tyypityksen, mutta tutkimuksen kohteena ovat plasmidit. Tämän varsin uuden menetelmän avulla voidaan analysoida plasmidien sukulaisuussuhteita ja epidemiologiaa eri bakteerilajien välillä sekä myös eri lähteistä tai

18 alueilta olevien bakteerien välillä. pmlst:tä varten valitut geenit ovat hyvin konservoituneita ylläpitogeenejä, mutta niissä on kuitenkin riittävästi eroavaisuuksia tyypitystä varten (García-Fernández ym., 2008). Sekvenssityyppejä voidaan vertailla eri laboratorioiden, eri lajien ja eri lähteiden välillä. Plasmideja, joille ei ole kehitelty pmlst menetelmää, voidaan tyypittää restriktioentsyymianalyysin avulla. Restriktioentsyymianalyysissä eristetyt plasmidit katkaistaan tietyillä restriktioentsyymeillä ja ajetaan agaroosielektroforeesissa (García-Fernández ym., 2009). Restriktioprofiileja vertailemalla voidaan tehdä päätelmiä plasmidien samankaltaisuudesta.

19 2 Tutkimuksen tavoitteet ESBL- ja AmpC-entsyymejä tuottavat bakteerit tarttuvat ihmisten välillä erityisesti sairaalaympäristössä. Näitä bakteereja on löydetty kuitenkin myös tuotantoeläimistä ja ruoasta monista maista. Koska beetalaktamaasigeenit ilmenevät usein plasmideissa, ne voivat levitä nopeasti ja tehokkaasti. Plasmidien välityksellä resistenssigeenejä voi siirtyä ihmisille harmittomista bakteereista myös patogeenisiin bakteereihin. Erityisesti kolmannen polven kefalosporiineille resistenttien E. coli -bakteerien määrä on kasvanut huomattavasti suomalaisessa broilerintuotantoketjussa viime vuosina (Evira ja THL, julkaisematon). Resistenttiys johtuu plasmidivälitteisestä AmpC-geenistä, joka tuottaa kefalosporiinia hajottavaa beetalaktamaasia. Plasmidivälitteistä AmpC-entsyymiä tuottavia E. coli -bakteereja on löydetty myös potilaskoirien ulosteesta. Tämän Pro gradu -tutkielman tarkoituksena on tutkia pmlst:n ja restriktioentsyymianalyysin avulla kuinka samanlaisia, broilerintuotantoketjusta, broilerinlihasta ja koirista, eristettyjen AmpC-positiivisten E. coli -bakteerien konjugatiiviset resistenssiplasmidit ovat. Lisäksi tarkoituksena on tutkia AmpCpositiivisten bakteerien koko genomia MLST-tyypityksen avulla ja selvittää esiintyykö broilerien E. coli -bakteereissa sellaisia MLST-tyyppejä, jotka on yhdistetty ihmisille suoliston ulkopuolisia infektioita aiheuttaviin (ExPEC)-bakteereihin. Resistenssiplasmidien ja bakteerien tutkiminen on tärkeää, jotta saadaan selville, mistä resistenssigeenit ovat peräisin ja miten ne leviävät.

20 3 Materiaalit ja menetelmät 3.1 E. coli -kannat Siipikarjan E. coli -bakteereja oli eristetty vuosien 2010 2012 aikana Eviran bakteriologian tutkimusyksikössä Kuopiossa. Kantoja oli eristetty terveiden broilerien isovanhempaispolven sivelynäytteistä ja aluspapereista, broileriemokasvattamoiden- ja tuotantopolvien kasvattamoiden ulostenäytteistä sekä broilerin vähittäismyyntilihasta. Eristetyistä näytteistä ei ollut seurattu systemaattisesti tietyn isovanhempaiserän, emojen, tuotantopolven ja niistä saadun lihan E. coli -kantoja. Koirien kannat oli eristetty vuosina 2010 2011 Helsingin yliopiston Eläinlääketieteellisen tiedekunnan kliinisen mikrobiologian laboratoriossa ulostenäytteistä. Ulostenäytteitä oli saatu sekä terveistä että potilaskoirista. Tässä työssä oli mukana sellaisia kantoja, jotka oli aikaisemmin todettu AmpC positiivisiksi. Yhteensä tutkittavia E. coli -kantoja oli 54, joista 9 oli eristetty isovanhempaispolvesta, 8 emopolvesta, 18 tuotantopolvesta, 9 vähittäismyyntilihasta ja 11 koirista. Kantojen tarkemmat tiedot löytyvät Taulukosta 16. Näytteistä oli tutkittu aiemmin E. coli -bakteerien fylogeniaryhmiä ja virulenssitekijöitä. Broilerintuotannon eri vaiheiden ja broilerinlihan AmpC-positiivisista E. coli -bakteereista oli lisäksi tutkittu plasmidien kokoa ja resistenssigeenien sijaintia sekä määritetty plasmidien Inc-tyyppejä. 3.2 Konjugaatiokoe Konjugaatiokokeen avulla pyrittiin saamaan aikaan kantoja, joissa on vain yhteen plasmidityyppiin kuuluvia plasmideja jatkotutkimuksia varten. Samalla tutkittiin, ovatko resistenssiplasmidit ylipäätänsä konjugoituvia. Tutkija Nella Vähänikkilä toteutti osan konjugaatiokokeista. Konjugaatiokokeessa vastaanottajana käytettiin E. coli -kantaa DA11782. AmpC-positiivisista luovuttaja E. coli -kannoista tehtiin puhdasviljelmä Tryptic Soy-Agar (TSA)-maljoille, joissa oli kefotaksiimia (2 mg/l). Vastaanottaja E. coli - kannasta tehtiin puhdasviljelmä TSA-maljoille, joissa oli rifampisiinia (100 mg/l) ja streptomysiiniä (250 mg/l). Maljoja pidettiin yön yli +37 C:ssa. Seuraavana päivänä luovuttajamaljoilta siirrettiin yksi pesäke 10 ml:aan Brain Heart Infusion (BHI)-lientä, jossa oli kefotaksiimia (2 mg/l). Vastaanottaja maljalta siirrettiin yksi pesäke 10 ml:aan

21 BHI-lientä jossa rifampisiinia (100 mg/l) ja streptomysiiniä (250 mg/l). Kasvatuksia pidettiin + 37 C:ssa yön yli. Kolmantena päivänä kasvatukset laimennettiin 1:50 ja niitä pidettiin ravistelijassa +37 C:ssa 3 tuntia. Liemikasvatuksia sentrifugoitiin 4000 kierrosta minuutissa 5 minuutin ajan, jonka jälkeen solut pestiin kaksi kertaa 5 ml:lla 1xPBS:ää. Tämän jälkeen bakteerisolut suspensoitiin BHI-liemeen (ei antibiootteja), niin että A 620 1. Luovuttaja ja vastaanottaja yhdistettiin (400 µl vastaanottaja ja 200 µl luovuttaja) ja putkiin lisättiin 2 ml BHI-lientä. Putkia pidettiin ravistelijassa + 37 C:ssa noin tunnin ajan. Liemikasvatukset sekoitettiin ja tilavuus täydennettiin BHI-liemellä 6 ml:aan. Liemikasvatuksista lanattiin 100 µl TSA-maljoille, joissa oli kefotaksmiinia (2 mg/l), rifampisiinia (100 mg/l) ja streptomysiiniä (250 mg/l). Maljoja pidettiin + 37 C:ssa yön yli. Seuraavana päivänä tarkastettiin, kasvoiko maljoilla pesäkkeitä. Maljoilla voi kasvaa ainoastaan transkonjugantteja bakteereja, jotka ovat konjugoineet resistenssiplasmidin vastaanottajalle. Konjugoituneet bakteerit säilytettiin -72 C:ssa. 3.3 CIT-PCR CIT-PCR:n avulla varmistettiin, että kaikki transkonjugantit bakteerit sisältävät CITgeeniperheeseen eli ryhmään C1 kuuluvia geenejä. PCR-reaktioita varten transkonjugantit E. coli -kannat viljeltiin TSA-maljoille, joissa oli kefotaksiimia (2 mg/l), rifampisiinia (100 mg/l), ja streptomysiiniä (250 mg/l). Maljoja pidettiin + 37 ºC:ssa yön yli. Bakteereista tehtiin noin 1,5 McFarlandin vahvuinen bakteerivesisuspensio, jota käytettiin PCRreaktioissa templaattina. PCR-reaktioissa käytetyt alukkeet on lueteltu Taulukossa 1 (Perez-Perez ja Hanson 2002). PCR-reaktiot ajettiin PTC-200-laitteella (MJ Research). Reaktioissa positiivikontrollina toimi CIT-positiiviseksi todettu E. coli -kanta 2707/1 ja negatiivikontrollina toimi steriili vesi. Pipetointikaavio on esitetty Taulukossa 2 ja PCRohjelma Taulukossa 3. Taulukko 1. CIT-PCR-alukkeet Alukkeet 5-3 emäsjärjestys PCR- tuote CIT-MF TGGCCAGAACTGACAGGCAAA 462 bp CIT-MR TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC

22 Taulukko 2. CIT- PCR:n pipetointikaavio, 1 x reaktio reagenssi µl bakteerivesisuspensio 1 10 x puskuri (DyNAzyme, sis. 1,5 mm MgCl2) 2,5 dntp (10 mm, Thermo Scientific) 0,5 alukkeet (25 pmol/µl, Oligomer) 2 x 0,6 DNA-polymeraasi (Dynazyme 2 U/µl) 0,5 H 2 O (Gibco) 19,3 Taulukko 3. CIT-PCR-ohjelma 3 min 94º C 30 s 94 ºC 30 s 64 ºC 30 sykliä 1 min 72 ºC 7 min 72 ºC PCR-ajon jälkeen tuotteet ajettiin agaroosigeelielektroforeesissa 2 %:ssa geelissä, 140 V jännitteellä 60 minuutin ajan. Molekyylikokomarkkereina toimi Generuler TM 100 bp DNA ladder Plus (Fermentas). Elektroforeesilaitteistona käytettiin GNA 200 (Pharmacia LKB) ja Cleaver Scientific Ltd ajokammioita sekä EPS 600 (Pharmacia LKB) ja CS-300 (Cleaver Scientific Ltd) virtalähteitä. Geeli kuvattiin UV-valossa. Kuvauslaitteisto oli AlphaDigidoc TM (Alpha Innotech). Samoja elektroforeesilaitteistoja, ajokammiota ja kuvauslaitteistoa käytettiin myös muissa agaroosigeelielektroforeesia vaativissa tutkimuksissa tässä työssä. 3.4 Inc-tyypitys-PCR Inc-tyypitys PCR:n avulla haluttiin saada selville konjugaatiossa vastaanottajakantaan siirtyneiden resistenssiplasmidien Inc-tyypit. Tässä työssä määritettiin E. coli -bakteerien plasmideissa yleisesti esiintyviä Inc-tyyppejä FIA, FIB, FIC, I1, N, A/C, B/O K ja X. PCRreaktioita varten transkonjugantteja E. coli -bakteereja kasvatettiin TSA-maljoilla, joissa

23 oli kefotaksiimia (2 mg/l), rifampisiinia (100 mg/l) ja streptomysiiniä (250 mg/l) + 37 ºC:ssa yön yli. Bakteereista tehtiin noin 1,5 McFarlandin vahvuinen suspensio 500 µl:aan steriiliä vettä. Näytteet tutkittiin kolmella eri PCR-reaktiolla. Ensimmäisessä reaktiossa (FIB) alukkeina toimi FIB. Toisessa reaktiossa (multiplex 1) alukkeina toimivat B/O, A/C ja N ja kolmannessa reaktiossa (multiplex 2) alukkeina toimivat I1, FIA, FIC, X ja K/B. Positiivikontrolleina käytettiin PBRT-reagenssipaketin (Diatheva) kontrolleja laimennettuna 1:5. FIB:n positiivikontrollina käytettiin PBRT-reagenssipaketin kontrollia M3. Multiplex 1-PCR -reaktiossa N:n ja B/O:n kontrolleina toimi PBRT-reagenssipaketin kontrolli M2 ja A/C:n kontrollina PBRT-reagenssipaketin kontrolli M5. Multiplex 2-PCRreaktiossa I1:n positiivikontrollina toimi PBRT-reagenssipaketin kontrolli M l, FIA:n kontrollina M3, FIC:n kontrollina M4 sekä X ja K/B kontrolleina M7. Negatiivikontrollina käytettiin steriiliä vettä. PCR-reaktiot ajettiin TC-Plus-laitteella (Techne). Kaikkien PCRreaktioiden alukkeet on esitetty taulukossa 4 (Carattoli ym., 2005). PCR-reaktioiden pipetointikaaviot on esitetty Taulukoissa 5, 6 ja 7. PCR-ohjelmat löytyvät Taulukoista 8 ja 9. Taulukko 4. Inc-tyypitys-PCR:ssä käytetyt alukkeet Alukkeet 5-3 emäsjärjestys PCR- tuote FIB F: GGAGTTCTGACACACGATTTTCTG 702(683) ep FIB R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT A/C F: GAGAACCAAAGACAAAGACCTGGA 465 ep A/C R: ACGACAAACCTGAATTGCCTCCTT N F: GTCTAACGAGCTTACCGAAG 559 ep N R: GTTTCAACTCTGCCAAGTTC I1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA 139 ep I1 R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT FIA F: CCATGCTGGTTCTAGAGAAGGTG 462 ep FIA R: GTATATCCTTACTGGCTTCCGCAG FIC F: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGG 262 ep FIC R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT X F: X R: AACCTTAGAGGCTATTTAAGTTGCTGAT TGAGAGTCAATTTTTATCTCATGTTTTAGC 376 ep

24 Alukkeet 5-3 emäsjärjestys PCR- tuote K/B F: GCGGTCCGGAAAGCCAGAAAAC 160 ep K/B R: TCTTTCACGAGCCCGCCAAA Taulukko 5. FIB-PCR:n pipetointikaavio, 1 x reaktio reagenssi µl bakteerivesisuspensio 1 10 x puskuri (1,5 mm MgCl2 Qiagen) 2,5 dntp (10 mm, Thermo Scientific) 0,5 alukkeet (FIB) (25 pmol/µl, Oligomer) 2 x 0,6 DNA-polymeraasi (5 U/µl, Hot Star Taq, Qiagen) 0,2 H 2 O (Gibco) 19,6 Taulukko 6. Multiplex 1 PCR:n pipetointikaavio, 1 x reaktio reagenssi µl bakteerivesisuspensio 1 10 x puskuri (1,5 mm MgCl2 Qiagen) 2,5 dntp (10 mm, Thermo Scientific) 0,5 alukkeet (B/O, A/C ja N) (25 pmol/µl, Oligomer) 6 x 0,6 DNA-polymeraasi (5 U/µl, Hot Star Taq, Qiagen) 0,2 H 2 O (Gibco) 17,2 Taulukko 7. Multiplex 2 PCR:n pipetointikaavio, 1 x reaktio reagenssi µl bakteerivesisuspensio 1 10 x puskuri (10x, 1,5 mm MgCl 2, DyNAzyme) 2,5 dntp (10 mm, Thermo Scientific) 0,5 alukkeet (I1, FIA, FIC, X ja K/B) (25 pmol/µl, Oligomer) 10 x 0,6 DNA-polymeraasi (2 U/µl, DyNazyme) 0,2 H 2 O (Gibco) 14,8

25 Taulukko 8. FIB-PCR- ja multiplex 1 PCR-ohjelma 15 min 95º C 1 min 95 ºC 1 min 53 ºC 30 sykliä 1 min 15 s 72 ºC 5 min 72 ºC Taulukko 9. Multiplex 2 PCR-ohjelma 5 min 95º C 1 min 95 ºC 1 min 60 ºC 30 sykliä 1 min 15 s 72 ºC 5 min 72 ºC PCR-ajon jälkeen PCR-tuotteet pipetoitiin 2 %:lle agaroosigeelille. Molekyylikokomarkkereina käytettiin Generuler TM 100 bp DNA ladder Plus (Fermentas). PCR tuotteet eroteltiin agaroosigeelielektroforeesissa 140 V jännitteellä 60 minuutin ajan. Tämän jälkeen geeli kuvattiin UV-valossa. 3.5 Plasmidien eristys transkonjuganteista Plasmidit eristettiin sellaisista bakteerikannoista, joissa oli vain yhteen Inc-tyyppiin kuuluvia resistenssiplasmideja. Inc-tyypitys-PCR:n mukaan nämä kannat sisälsivät, joko IncI1-tyypin tai IncK-tyypin plasmideja. Inc-I1-plasmidin sisältäviä kantoja oli yhteensä 24 ja IncK-tyyppin plasmidin sisältäviä kantoja 10. Eristykset tehtiin käyttäen Qiagenin plasmid midi kit -reagenssipakettia. Plasmidieristystä varten transkonjuganteista tehtiin puhdasviljelmä TSA-maljoille, joissa oli kefotaksiimia (2 mg/l), rifampisiinia (100 mg/l) ja streptomysiiniä (250 mg/l). Maljoja pidettiin + 37 C:ssa yön yli. Tämän jälkeen maljalta poimittiin yksi pesäke putkeen, jossa oli 5 ml Luria Bertani (LB)-lientä ja kefotaksiimia (2 mg/l), rifampisiinia (100 mg/l) sekä streptomysiiniä (250 mg/l). Putkia pidettiin ravistelijassa + 37 C:ssa noin 8 tuntia. Tämän jälkeen kasvatusliuos laimennettiin 1:500

26 90 ml:aan LB-lientä. Putkia pidettiin ravistelijassa +37 C:ssa yön yli. Bakteerisolut sentrifugoitiin pohjaan 4000 kierrosta minuutissa + 4 C:ssa 30 minuutin ajan. Pelletti käsiteltiin reagenssipaketin ohjeen mukaisesti. Lopuksi plasmidi-dna liuotettiin TEpuskuriin. Tämän jälkeen plasmidi-dna eroteltiin agaroosigeelielektroforeesissa 0,8 %:ssa geelissä 70 V jännitteellä 3 tunnin ajan. Geeli kuvattiin UV-valossa. Molekyylikokomarkkerina käytettiin Lambda/Hind III - Phi-X174/Hae III (Thermo Scientific). DNA-pitoisuus mitattiin Qubit-fluorometrillä. 3.6 Plasmidien eristys villin tyypin bakteerikannoista Transkonjuganttien plasmidieristyksessä havaittiin, että monet bakteerikannat sisälsivät useita erikokoisia plasmideja. Haluttiin selvittää, olivatko nämä plasmidit peräisin villin tyypin luovuttajakannoista, joten myös niiden plasmidit eristettiin. DNA:ta ei tarvittu suuria määriä, joten työmäärän vähentämiseksi eristys tehtiin Agencourt COSMCPrepillä (Beckman Coulter), jonka erottelukyky perustuu magneettikuuliin. Villin tyypin bakteerikannoista tehtiin puhdasviljelmä TSA-maljoille, joissa kefotaksiimia (2 mg/l) ja maljoja pidettiin + 37 C:ssa yön yli. Maljoilta siirrostettiin yksi pesäke 5 ml:aan LBlientä, jossa kefotaksiimia (2 mg/l) ja kasvatuksia pidettiin ravistelijassa + 37 C:ssa yön yli. Eristys tehtiin reagenssipaketin ohjeen mukaisesti 1,5 ml liemikasvatuksista. Sekä transkonjuganttien että villikantojen plasmidi-dna ajettiin rinnakkain agaroosigeelielektroforeesissa kuten aiemmin. 3.7 pmlst IncI1-tyypin plasmideille on kehitetty pmlst-pcr-menetelmä (García-Fernández ym., 2008). PCR-menetelmän avulla monistetaan eri reaktioissa viittä ylläpitogeeniä, joiden DNA sekvensoidaan. IncI1-pMLST-menetelmällä monistettavat geenit ovat repi, arda, trba, sogs ja pill. RepI on RNA-antisense, joka säätelee IncI1-plasmidin replikaatiosysteemiä. ArdA koodittaa tyypin I restriktio-modifikaatio entsyymiä, jolla on tärkeä merkitys bakteerin puolustautuessa vieraalta DNA:lta. TrbA on puolestaan tärkeä plasmidin ylläpitogeeni. SogS koodaa primaasia, joka rakentaa RNA-alukkeet plasmidin DNA:n replikaation aloituskohtiin ja on siten tärkeä replikaatiossa. PilL koodittaa tyypin IV-piluksen ulkokalvon proteiinia.

27 PCR-reaktioissa templaattina käytettiin aiemmin eristettyä plasmidi DNA:ta. PCR-reaktiot ajettiin TC-plus-laitteella (Techne). Negatiivikontrollina toimi steriili vesi. Käytetyt alukkeet löytyvät Taulukosta 10 (García-Fernández ym., 2008). PCR-reaktioseoksen valmistusohjeet on esitetty Taulukossa 11 ja PCR-ohjelma Taulukossa 12. Taulukko 10. pmlst-pcr-alukkeet Alukkeet 5-3 emäsjärjestys PCR-tuote rep1 F: CGAAAGCCGGACGGCAGAA 142 ep rep1 R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT arda F: ATGTCTGTTGTTGCACCTGC 501 ep arda R: TCACCGACGGAACACATGACC trba F: CGACAAATGCTTCCGGGGT 507 ep trba R: TCTTACAATCGACAGCCTGT sogs F: TTCCGGGGCGTAGACAATACT 291 ep sogs R: AACAGTGATATGCCGTCGC pill F: CCATATGACCATCCAGTGCG 316 ep pill R: AACCACTATCTCGCCAGCAG Taulukko 11. pmlst-pcr:n pipetointikaavio, 1 x reaktio. Jokaiselle alukeparille tehtiin oma reaktioseos. reagenssi µl 50 ng/µl eristettyä plasmidi DNA:ta 1 2x Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Thermo Scientific) 25 alukkeet repi, arda, trba, sogs tai pill(20 pmol/µl, Oligomer) 2 x 1 H 2 O (Gibco) 22 Taulukko 12. pmlst-pcr-ohjelma 2 min 98º C 45 s 95 ºC 45 s 60 ºC 30 sykliä 1 min 15 s 72 ºC 5 min 72 ºC