Kokogenomisekvensointi elintarvikevälitteisten tautibakteerien seurannassa ja epidemianselvityksissä Anniina Jaakkonen ja Maria Simola, Evira Ajankohtaista laboratoriorintamalla 27.9.2018
Kokogenomisekvensointi (WGS) Bakteerin (lähes) koko perimän DNA-emäsjärjestyksen määrittäminen syväsekvensointitekniikalla High-throughput sequencing (HTS) = Next-generation sequencing (NGS) Sekvenssistä saadaan tietoa bakteerikantojen sukulaisuussuhteista ja geneettisistä ominaisuuksista Taudinaiheuttamiseen (virulenssiin) ja antibioottiresistenssiin liittyvät geenit, serotyyppi, jne. 2
Sisältö Kokogenomisekvensoinnin käyttöönotto Evirassa Näytteen valmistus ja sekvensointi Datan analysointi Case: Listeria monocytogenes pakastevihanneksissa 3
WGS:n käyttöönotto Evirassa
Bakteerikantojen tyypittäminen ennen ja nyt Puhdasviljelmä DNA-eristys & PCR Agglutinaatio Herkkyysmääritykset Pulssikenttäelektroforeesi Virulenssi Serotyyppi Resistenssi Genotyyppi & kantavertailu WGS 1. DNA-eristys 2. Sekvensointikirjastot 3. Sekvensointi 4. Datan analysointi (bioinformatiikka) Ennen Nyt 5
WGS:n käyttöönotto Evirassa Illumina MiSeq sekvensointilaite hankittu syksyllä 2017 Laboratorioprotokollien verifiointi jatkuu Osallistuminen data-analyysimenetelmien ja -välineiden kehitykseen yhteiseurooppalaisessa projektissa (INNUENDO) 2016 2018 https://sites.google.com/site/theinnuendoproject/ Rahoittajana EFSA, vetäjänä Helsingin yliopisto Ohjelmistoalusta WGS-datan analysointiin: E. coli, Campylobacter, Salmonella, Yersinia enterocolitica Eviralla ja THL:llä käytössä yhteinen INNUENDO-alusta 6
Yhteistyö THL:n kanssa Kantavertailu epidemiatilanteissa Humaanikannat lähetetään THL:ään Elintarvike-, eläin- ja ympäristökannat (tai -näytteet) lähetetään Eviraan https://www.evira.fi/tietoa-evirasta/esittely/toiminta/laboratoriopalvelut/naytteenotto--ja-lahetysohjeet/ WGS-menetelmien harmonisointi THL:ssä samanlainen sekvensointilaite 2015 lähtien INNUENDOn lisäksi muita ohjelmistoja muiden bakteerilajien analysointiin (esim. Listeria monocytogenes) 7
Näytteen valmistus ja sekvensointi
Sekvensointikirjaston valmistus (Nextera, Illumina) 9
Sekvensointi synteesin avulla (Illumina) 10
Datan analysointi
Lukusekvensseistä biologisesti ymmärrettäviksi tuloksiksi 12
Lukusekvensseistä biologisesti ymmärrettäviksi tuloksiksi Satoja tuhansia lukusekvenssejä/näyte, pituus 100-300 bp Lukusekvenssien rinnastus kohdegeeneihin: in silico tyypitys Virulenssi, serotyyppi Lukusekvenssien koonti koontisekvensseiksi de novo ja koontisekvenssien annotointi Virulenssi, antibioottiresistenssi Bakteerikantojen sukulaisuuden tutkiminen MLST-pohjaisilla menetelmillä lukusekvenssit koontisekvenssit koonti Geneious (reads mapping visualization) Joao Andre Carrico, 2016, lecture: https://github.com/bacterialcommunitiesandpopulation/friday20thmay/blob/master/rematch_helsinki_20may2016.pptx 13
MLST multilocus sequence typing nimeäminen skeema?? ddl? aroe xpt?? gdh recp spi gki Streptococcus pneumoniae Housekeeping-geenit?? ST aroe gdh gki recp spi xpt ddl 156 7 11 10 1 6 8 1 PCR 7 sekvenssiä Sangersekvensointi alleeliprofiili 1 7? 8 xpt ddl aroe 1 recp ST 156 gdh 11 spi gki 6 10 http://pubmlst.org/spneumoniae/ www Alleelit ja ST Jokainen uniikki geenisekvenssi (alleeli) saa ID-numeron vertailussa online-tietokantaan 7 geenin ID-numerot muodostavat alleeliprofiilin (nimeäminen sekvenssityyppi, ST) Joao Andre Carrico, 2017, lecture: https://github.com/innuendocon/microbialgenomemetagenomecourse/blob/master/innuendo_helworkshop_wgmlst.pptx 14
MLST alleeliprofiilien vertailu 12-9 - 11-7 - 11-20 - 3 1 alleelin ero: 2 alleelin ero: 3 alleelin ero: 12 12 10-10 - 10-10 - 11-11 - 11-7 - 11-11 - 11-11 - 11-20 - 20-2 - 3-3 - 3 15 Joao Andre Carrico, 2016, lecture: https://github.com/bacterialcommunitiesandpopulation/friday20thmay/blob/master/allelecall_helsinki_20may2016.pptx
MLST-pohjaiset menetelmät Maiden, M. C. J. et al. MLST revisited: the gene-by-gene approach to bacterial genomics. Nat Rev Micro 11, 728 736 (2013). Joao Andre Carrico, 2017, lecture: https://github.com/innuendocon/microbialgenomemetagenomecourse/blob/master/innuendo_helworkshop_wgmlst.pptx 16
Minimaalinen virityspuu alleeliprofiileista Minimum spanning tree (MST) Juureton puu, jossa Solmut: tutkittavat bakteerikannat (alleeliprofiilit) numerot kantojen näytenumeroita Yhdysviivat: alleelierot kantojen välillä Numero ilmaisee erilaisten lokusten lkm kantojen välillä, huom! skeema ja lokusten määrä Pituus/suunta ei kerro mitään João André Carriço and Miguel Machado, 2017, lecture: https://github.com/innuendocon/microbialgenomemetagenomecourse /blob/master/innuendo_helworkshop_innuca.pptx 17
Minimaalinen virityspuu alleeliprofiileista Perustuu parittaisten etäisyyksien laskemiseen alleeliprofiileista ja etäisyyksien minimoimiseen koko puussa Soveltuu kantojen samankaltaisuuden tutkimiseen lyhyellä aikaskaalalla Epidemianselvitykset Alleelieroista voidaan päätellä kantojen klusteroituminen ja siten todennäköisin tartuntalähde João André Carriço and Miguel Machado, 2017, lecture: https://github.com/innuendocon/microbialgenomemetagenomecourse /blob/master/innuendo_helworkshop_innuca.pptx 18
Yhteenveto WGS korvaa muita menetelmiä Enemmän ja aiempaa tarkempia tuloksia bakteerikantojen sukulaisuussuhteista ja geneettisistä ominaisuuksista Bakteerikantojen lähettäminen Eviraan tärkeää 19
Tapausesimerkki: pakastevihanneksiin liittyvä L. monocytogenes -epidemia Maria Simola Mikrobiologian tutkimusyksikkö Evira Ajankohtaista laboratoriorintamalta 2018
Taustaa: Maanlaajuisten/kansainvälisten listeriaepidemoiden selvittäminen menetelmät murroksessa THLssä: Kaikki sairastuneista potilaista eristetyt L. monocytogenes kannat tyypitetään sekvensoimalla Jos rypäitä ilmenee, altistusta kartoitetaan tarkemmin mm. syvähaastattelemalla potilaita -> yhteistä elintarvikelähdettä epäiltäessä elintarvikkeet ilmoitetaan Eviraan Evirassa: Elintarvikkeista eristetyt laboratorioiden lähettämät L. monocytogenes kannat tallennetaan Eviran kantakokoelmaan Epidemiologisten tietojen (esim. sairastunut potilas syönyt elintarviketta, josta kanta eristetty tai THL on havainnut mahdollisen yhteisen elintarvikelähteen ryvästyneiden kantojen perusteella) pohjalta L. monocytogenes kantoja tyypitetään tarkemmin L. monocytogenes epidemiakantojen sekvensointi on aloitettu tänä vuonna, mahdollisuus edelleen myös PFGE (pulssikenttä) -tyypitykseen Ajankohtaista laboratoriorintamalta 2018
ST6 Epidemia: aikajana Evirassa Muualla 15.11.2017: Pyyntö THL:n ja myöhemmin Euroopan Listeria referenssilaboratorion kautta verrata oman kirjaston pulssikenttäprofiileita ST6 potilaskannan profiiliin ei samanlaista profiilia Marraskuu: THL havaitsee L. monocytogenes ST6 ryvästymän, potilashaastatteluista ei selviä yhteistä lähdettä 21.11.2017: Tieto THL:sta: ST6 potilastapauksia havaittu myös Iso- Britanniassa, Ruotsissa, Tanskassa ja Itävallassa. 18.1.2018 : Suomalainen elintarvikeyritys A saa testituloksen: 100 pmy/g ylitys L. monocytogenes bakteeria oli havaittu pakastemaissista, erästä A. Elintarvikeyritys teki takaisinvedon kyseisestä erästä. Ajankohtaista laboratoriorintamalta 2018
ST6 Epidemia: aikajana 23.1.2018: Pakastemaissista eristettyjä L. monocytogenes kantoja (eristä A, B, C, D ja E) Eviraan paikallislaboratorioista Evirassa Muualla 22.1.2018: Eviraan tieto pakastemaissierän takaisinvedosta Ruotsissa 22.1.2018 Keskusteltuaan Eviran valvonnan kanssa elintarvikeyritys A vetää takaisin kaikki pakastemaissierät, joiden parasta ennen -päiväys oli 6.1.2019-9.6.2019 Ajankohtaista laboratoriorintamalta 2018 29.1.2018: L. monocytogenes kannat eristä D ja E lähetetään Ruotsiin (Swedish Health agency) sekvensoitavaksi. 9.2.2018: Sekvensointitulosten perusteella Suomessa eristetyt kannat eristä D ja E olivat hyvin samankaltaiset kuin Ruotsissa eristetty pakastemaissikanta.
ST6 Epidemia: aikajana 14.3.2018: L. monocytogenes kannat pakastemaissieristä A, B, D and E tyypitetään pulssikenttämenetelmällä. Kaikkien kantojen tyyppi oli samanlainen. 14.5.2018: Evira lähettää 15 Tullilaboratorion eristämää pakastemaissi- ja pakastevihanneskantaa sekvensoitavaksi EU referenssilaboratorioon Evira Muualla Ajankohtaista laboratoriorintamalta 2018 16.3.2018: L. monocytogenes kannat eristä A, B ja D sekvensoidaan THL:ssä, tulokset 9.4.2018 19.6.2018: Referenssilaboratorioon lähetetyistä kannoista 3 vastasi epidemiakantaa. Kannat oli eristetty pakastemaissista, eristä K ja J
THL sekvensointitulos 9.4.2018 Ajankohtaista laboratoriorintamalta 2018
Ajankohtaista laboratoriorintamalta 2018 https://ecdc.europa.eu/sites/portal/files/docu ments/22-02-2018-rra-listeria-finland.pdf
Kiitokset: INNUENDO-projekti: THL Helsingin yliopisto Universidade de Lisboa, Portugal National Institute of Health, Lisbon, Portugal University of the Basque Country, Vitoria-Gasteiz, Spain University of Veterinary Medicine Vienna, Austria Veterinary and Food Laboratory, Tartu, Estonia Institute of Food Safety, Animal Health and Environment, Riga, Latvia Public Health Agency of Canada, Lethbridge, Canada Epidemiaselvitys Suomessa: THL epitiimi THL laboratorio Eviran valvontaosasto Eviran laboratorio Tullilaboratorio Kantoja lähettäneet laboratoriot Kunnat Ajankohtaista laboratoriorintamalta 2018