( B ) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGN I NGSSKR I FT. (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 A 61K 39/10, C 12N 1/20, 1/22. (24) Alkupäivä - Löpdag

Transkriptio

1 ( B ) (11) KUULUTUSJULKAISU UTLAGGN I NGSSKR I FT C ( 5) 1 (51) Kv.lk.5 - Int.c1.5 A 61K 39/10, C 12N 1/20, 1/22 (21) Patenttihakemus - Patentansökning SUOMI-FINLAND (22) Hakemispäivä - Ansökningsdag (FI) (24) Alkupäivä - Löpdag (41) Tullut julkiseksi - Blivit offentlig (44) Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm. - Patentti-ja rekisterihallitus Ansökan utlagd och utl.skriften publicerad Patent- och registerstyrelsen (32) (33) (31) Etuoikeus - Prioritet (71) Hakija - Sökande JP P 1. The Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University, c/o Osaka University, 3-1 Yamadaoka, Suita-shi, Osaka, Japan, (JP) (72) Keksijä - Uppfinnare 1. Chazono, Masashi, Muromoto-cho, Kanonzi-shi, Kagawa-ken, Japan, (JP) 2. Yoshida, Iwao, Nagareoka-cho, Kanonzi-shi, Kagawa-ken, Japan, (JP) 3. Konobe, Takeo, 9-24 Yahata-cho 1-chome, Kanonzi-shi, Kagawa-ken, Japan, (JP) 4. Osame, Juichiro, Takuma Matoba, Takuma-cho, Mitoyo-gun, Kagawa-ken, Japan, (JP) 5. Takaku, Keisuke, Senriyama-nishi 4-chome, Senriyama, Suita-shi, Osaka-fu, Japan, (JP) (74) Asiamies - Ombud: Oy Jalo Ant-Muorinen Ab (54) Keksinnön nimitys - Uppfinningens benämning Menetelmä Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kannan viljelemiseksi, ja menetelmä hinkuyskärokotteen ja hinkuyskätoksoidia sisältävän sekarokotteen valmistamiseksi Förfarande för odling av Bordetella pertussis TOHAMA (fas U-stammen och förfarande för framställning av kikhostavaccin och ett blandat vaccin, som innehåller kikhostatoxoid (56) Viitejulkaisut - Anförda publikationer NO B (C 12N 1/20) (57) Tiivistelmä - Sammandrag Keksintö koskee menetelmää Bordetella pertussisin viljelemiseksi selluloosan ja/tai selluloosajohdannaisten läsnäollessa. Tämä menetelmä on käyttökelpoinen sekaantigeenin valmistamiseksi, joka sisältää hinkuyskätoksiinia ja filamentti-hemagglutiniinia suuren määrän, kustannusten ollessa alhaiset. Antigeenista voidaan saada pysyvä ja tehokas hinkuyskätoksoidi käytettäväksi hinkuyskarokotteeseen. Keksintö koskee myös rokotetta, joka sisältää hinkuyskätoksoidin aktiiviaineena ja gelatiinia ja/tai gelatiinijohdannaisia stabiloimisaineena. Tämän keksinnön mukainen rokote on erittäin pysyvä ja sitä voidaan varastoida pitkiä ajanjaksoja. Uppfinningen avser ett förfarande för odling av Bordetella pertussis i närvaro av cellulosa och/eller cellulosaderivat. Denna metod är användbar för framställning av en blandad antigen, vilken innehåller kikhostatoxin och filament-hemagglutinin i en stor mängd, med låga kostnader. Från antigenet kan man erhålla en stabil och effektiv kikhostatoxoid för att användas till ett kikhostavaccin. Uppfinningen avser också ett vaccin, som innehåller kikhostatoxoid som aktivämne och gelatin och/eller ett gelatinderivat som stabileringsämne. Vaccinet enligt denna uppfinning är ytterst stabilt och kan lagras under långa tidsperioder.

2 86959 Menetelmä Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kannan viljelemiseksi, ja menetelmä hinkuyskärokotteen ja hinkuyskätoksoidia sisältävän sekarokotteen valmistamiseksi - Förfarande för odling av Bordetella pertussis TOHAMA (fas I)-stammen och förfarande för framställning av kikhostavaccin och ett blandat vaccin, som innehåller kikhostatoxoid Tämä keksintö koskee menetelmää Bordetella pertussisin viljelemiseksi. Tämä keksintö koskee myös hinkuyskätoksoidia. Edelleen keksintö koskee rokotetta, joka sisältää hinkuyskätoksoidin aktiiviaineena. Tämän keksinnön mukainen menetelmä on edullinen viljelmän tuottamiseksi, joka sisältää lisääntyneen määrän seka-antigeenia, joka muodostuu hinkuyskätoksiinista ja hinkuyskä-filamenttihe-magglutiniinista. Viljelmästä seka-antigeeni voidaan eristää helposti. Tämän keksinnön mukainen hinkuyskätoksoidi saadaan vaikeuksitta seka-antigeenista, jonka vuoksi sitä voidaan valmistaa helposti alhaisilla kustannuksilla. Tämän keksinnön mukainen hinkuyskätoksoidi on erittäin tehokas aktiiviaine hinkuyskärokotteeseen ja diagnostinen aine hinkuyskän toteamiseksi. Hinkuyskä on akuutti hengitystieinfektiosairaus, jonka aiheuttaa Bordetella pertussis-infektio. Hinkuyskä vaikuttaa keuhkoputkiin ja sen pieniin haaroihin ja sille on tunnusomaista räjähtävä yskä, joka päättyy hinkuvaan hengitykseen, tällainen yskä on sairaudelle ominainen ja kansanomaisesti sen on sanottu kestävän sata päivää. Tosiasiassa räjähtävä yskä toistuu uudestaan usean viikon kuluessa. Erityisesti kun kyseessä on pieni lapsi, joka kärsii hinkuyskästä, esiintyy hengityssalpauskohtausyskää (an apnea-paroxysmal cough), johon joskus liittyy kouristus. Tämän sairauden estämiseksi on Japanissa vuodesta 1949 lähtien pienille lapsille annettu hinkuyskärokotus pian

3 syntymän jälkeen. Tavanomaiset hinkuyskärokotteet sisältävät aktiiviaineena inaktivoituja bakteerisoluja, jonka vuoksi niillä rokotettaessa pyrkii esiintymään ei-toivottuja sivuvaikutuksia. Sivuvaikutuksina hyvin tunnettuja ovat esimerkiksi erilaiset paikalliset reaktiot hinkuyskärokotteen rokotuskohdassa, systeemiset oireet, kuten kuume, kärttyisyys, oksentelu ja ripuli, tilapäiset hermokouristukset ja hermosyntyinen (neurogeeninen) shokki ja vakava enkefaliitti ja vastaavat. Toisaalta viime vuosina sairastuminen hinkuyskään ja siitä johtuvat kuolemat ovat huomattavasti vähentyneet johtuen parantuneista elinoloista ja kemoterapioiden kehittymisestä. Siitä huolimatta nykyään edellä mainitut sivuvaikutukset, jotka johtuvat rokotuksen antamisesta pikemmin kuin sairauden aiheuttamasta infektiovaarasta, ovat muodostuneet vakavaksi ongelmaksi. Kuitenkin on hyvin vaarallista, että rokotus hinkuyskää vastaan on lopetettu näiden sivuvaikutusten välttämiseksi. Tämä on käynyt ilmi viimeaikaisesta katkerasta kokemuksesta, kun monet lapsipotilaat ovat kuolleet hinkuyskään Japanissa ja Englannissa johtuen hinkuyskän luonnollisesta esiintymisestä, joka aiheutui rokotusten väliaikaisesta lopettamisesta. Näin ollen on oletettavaa, että hinkuyskärokotuksen suorittaminen on yhä tärkeätä ja välttämätöntä. Tähän asti on esitetty monia aineita suojaavana antigeenina, biologisesti aktiivisena aineena tai Bordetella pertussisin komponenttina. Tällaisista aineista voidaan mainita esimerkiksi lämpölabiili toksiini tai dermonekroottinen toksiini; lämpölabiili agglutinogeeni; endotoksiini tai lipopolysakkaridi; filamentti-hemagglutiniini (F-HA); histamiini-sensitiivinen tekijä (histamine sensitizing factor = HSF); leukosytoosia tai lymfosytoosia edistävä tekijä (leucocytosis or lymphocytosis promoting factor = LPF); hinkuyskätoksiini (pertussis toxin = PT), jota myös kutsutaan nimellä lymfosytoosia edistävä tekijä

4 hemagglutiniini (LPF-HA); adjuvanttifaktori; adenylaattisyklaasi; saareketta aktivoiva tekijä (islet-activating factor); ulkomembraaniproteiini ja vastaavat. Näistä aineista, tähän mennessä, filamentti-hemagglutiniinia (jäljempänä usein merkitty "F-HA") ja hinkuyskätoksiinia (jäljempänä usein merkitty "PT") on sovellettu käytännössä hinkuyskätoksoidin tai hinkuyskäkomponenttirokotteen aktiiviaineina. Kuten edellä mainittiin, on tunnettua, että tavanomaisilla rokotteilla on erilaisia sivuvaikutuksia, koska rokotteet sisältävät aktiiviaineena inaktivoituja bakteerisoluja. Näin ollen kaikkialla maailmassa on voimakkaasti toivottu turvallisen ja tehokkaan rokotteen kehittämistä, jolla olisi tasainen laatu ilman edellä mainittuja sivuvaikutuksia (Journal of American Medical Association, 125(2), , 1984; Bulletin of the World Health Organization, 63(2), , 1985). Japanissa terveys- ja sosiaaliministeriö on jo hyväksynyt hinkuyskätoksoidin (puhdistettu, adsorboitu hinkuyskärokote), joka sisältää aktiiviaineena aineen, joka saadaan tekemällä myrkyttömäksi Bordetella pertussisista peräisin oleva suojaava antigeenifraktio (F-HA ja PT), ja tätä on markkinoitu syksystä 1981 lähtien. Rokotteen valmistusmenetelmien suhteen viitataan tässä esimerkiksi seuraaviin julkaisuihin: JP-patenttijulkaisu nro , US-patentti nro , US-patentti nro 4,500,639, JP-hakemusjulkaisu nro , JP-patenttijulkaisu nro , EPhakemusjulkaisu nro , EP-hakemusjulkaisu nro , JP-hakemusjulkaisu nro , JP-hakemusjulkaisu nro , JP-patenttijulkaisu nro , JP-hakemusjulkaisu nro , JP-hakemusjulkaisu nro , EP-hakemusjulkaisu nro , JP-hakemusjulkaisu nro , US-patentti nro 4,029,766, US-patentti nro 4,551,429, jne.

5 Edelleen komponenttirokotteen, jossa käytetään Bordetella pertussisista peräisin olevaa ainetta aktiiviaineena, valmistuksessa tunnetaan esimerkiksi soluseinän käyttö (JP-patenttijulkaisu nro ), saareketta aktivoivan tekijän käyttö (JP-hakemusjulkaisu nro ), ulkomembraaniproteiinin käyttö (EP-hakemusjulkaisu nro 4137, EP-hakemusjulkaisu nro 80021), adenylaattisyklaasiaktiivisuuden omaavan fraktion käyttö (EP-hakemusjulkaisu nro ), endotoksiinin käyttö (FR-hakemusjulkaisu nro ) jne. Kuitenkin edellä mainituilla, tavanomaisilla menetelmillä on jokaisella ainakin yksi seuraavista haittatekijöistä. (1) Tuotantokustannukset ovat korkeat, koska tarvitaan kalliita aineita. (2) Aktiiviaineen saanto rokotetta varten on alhainen. (3) Tuotettavan rokotteen turvallisuus, teho, yhtenäinen laatu ja stabiilisuus eivät ole tyydyttäviä. Esimerkiksi US-patentissa nro 4,500,639, JP-hakemusjulkaisussa nro , EP-hakemusjulkaisussa nro ja JP-patenttijulkaisussa nro , jotka edellä on mainittu, esitetään, että PT- ja F-HA-saantojen lisäämiseksi, syklodekstriiniä, joka tunnetaan isäntäyhdisteenä, joka kykenee muodostamaan sulkeutuvia (inclusion) komplekseja, lisätään peruskasvualustaan Bordetella pertussisin viljelemiseksi. Kuitenkin tällä tekniikalla on seuraavat haitat: (1) Käytettävä syklodekstriini on kallista. (2) Tuotettu PT ja F-HA ovat liittyneenä syklodekstriiniin kasvualustassa ja niiden erottaminen syklodekstriinistä ja puhdistaminen erittäin puhtaaksi on vaikeata.

6 Toisin sanoen, tällainen tekniikka ei ole taloudellinen, koska tarvitaan kalliita aineita ja kalliita puhdistuslaitteita ja siinä käytetyt menetelmät ovat hyvin monimutkaisia ja vaivalloisia. Tämän vuoksi on vaikeata saada hinkuyskärokotetta, joka olisi turvallinen ja tasalaatuinen. Lisäksi edellä mainitussa US-patentissa nro 4,551,429 esitetään, että Bordetella pertussisin peruskasvualustaan lisätään polyvinyylialkoholia samaa tarkoitusta varten kuin edellä on esitetty. Kuitenkaan tässä viitteessä ei ole kuvausta menetelmästä, jolla PT ja F-HA puhdistetaan erittäin puhtaaksi eikä kuvausta tuotetun PT:n ja F-HA:n laadusta ja tämän vuoksi on kyseenalaista että tämän viitejulkaisun mukaisesti saatu rokote sisältää erittäin puhdasta PT:tä ja F-HA:ta ja on tasalaatuinen. Kuten on yleisesti tunnettua, vuonna 1979 WHO (Maailman terveysjärjestö) aloitti laajennetun rokotusohjelman (an Expanded Programme on Immunization = EPI) ja suorittaa nyt tätä ohjelmaa. Ohjelman tarkoituksena on antaa kaikkiaan 6 rokotusta, nimittäin hinkuyskärokotus, jäykkäkouristusrokotus, kurkkumätärokotus, tuberkuloosirokotus, poliorokotus ja tuhkarokkorokotus kaikille pikkulapsille maailmassa vuoteen 1990 mennessä (WHO Chronicle, 36(4) , 1982). Tämän ohjelman loppuunsaattamiseksi WHO kiirehtii rokotteiden kehittämistä, jotka ovat erinomaisia stabiilisuudeltaan ja kuuman kestäviä, ja joita voidaan käyttää tropiikissa, jossa ei ole jääkaappeja, sekä rokotteiden käyttöönottoa [WHO Technical Report Series, No. 673, 15, (1982)]. Lisäksi rokotteet, joiden tiitterit eivät alene vaikka ne pakastetaan, ovat myös erittäin käyttökelpoisia, koska rokotteita käytetään myös kylmillä alueilla. Sen vuoksi kaikkialla maailmassa on toivottu, että kehitettäisiin erittäin stabiileja rokotteita, jotka ovat erinomaisia sekä kuumankestävyydessä ja kylmänkes-

7 6 P6959 tävyydessä ja näin niitä voidaan käyttää ympäristön lämpötilassa millä tahansa trooppisilla ja kylmillä alueilla. Mitä tulee kuumuuden kestäviin rokotteisiin, niin tunnetaan esimerkiksi kuivatut rokotteet, kuten elävä virusrokote, inaktivoitu virusrokote, soluvapaa sekarokote, joka muodostuu inaktivoidusta bakteerista ja toksoidista (JP-hakemusjulkaisu nro ) ja vastaavat. Kuitenkin edellä mainitut, kuivatut rokotteet ovat huonoja stabiilisuudeltaan siten, että sen jälkeen kun niitä on varastoitu 37 C:ssa noin kuukauden ajan, niiden tiitterit alentuvat lukemiin, jotka ovat niin alhaiset kuin % verrattaessa rokotteiden tiittereihin ennen varastointia. Koska on voimakkaasti toivottu rokotteen kehittämistä, joka on äärimmäisen hyvä kuumankestävyydessä ja kylmän kestävyydessä ja pysyvä siten, että rokotteen tiitteri tuskin lainkaan alentuu, vaikka sitä säilytetään esimerkiksi lämpötilassa, joka on noin -20 C - noin 50 C useiden kuukausien ajan. Lisäksi hinkuyskätoksoidi, joka saadaan tekemällä hinkuyskätoksiini myrkyttömäksi formaliinilla, on nyt kaupallisesti saatavissa mutta tällaisella toksoidilla on vakavia haittoja, koska toksoidi pyrkii palautumaan toksiseen tilaan varastoinnin kuluessa, jonka vuoksi varastoinnin jälkeen toksoidin turvallisuutta ei enää voida taata. Edellä mainitun toksoidin toksiseen tilaan tapahtuvan palautumisen estämiseksi on esitetty, että formaliinin sijasta käytettäisiin karbodi-imidiä myrkyttömäksi tekevänä aineena (JP-hakemusjulkaisu nro ). Kuitenkin karbodi-imidin käyttö on kyseenalaista, koska karbodiimidin turvallisuutta ei ole vahvistettu. Alalla on innokkaasti odotettu edellä mainittujen tavanomaisten rokotteiden haittojen ja epäedullisten seikkojen poistamista ja parannetun hinkuyskärokotteen kehittämistä.

8 86959 Tämän hakemuksen keksijät ovat suorittaneet laajoja ja intensiivisiä tutkimuksia edellä mainittujen ongelmien ratkaisemiseksi. Tuloksena on havaittu, että kun Bordetella pertussista viljellään selluloosan ja/tai selluloosajohdannaisen läsnäollessa, PT:tä ja F-HA:ta voidaan tuottaa viljelmässä korkealla saannolla alhaisin kustannuksin ja näin saatu PT ja F-HA voidaan helposti puhdistaa viljelmästä. Edelleen on todettu, että hinkuyskätoksoidi, joka saadaan tekemällä myrkyttömiksi tällainen PT ja F-HA käyttäen formaliinia, ei muutu takaisin toksiseen tilaan. Lisäksi on todettu, että lisäämällä gelatiinia ja/tai gelatiinijohdannaista rokotteeseen, joka sisältää edellä saadun hinkuyskätoksoidin aktiiviaineena, tai sekarokotteeseen, joka sisältää hinkuyskätoksoidin ja antigeenin, joka on muu kuin hinkuyskätoksoidi, rokotteen stabiilisuus on huomattavasti parantunut. Lisäksi on havaittu, että kun edellä mainitut rokotteet lyofilisoidaan, niiden stabiilisuus edelleen paranee. Tämä keksintö on toteutettu perustuen edellä mainittuihin uusiin havaintoihin. Näin ollen tämän keksinnön kohteena on uusi menetelmä Bordetella pertussisin viljelemiseksi, joka on tehokas tuottaen seka-antigeenia, joka sisältää PT:n ja F-HA:n, joita käytetään valmistettaessa hinkuyskärokotetta ja joita voidaan tuottaa Bordetella pertussis -viljelmässä lisääntynyt määrä alhaisin kustannuksin. Tämän keksinnön avulla valmistetaan edelleen hinkuyskätoksoidia, jota voidaan käyttää turvallisena, pysyvänä ja tehokkaana aktiiviaineena hinkuyskärokotteeseen. Tämän keksinnön kohteena on edelleen menetelmä hinkuyskärokotteen valmistamiseksi, joka rokote on erinomainen kuumuuden kestävyyden ja kylmänkestävyyden suhteen, ja

9 jota voidaan varastoida ympäristön lämpötilassa pidempiä aikoja. Olennaisesti tämä keksintö koskee menetelmää Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kannan viljelemiseksi ravintoalustassa, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että hankitaan Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kanta ja viljellään mainittua Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kantaa noin 30 C - 37 C:ssa noin tuntia ravintoalustassa, joka sisältää ainakin yhden aineen, joka on selluloosa tai selluloosajohdannainen, konsentraatiossa noin 0,01 - noin 2 paino-% Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kannan viljelmän aikaansaamiseksi. Tämän keksinnön mukaisesti saadaan myös seka-antigeeni, joka sisältää hinkuyskätoksiinin ja hinkuyskäfilamenttihemagglutiniinin, ja joka saadaan erottamalla saatu viljelmä edellä mainittujen menetelmien mukaisesti supernatantiksi ja Bordetella pertussis -soluiksi ja puhdistamalla mainittu supernatantti. Edelleen tämän keksinnön mukaisesti saadaan hinkuyskätoksoidi tekemällä edellä mainittu seka-antigeeni myrkyttömäksi. Lisäksi tämän keksinnön mukaisesti saadaan adsorboitu hinkuyskärokote, joka sisältää tehokkaan, immunogeenisen määrän edellä mainittua hinkuyskätoksoidia, mainitun hinkuyskätoksoidin ollessa adsorboituna apuaineeseen, ja ainakin yhden farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen, laimennusaineen tai täyteaineen. Edelleen tämän keksinnön mukaisesti saadaan adsorboitu hinkuyskärokote, joka sisältää tehokkaan, immunogeenisen määrän edellä mainittua hinkuyskätoksoidia, mainitun hinkuyskätoksoidin ollessa adsorboituna apuaineeseen, aina-

10 kin yhden farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen, laimennusaineen tai täyteaineen ja stabiloimisaineen. Tämän keksinnön mukaisesti saadaan myös sekarokote, joka sisältää tehokkaat, immunogeeniset määrät edellä mainittua hinkuyskätoksoidia, mainitun hinkuyskätoksoidin ollessa adsorboituna apuaineeseen, ainakin yhden antigeenin, joka on muu kuin mainittu hinkuyskätoksoidi, ja ainakin yhden farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen, laimennusaineen tai täyteaineen. Edelleen tämän keksinnön mukaisesti saadaan sekarokote, joka sisältää tehokkaat, immunogeeniset määrät edellä mainittua hinkuyskätoksoidia, mainitun hinkuyskätoksoidin ollessa adsorboituna apuaineeseen, ja ainakin yhden toksoidin, joka on muu kuin mainittu hinkuyskätoksoidi, mainitun ainakin yhden toksoidin ollessa adsorboitua apuaineelle; ainakin yhden farmaseuttisesti hyväksyttävän kantoaineen, laimennusaineen tai täyteaineen; ja stabiloimisaineen. Tämä keksintö koskee myös menetelmää hinkuyskärokotteen tuottamiseksi, joka rokote sisältää tehokkaan, immunogeenisen määrän hinkuyskätoksoidia, jossa menetelmässä (1) hankitaan Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kanta, (2) viljellään mainittua Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kantaa ravintoalustassa, joka sisältää ainakin yhden aineen, joka on selluloosa tai selluloosajohdannainen, Bordetella pertussis TOHAMA faasi I)-kannan viljelmän aikaansaamiseksi, (3) erotetaan mainittu viljelmä supernatantiksi ja Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kannan soluiksi ja mainittu supernatantti puhdistetaan seka-antigeenin saamiseksi, joka sisältää hinkuyskä-

11 toksiinin ja hinkuyskä-filamentti-hemagglutiniinin, (4) tehdään myrkyttömäksi mainittu seka-antigeeni hinkuyskätoksoidin saamiseksi, (5) adsorboidaan mainittu hinkuyskätoksoidi apuaineeseen, ja (6) lisätään muodostuneeseen, apuaineeseen adsorboituun toksoidiin ainakin yksi farmaseuttisesti hyväksyttävä kantoaine, laimennusaine tai täyteaine ja stabiloimisaine. Edelleen tämä keksintö koskee menetelmää sekarokotteen tuottamiseksi, joka rokote sisältää tehokkaat, immunogeeniset määrät hinkuyskätoksoidia ja ainakin yhden antigeenin, joka on muu kuin mainittu hinkuyskätoksoidi, jossa menetelmässä: (1) hankitaan Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)- kanta, (2) viljellään mainittua Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kantaa ravintoalustassa, joka sisältää ainakin yhden aineen, joka on selluloosa tai selluloosajohdannainen, Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kannan viljelmän aikaansaamiseksi, (3) erotetaan mainittu viljelmä supernatantiksi ja Bordetella pertussis TOHAMA (faasi I)-kannan soluiksi ja mainittu supernatantti puhdistetaan seka-antigeenin saamiseksi, joka sisältää hinkuyskätoksiinin ja hinkuyskä-filamentti-hemagglutiniinin, (4) tehdään myrkyttömäksi mainittu seka-antigeeni hinkuyskätoksoidin saamiseksi, (5) adsorboidaan mainittu hinkuyskätoksoidi apuaineeseen, (6) lisätään muodostuneeseen hinkuyskätoksoidiin ainakin yksi antigeeni, joka on muu kuin mainittu,

12 ( 7 ) lisätään apuaineeseen adsorboitu hinkuyskätoksoidi, mainitun hinkuyskätoksoidin ja mainitun ainakin yhden antigeenin soeksen saamiseksi, ja mainittuun seokseen ainakin yksi farmaseuttisesti hyväksyttävä kantoaine, laimennusaine tai täyteaine ja stabiloimisaine. Seuraavassa tätä keksintöä selitetään yksityiskohtaisesti. [1] Bordetella pertussisin viljeleminen Tämän keksinnön menetelmän mukaisesti Bordetella pertussista viljellään ravintoalustassa, joka sisältää ainakin yhden aineen, joka on selluloosa tai selluloosajohdannainen. Ravintoalustana voidaan käyttää tavallisesti Bordetella pertussisin viljelemiseksi tunnettuja peruskasvualustoja. Tällaisina peruskasvualustoina voidaan mainita esimerkiksi Bordet-Gengou-alusta, Cohen-Wheler-alusta, Stainer- Scholte-alusta ja vastaavat [Advances in Applied Microbiology, Vol. 20, sivut (1976]. Ravintoalusta, jota käytetään tässä keksinnössä, voi yleensä olla nestemäisessä muodossa. Vaihtoehtoisesti se voi olla myös kiinteässä muodossa. Ravintoalusta, jota käytetään tässä keksinnössä, sisältää ainakin yhden aineen, joka on selluloosa tai selluloosajohdannainen. Aineen konsentraatio ravintoalustassa on noin 0,01 - noin 2,0 paino/paino-%. Selluloosajohdannaisina voidaan käyttää esimerkiksi selluloosan epäorgaanisia happoestereitä, selluloosan orgaanisia happoestereitä ja selluloosan eettereitä. Tyypillisiä esimerkkejä selluloosajohdannaisista ovat asetyyliselluloosa, selluloosaksantogenaatti, selluloosapropionaatti, selluloosaformiaatti, selluloosabutylaatti, sel-

13 luloosasulfaatti, selluloosafosfaatti, selluloosa-asetaattibutyraatti, metyyliselluloosa, etyyliselluloosa, bentsyyliselluloosa, trityyliselluloosa, syaanietyyliselluloosa, karboksimetyyliselluloosa, karboksietyyliselluloosa, aminoetyyliselluloosa, oksietyyliselluloosa, hydroksietyyliselluloosa, hydroksipropyyliselluloosa, hydroksipropyylimetyyliselluloosa ja asetyylisukkinyylihydroksipropyyli-metyyliselluloosa ja vastaavat. Lisäksi selluloosajohdannaisina voidaan käyttää myös esimerkiksi selluloosan estereitä korkeamman rasvahapon kanssa, selluloosan estereitä tyydyttymättömän rasvahapon kanssa, selluloosan estereitä kaksiemäksisen rasvahapon kanssa, selluloosan estereitä halogenoidun rasvahapon kanssa, selluloosan estereitä sulfonihapon kanssa, selluloosan estereitä aromaattisen karboksyylihapon kanssa, selluloosan estereitä karbamiinihapon kanssa, selluloosan ristikytkettyjä eettereitä ja selluloosan kationisia eettereitä mikäli ne eivät ole myrkyllisiä. Viljely suoritetaan staattisesti siinä tapauksessa, että ravintoalusta on kiinteä. Toisaalta kun ravintoalusta on nestemäinen, viljely voidan suorittaa staattisesti ja vaihtoehtoisesti se voidaan tehdä myös sekoittamalla käyttäen kiertoravistelijaa, fermenttoritankkia, joka on varustettu sekoittimella, jne. Yleensä viljely voidaan suorittaa noin 30 C - noin 37 C:ssa noin 20 - noin 80 tunnin ajan. Näin saadaan Bordetella pertussis -viljelmä, joka sisältää seka-antigeenin, joka sisältää suuren määrän hinkuyskätoksiinia (PT) ja filamentti-hemagglutiniinia (F-HA). [2] Seka-antigeenin, joka sisältää PT:n ja F-HA:n, talteenottaminen ja puhdistaminen: Seka-antigeeni, joka sisältää PT:n ja F-HA:n, saadaan edellä mainitusta viljelmästä erottamalla viljelmä super-

14 natantiksi ja Bordetella pertussis -soluiksi ja puhdistamalla supernatantti. Viljelmän erottaminen supernatantiksi ja soluiksi voidaan tehdä hyvin tunnetulla, tavanomaisella menetelmällä, kuten sentrifugoimalla alhaisella tai suurella nopeudella. Sen jälkeen näin saatu supernatantti puhdistetaan. Puhdistusta suoritettaessa voidaan käyttää tavanomaisia menetelmiä yhdessä. Tällaisina tavanomaisina menetelminä voidaan mainita esimerkiksi alhaisella nopeudella suoritettu sentrifugointi, suurella nopeudella suoritettu sentrifugointi, ultrasentrifugointi, suoloitus, saostaminen orgaanisella liuottimella, jne., adsorptiokäsittely adsorbentilla, kuten hiilijauheella ja erilaisilla geeleillä, dialyysi, suodatus, ultrasuodatus ja vastaavat. Kuten edellä kuvattiin, puhdistettaessa tämän keksinnön mukaista seka-antigeenia ei tarvita mitään monimutkaisia, hankalia ja kalliita menetelmiä, kuten elektroforeesia ja affiniteettipylväskromatografiaa. Tämän vuoksi seka-antigeeni voidaan saada tehokkaasti alhaisilla kustannuksilla verrattuna tavanomaisiin menetelmiin. Näin saatu antigeeni sisältää PT:tä ja F-HA:ta painosuhteessa noin 1:1. Sekä PT:n että F-HA:n, jotka sisältyvät seka-antigeeniin, paino voidaan määrittää menetelmän mukaan, joka kuvataan myöhemmin vertailuesimerkissä 9. Seka-antigeeni on käyttökelpoinen - ei ainoastaan raakaaineena hinkuyskärokotteen valmistamiseksi - vaan myös hinkuyskän diagnostisoimiseksi. [3] Hinkuyskätoksoidin valmistus: Edellä saatu seka-antigeeni tehdään myrkyttömäksi tavanomaisella menetelmällä. Esimerkiksi antigeenin myrkyttömäksi tekeminen voidaan suorittaa seuraavalla tavalla. Seka-antigeeniin, joka sisältää PT:n ja F-HA:n, lisätään inaktiivinen aine, kuten formaliini ja sekoitetaan riit-

15 tävästi antigeenin tekemiseksi myrkyttömäksi. Sen jälkeen muodostunut seos dialysoidaan inaktivoivan aineen poistamiseksi. Saadusta dialysaatista hinkuyskätoksoidi voidaan saada tavanomaisella menetelmällä, kuten lyofilisoimalla, saostamalla käyttäen orgaanista liuotinta, jne. [4] Alkuperäisen hinkuyskärokoteliuoksen valmistus: Edellä saatu dialysaatti, joka sisältää hinkuyskätoksoidin, laimennetaan fosfaattipuskurilla, jne. siten, että hinkuyskätoksidin konsentraatioksi muodostuneessa seoksessa tulee noin 40 - noin 60 pg-proteiinityppeä per ml. Näin saatua liuosta käytetään alkuperäisenä hinkuyskärokoteliuoksena. [5] Adsorboidun hinkuyskärokotteen valmistus: Edellä saatu, alkuperäinen hinkuyskärokoteliuos laimennetaan puskurilla, kuten fosfaattipuskurilla, ja muodostuneeseen laimennokseen lisätään apuaine, jolloin hinkuyskätoksidi adsorboituu apuaineeseen. Esimerkiksi alkuperäinen hinkuyskärokoteliuos voidaan laimentaa 1/75 M fosfaattipuskurilla ja muodostuneeseen seokseen voidaan lisätä aluminiumhydroksidigeeliä apuaineena, siten että lisätyn geelin konsentraatioksi tulee noin 0,1-0,8 mg/ml. Apuaineena voidaan käyttää myös saostusapuaineita (precipitating depositary adjuvants), kuten kalsiumfosfaattigeeliä, aluminiumfosfaattigeeliä, aluminiumsulfaattia, alumiinidioksidia ja bentoniittia ja antigeenituotantoa indusoivia apuaineita, kuten muramyylipeptidijohdannaisia, polynukleotideja, Krestiinia ja pikibaniilia. Seoksesta geeli, joka adsorboi hinkuyskätoksoidin, saadaan esimerkiksi sentrifugoimalla, jne., ja muodostuneeseen geeliin lisätään ainakin yksi farmaseuttisesti hyväksyttävä kantoaine, täyteaine tai laimennusaine, esimerkiksi puskuri, kuten fosfaattipuskuri.

16 Sen jälkeen näin saatu hinkuyskärokoteliuos, joka sisältää geeliin adsorboitunen hinkuyskätoksoidin, kaadetaan erikseen pienen astiaan, kuten ampulliin ja pienpulloon ja suljetaan. Näin on saatu puhdistettu, adsorboitu hinkuyskärokote, joka sisältää adsorboituneen hinkuyskätoksoidin tehokkaana immunogeenisena määränä antaen tartuntaa vastustavan kyvyn henkilölle, joka saa rokotuksen. Hinkuyskätoksoidin tällainen tehokas, immunogeeninen määrä rokotteessa voi olla noin 7 - noin 15 pg proteiinityppeä per ml. Ei ole edullista käyttää hinkuyskätoksoidia määränä, joka on enemmän kuin 15 pg proteiinityppeä per ml, koska mitään huomattavaa lisäystä immunisaatiovaikutuksessa ei saavuteta mutta rokotusvalmisteen kustannukset kohoavat. Ei myöskään ole edullista käyttää hinkuyskärokotetta määränä, joka on vähemmän kuin noin 7 pg proteiinityppeä per ml, koska toivottu immunisaatiovaikutus ei aina heti synny. Tuotetun rokotteen laatua on tutkittu artikkelin "Adsorbed Pertussis Vaccine" mukaan, Japanin terveys- ja sosiaaliministeriön tiedonannossa nro 159, "Minimum Requirements for Biological Products". Näin tuotettu, adsorboitu hinkuyskärokote on neste. Adsorboitu hinkuyskärokote voidaan lyofilisoidaan adsorboidun hinkuyskärokotteen saamiseksi kuivatussa muodossa. Tällaisella kuivatulla, adsorboidulla hinkuyskärokotteella on parempi kuumankestävyys ja kylmänkestävyys. Lyofilisointi voidaan tehdä yleensä tavanomaisella menetelmällä, sen jälkeen kun nestemäinen, adsorboitunut hinkuyskärokote on laitettu astiaan, kuten pienpulloon tai ampulliin. Lyofilisoimisen jälkeen typpikaasua johdetaan astiaan, joka sisältää kuivatun rokotteen, jonka jälkeen astia suljetaan. Sen jälkeen kuivattu rokote varastoidaan. Stabiilisuuden kannalta katsottuna on edullista, että varastoinnin aikana adsorboitu hinkuyskärokote on kuivatussa muodossa. Edelleen tämän keksinnön mukaisesti hinkuyskätoksoidin stabiilisuuden lisäämiseksi rokotteessa, voidaan stabi-

17 loimisainetta lisätä adsorboituun hinkuyskärokotteeseen, joka on nestemäisessä muodossa. Stabiloimisaineista, joita voidaan käyttää tässä keksinnössä, voidaan mainita gelatiini ja gelatiinijohdannaiset. Gelatiinia ja gelatiinijohdannaisia voidaan käyttää pelkästään tai yhdistelmänä. Gelatiinina voidaan käyttää esimerkiksi puhdistettua gelatiinia, joka on Japanin farmakopean mukaista ja vastaavia. Gelatiinijohdannaisina voidaan käyttää esimerkiksi Gelysatea (valmistaja ja myyjä BBL Co., Ltd., USA), Physiogelia, Neoplasmagelia, Gelifundolia, Haemaccelia (valmistaja ja myyjä Hoechst AG, Länsi-Saksa) (jota myös kutsutaan polygeliiniksi), jne. Edellä mainittujen gelatiinijohdannaisten yksityiskohtia kuvataan julkaisussa Developments in Biological Standardization, julkaisija S. Karger, 48, (1981). Näistä Haemaccelia voidaan käyttää kaikkein mieluimmin, koska Haemaccelin turvallisuus on varmistettu ja Haemaccelia käytetään verisubstituuttina tai plasmasubstituuttina ihmisille. Edellä mainittua stabiloimisainetta voidaan lisätä nestemäiseen, adsorboituun hinkuyskärokotteeseen sellaisena määränä, että stabiloimisaineen konsentraatioksi muodostuneessa seoksessa voi tulla noin 0,1 - noin 5,0 painoprosenttia. Käytettäessä kahta tai useampaa erilaista stabiloimisainetta, niitä lisätään sellaisena määränä, että niiden kokonaismäärä tulee edellä mainittujen rajojen sisälle. Edelleen edellä mainitun stabiloimisaineen lisäksi tarpeen mukaan voidaan lisätä nestemäiseen hinkuyskärokotteeseen ainakin yksi tavanomainen tunnettu stabiloimisaine, esimerkiksi sokereita, kuten glukoosia, fruktoosia, galaktoosia, sakkaroosia ja laktoosia ja aminohappoja, kuten glysiiniä, alaniinia, lysiiniä, arginiinia ja glutamiinia. Tällaista stabiloimisainetta voidaan lisätä

18 sellainen määrä, että kunkin stabiloimisaineen konsentraatio muodostuneessa seoksessa voi olla noin 0,1 - noin 8,0 painoprosenttia. Näin tuotettu hinkuyskärokote sisältää stabiloimisaineen nestemäisessä muodossa. Nestemäinen hinkuyskärokote voidaan lyofilisoida edellä mainitulla tavalla, jolloin saadaan adsorboitu hinkuyskärokote kuivatussa muodossa, joka sisältää stabiloimisaineen. Stabiilisuuden kannalta varastoinnin aikana on edullista, että adsorboitu hinkuyskärokote sisältää stabiloimisaineen, joka on kuivatussa muodossa. Edellä mainitun adsorboidun hinkuyskärokotteen laatua, joko nestemäisessä muodossa tai kuivassa muodossa, voidaan tutkia edellä mainitun tiedotteen nro 159 mukaisesti, jonka on julkaissut Japanin terveys- ja sosiaaliministeriö. [6] Sekarokotteen valmistus: Tämän keksinnön mukainen rokote voidaan valmistaa sekarokotteen muodossa, joka sisältää tämän keksinnön mukaisen, adsorboidun hinkuyskätoksoidin ja ainakin yhden antigeenin, joka on muu kuin tämä hinkuyskätoksoidi. Antigeenina, joka on muu kuin tämä hinkuyskätoksoidi, voidaan käyttää mitä tahansa antigeenia, joita tavallisesti käytetään vastaavien rokotteiden aktiiviaineina, mikäli tällaisten muiden antigeenien ja hinkuyskätoksoidin sivuvaikutukset ja haitalliset reaktiot eivät ole additiivisesti tai synergistisesti lisääntyneet käytettäessä hinkuyskätoksoidia ja tällaisia muita antigeeneja yhdistelmänä, eivätkä hinkuyskätoksoidin ja tällaisten muiden antigeenien antigeenisyydet ja immunogeenisyydet ole alentuneet hinkuyskätoksoidin ja muiden antigeenien välillä tapahtuvan vuorovaikutuksen seurauksena. Antigeenien, joita voi-

19 daan sekoittaa hinkuyskätoksoidin kanssa, lukumäärä tai laatu ei ole rajoitettu, sikäli kuin sivuvaikutukset ja haitalliset reaktiot eivät lisäänny additiivisesti tai synergistisesti, eikä hinkuyskätoksoidin eikä tällaisten antigeenien antigeenisyys ja immunogeenisyys ole alentunut kuten edellä mainittiin. Yleensä kandesta kuuteen antigeenia, muuta kuin hinkuyskätoksoidia, voidaan sekoittaa hinkuyskätoksoidin kanssa. Antigeeneina, joita voidaan sekoittaa tämän keksinnön mukaisen hinkuyskätoksoidin kanssa, voidaan mainita esimerkiksi myrkyttömäksi tehdyt antigeenit, inaktivoidut antigeenit tai toksoidit, jotka ovat peräisin seuraavista: kurkkumätäbakteeri, jäykkäkouristusbakteeri, lavantautibakteeri, pikkulavantautibakteeri, kolerabakteeri, gonokokki, meningokokki, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Haemophilus influenza, streptokokki ryhmä A ja ryhmä B, Streptococcus pneumoniae, pneumokokki, Legionella, Rickettsia prowazekii, Rickettsia reckettsii, leptospira, Leptospira interohaemorrhagia (Weilin taudin patogeeni), malariaparasiitit, Coccidioides immitis, maksamato, toksoplasma, trypanosooma, leismania, hepatiitti-b-virus, japanilainen aivotulehdusvirus, influenssavirukset tyypit A ja B, parainfluenssavirus, AIDS-virus, Trimeresurus-lajiin kuuluvien käärmeiden myrkyt ja vastaavat. Edelleen yleisesti tunnettuja, keinotekoisia antigeeneja voidaan myös käyttää. Edellä mainitut antigeenit voivat olla adsorboituna apuaineeseen. Apuaineena voidaan käyttää edellä mainittuja. Tämän keksinnön mukainen sekarokote voidaan valmistaa seuraavalla tavalla. Alkuperäinen hinkuyskärokoteliuos, joka sisältää hinkuyskätoksoidin, saadaan kuten edellä kohdassa [4] kuvattiin. Erikseen tavanomaisen menetelmän mukaisesti valmistetaan liuokset, joista jokainen sisältää hinkuyskätoksoidin kanssa sekoitettavaksi tarkoitetun

20 antigeenin. Sen jälkeen alkuperäiseen hikuyskärokoteliuokseen, joka sisältää hinkuyskätoksoidin, lisätään liuos tai liuokset, joista jokainen sisältää antigeenin, joka on muu kuin hinkuyskätoksoidi. Sen jälkeen muodostuneeseen seokseen lisätään ainakin yksi farmaseuttisesti hyväksyttävä kantoaine, laimennusaine tai täyteaine. Tämän keksinnön mukainen sekarokote valmistetaan siten, että sekarokote voi sisältää hinkuyskätoksoidia tehokkaan, immunogeenisen määrän, eli noin 7-15 /pg proteii- niantigeenia per sekarokotteen ml ja tehokkaan, immunogeenisen määrän kutakin antigeenia, muuta kuin hinkuyskätoksoidia. Jokaisen antigeenin, muun kuin hikuyskätoksoidin, tehokas, immunogeeninen määrä vaihtelee antigeenilajin mukaisesti. Kuvaavana esimerkkinä tämän keksinnön mukaisen sekarokotteen valmistuksesta esitetään seuraavassa hinkuyskätoksoidin, kurkkumätätoksoidin ja jäykkäkouristustoksoidin sisältävän sekarokotteen valmistus. Tavanomaisella menetelmällä saadusta kurkkumätäsauvabakteeri-viljelmästä eristetään kurkkumätä-(diphteria)toksoidi ja puhdistetaan tavanomaisella, tunnetulla menetelmällä. Pääasiassa samalla tavalla kuin kuvataan kohdassa [3] alkuperäinen puhdistettu kurkkumätätoksoidi tehdään myrkyttömäksi ja alkuperäinen kurkkumätärokoteliuos valmistetaan olennaisesti samalla tavlla kuin edellä kohdassa [4] on esitetty. Erikseen valmistetaan alkuperäinen jäykkäkouristusrokoteliuos jäykkäkouristussauvabakteeri-viljelmästä olennaisesti samalla tavalla kuin juuri edellä mainittiin. Hinkuyskätoksoidina käytetään alkuperäistä hinkuyskärokoteliuosta, joka saatiin edellä kohdassa [3]. Jokaiseen näin saatuun, aluperäiseen rokoteliuokseen lisätään apuaine, jolloin saadaan alkuperäiset, adsorboidut rokoteliuokset. Näin saadut, adsorboidut rokoteliuokset sekoitetaan sellaisessa suhteessa, että hinkuyskätoksoidin, kurkkumätätoksoidin ja jäykkäkouristustoksoidin konsent-

21 20 B6959 raatioiksi tulee noin 21 - noin 45 pg proteiinityppeä per ml, noin 90 Lf/ml ja vastaavasti noin 21 Lf/ml. Näin on saatu sekarokote, joka sisältää adsorboidun hinkuyskätoksoidin, adsorboidun kurkkumätätoksoidin ja adsorboidun jäykkäkouristustoksoidin. Näin saatuun sekarokotteeseen voidaan lisätä ainakin yksi stabiloimisaine, joka on gelatiini tai gelatiinijohdannainen sellaisena määränä, että stabiloimisaineen konsentraatioksi tulee noin 0,1 - noin 5,0 painoprosenttia. Edellä saatu sekarokote lyofilisoidaan kuivatun sekarokotteen valmistamiseksi. Näin saatu, kuivattu sekarokote sisältää edellä mainittua stabiloimisainetta sellaisen määrän, että kun sekarokote liuotetaan veteen siten, että saadaan vesipitoinen liuos, joka sisältää hinkuyskätoksoidia konsentraatiossa noin 7 - noin 15 pg proteiinityppeä per ml, stabiloimisaineen konsentraatioksi tulee noin 0,1 - noin 5 painoprosenttia. Näin tuotetun rokotteen laatua tutkitaan artikkelin "Mixed Adsorbed Vaccine for Pertussis, Diphtheria and Tetanus" mukaisesti, Japanin terveys- ja sosiaaliministeriön tiedonannossa nro 159, "Minimum Requirements for Biological Products". Tämän keksinnön mukainen sekarokote ei ole rajoitettu edellä mainittuun sekarokotteeseen, vaan sellainen voidaan valmistaa sekoittamalla tämän keksinnön mukainen hinkuyskätoksoidi, minkä tahansa edellä mainitun antigeenin kanssa. Yleensä tämän keksinnön mukainen rokote voidaan sisällyttää ja sulkea pienpulloon, ampulliin tai vastaaviin. Tämän keksinnön mukainen rokote voidaan yleensä annostaa nesteenä tai suspensiona. Siinä tapauksessa, että rokote on kuivatussa muodossa, rokote liuotetaan tai suspendoidaan steriloituun, tislattuun veteen ennen annostusta. Hinkuyskätoksoidin konsentraatio tämän keksinnön mukaisessa rokotteessa voi yleensä olla noin 7 - noin 15 pg

22 proteiinityppeä per ml, kuten edellä mainittiin. Yleensä rokote voidaan annostaa subkutaanisesti. Rokotteen annos henkilöä kohden voi yleensä olla noin 0,5 ml. Rokotetta voidaan yleensä annostaa kolme kertaa noin kolmen - kahdeksan viikon aikavälein ja sen jälkeen noin vuoden - puolentoista vuoden kuluttua annostetaan vielä kerran. [7] Diagnostinen valmiste hinkuyskän toteamiseksi Kuten edellä mainittiin tämän keksinnön mukainen sekaantigeeni on käyttökelpoinen myös hinkuyskän diagnostisoimiseksi, erityisesti immunologisessa diagnostiikassa hinkuyskäinfektioiden havaitsemiseksi ja sen määrittämiseksi, kärsivätkö potilaat hinkuyskästä vai eivät. Yleensä diagnostisen valmisteen valmistamiseksi hinkuyskälle, tämän keksinnön mukainen seka-antigeeni erotetaan kahteen komponenttiin, nimittäin PT:hen ja F-HA:han, ja kumpaakin sekä PT:tä että F-HA:ta käytetään yksinään diagnoosissa. Seka-antigeenin erottaminen PT:hen ja F-HA:han voidaan yleensä suorittaa tavanomaisella menetelmällä, kuten hydroksiapatiittipylväskromatografisesti. Kumpaakin sekä PT:tä että F-HA:ta voidaan tehokkaasti käyttää ELISAdiagnoosissa (Enzyme-linked immunosorbent assay), käänteisessä passiivisessa hemagglutinaatio-reaktiotestissä ja muissa erilaisissa testeissä, joissa antigeenin tai vasta-aineen leimaamiseen käytetään fluoroivaa pigmenttiä, entsyymiä, radio-isotooppia tai vastaavaa. Yleisesti diagnostista käyttöä varten sekä PT että F-HA voidaan erikseen sisällyttää ja sulkea pienpulloon tai pieneen koeputkeen. Vaihtoehtoisesti kumpikin, sekä PT että F-HA, voidaan myös erikseen adsorboida tavallisen suodatinpaperin, membraanin tai mikrolevyn pinnalle. Tällä menetelmällä on seuraavat edut. (1) Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä Bordetella pertussis -bakteerin viljelemiseksi voidaan saada viljel-

23 mä, joka sisältää seka-antigeenin, jossa on lisääntynyt määrä PT:tä ja F-HA:ta. Edelleen tämän menetelmän mukaisesti tällainen viljelmä voidaan saada alhaisilla kustannuksilla verrattaessa sellaisiin, jotka saadaan tavanomaista tekniikkaa käyttäen, kuten tekniikalla, jossa Bordetella pertussista viljellään syklodekstriinin läsnäollessa, koska selluloosa ja selluloosajohdannaiset, joita käytetään tässä keksinnössä, ovat helposti saatavissa alhaisilla kustannuksilla. (2) PT:n ja F-HA:n painosuhde tämän keksinnön mukaisessa seka-antigeenissa, jossa PT ja F-HA ovat raaka-aineita tämän keksinnön mukaisen rokotteen aktiiviaineiksi, on noin 1:1. Tämä on edullista, koska tehokkuuden kannalta on hyvä, että hinkuyskärokote sisältää toksoidit, jotka vastaavasti on johdettu PT:stä ja F-HA:sta painosuhteessa noin 1:1, ja tällainen hinkuyskärokote voidaan tehokkaasti ja työtä säästäen valmistaa tämän keksinnön mukaisesta seka-antigeenista. (3) Viljelyn jälkeen selluloosa ja selluloosajohdannaiset voidaan helposti poistaa viljelmästä ja siten voidaan helposti ja tehokkaasti saada erittäin puhdasta PT:tä ja F-HA:ta alhaisin kustannuksin. (4) Näin saadut PT ja F-HA ovat yhtenäisiä laadultaan ja sen vuoksi tämän keksinnön mukainen hinkuyskätoksoidi, joka saadaan PT:stä ja F-HA:sta tavanomaisella myrkyttömäksi tekevällä menetelmällä, jossa käytetään formaliinia, on myös tasalaatuinen. Edelleen tämän keksinnön mukainen hinkuyskätoksoidi ei muutu takaisin myrkylliseen tilaan säilytyksen aikana. Sen vuoksi tämä toksoidi on erinomainen stabiilisuudeltaan ja turvallisuudeltaan. (5) Tämän keksinnön mukaisen, kuivatun rokotteen, joka sisältää stbailoimisaineena ainakin yhden aineen, joka on

24 gelatiini tai sen johdannainen, tiitteri ei laske varastoitaessa 3 vuoden ajan lämpötilassa, joka on -20 C - 37 C ja yli 3 kuukautta 50 C:ssa. Tämän keksinnön mukainen, kuivattu rokote on erittäin pysyvä ja helppo käsitellä. Seuraavassa tätä keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti, viitaten seuraaviin vertailuesimerkkeihin ja esimerkkeihin, joiden ei pidä katsoa rajoittavan tämän keksinnön piiriä. Viite-esimerkki 1 Muunnetun Stainer-Scholte-kasvualustan valmistus: Ensimmäisen ryhmän komponentit, jotka jäljempänä esitetään, ja toisen ryhmän komponentit, jotka myös on esitetty jäljempänä, liuotetaan erikseen sopiviin tilavuuksiin tislattua vettä kanden liuoksen valmistamiseksi. Sen jälkeen liuos, jossa on ensimmäisen ryhmän komponentit, steriloidaan autoklaavilla. Toisaalta liuos, joka sisältää toisen ryhmän komponentit, steriloidaan suodattamalla. Ennen käyttöä molemmat steriloidut liuokset sekoitetaan ja seokseen lisätään steriloitua vettä niin, että seoksen kokonaistilavuudeksi tulee Ensimmäisen ryhmän komponentit: natriumkloridia natriumdivetyfosfaattia magnesiumkloridi-heksahydraattia kalsiumkloridi-dihydraattia kuparisulfaatti-pentahydraattia kasaminohappoa L-proliinia natriumglutamaattia tris 25,0 g 5,0 g 1,0 g 0,2 g 0,005 g 100,0 g 2,4 g 100,0 g 15,3 g

25 Toisen ryhmän komponentit: L-kystiiniä rauta(2)sulfaatti-heptahydraattia askorbiinihappoa niasiinia 0,4 g 0,1 g 0,2 g 0,4 g Viite-esimerkki 2 Parannetun Pope-kasvualustan valmistus: Alustalla on seuraava koostumus ja sitä käytetään autoklaavilla suoritetun steriloinnin jälkeen. kalsiumkloridia dinatriumvetyfosfaattia L-kystiiniä maltoosia liuosta II 1) lihalientä 2) 0,6 g 1,0 g 0,15 g 31,0 g 4,0 g 1000,0 ml Huomautus: 1) Liuoksen II koostumus on seuraava: magnesiumsulfaattia 2,25 g kuparisulfaattia 0,5 g mangaanikloridia 0,15 g sinkkisulfaattia 0,4 g 1,15 g nikotiinihappoa 1,15 g pimeliinihappoa 0,075 g kloorivetyhappoa 30,0 ml tislattua vettä 1000,0 ml 2) Lihaliemi valmistetaan seuraavalla tavalla. 17 litraan tislattua vettä lisätään 5,1 kg hienonnettua lihaa. Muodostuneen seoksen annetaan seistä yön yli. Sen jälkeen näin saadun seoksen lämpötila nostetaan ja pidetään

26 C:ssa vesihauteella ja seokseen lisätään 6,2 kg papaiinia [valmistaja Merck & Co., Inc., USA (valkuaisenhydrolysointikyky 1:350)] ja seosta hämmennetään 2 tuntia hienonnetun lihan digeroimiseksi seokseen. Sen jälkeen muodostunutta seosta kuumennetaan C:ssa 10 minuutin ajan. Sitten seokseen lisätään Celiteä suodatusapuaineeksi ja saatu seos suodatetaan käyttäen suodatuspaperia. Näin saatua suodosta käytetään lihaliemenä. Viite-esimerkki 3 Parannetun PII-kasvualustan valmistus: Kasvualustalla on seuraava koostumus ja sitä käytetään autoklaavilla suoritetun steriloimisen jälkeen: sydänuutetta l) polypeptonia 2) natriumkloridia magnesiumsulfaattia dinatriumvetyfosfaattia kaliumdivetyfosfaattia glukoosia pelkistettyä rautaa tislattua vettä 15,0 g 20,0 g 5,0 g 0,2 g 0,16 g 0,1 g 7,5 g 0,25 g 1000,0 ml Huomautus: 1) Sydänuutetta valmistaa ja myy Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., Japani. 2) Polypeptonia valmistaa ja myy Daigo Eioy Kagaku Co., Ltd., Japani.

27 Viite-esimerkki 4 Fosfaattipuskurin valmistus: Fosfaattipuskuri valmistetaan sekoittamalla vesipitoinen dinatriumvetyfosfaattiliuos, jolla on toivottu konsentraatio, vesipitoisen kaliumdivetyfosfaattiluoksen kanssa, jonka konsentraatio on sama kuin dinatriumvetyfosfaattiliuoksen, sellaisessa tilavuussuhteessa, että muodostuneella seoksella on haluttu ph. Viite-esimerkki 5 Fosfaattipuskuroidun suolaliuoksen (PBS) valmistus: PBS valmistetaan liuottamalla dinatriumvetyfosfaatti ja kaliumdivetyfosfaatti liuokseen, jossa on 6,8 g/1 natriumkloridia, niin että muodostuneella liuoksella on haluttu ph. Viite-esimerkki 6 Bakteerien solukonsentraation määrittäminen: Bakteerien solukonsentraatio kasvualustassa määritetään mittaamalla sameus (turbidimetrisesti). Käytetään kolorimetria, joka on mallia Junior II (valmistaja ja myyjä Coleman Co., Ltd., USA). Bakteerien solukonsentraatio viljelmässä määritetään viljelmän sameuden perusteella vertaamalla tunnetun solukonsentraation omaavan standardibakteeriliuoksen [saatavissa Japanin kansanterveysinstituutista (National Institute of Health, Japan)] sameuteen. Viljelmän solukonsentraatio ilmoitetaan yksikkönä IOU/m1 (IOU = International Opacity Unit).

28 27 E,6959 Viite-esimerkki 7 F-HA-tiitterikoe: Erytrosyytit saadaan 3 päivää vanhoista kanoista. Erytrosyytit kiinnitetään formaliinilla ja formaliinilla kiinnitetyt erytrosyytit suspendoidaan 1/75 M PBS:ään, jossa on 0,1 paino/til.-% naudan seerumialbumiinia, 0,001 paino/til.-% gelatiinia ja 0,1 paino/til.-% natriumnitridiä, erytrosyyttikonsentraation ollessa 0,6 til./til.-%. Näytteelle, josta F-HA-tiitteri on määritettävä, suoritetaan kandennuslaimennus. Kumpaakin saatuun laimennokseen lisätään yhtä suuret tilavuudet edellä mainittua erytrosyyttisuspensiota, jonka jälkeen sekoitetaan. Sen jälkeen kumpaakin muodostunutta seosta tarkastellaan paljaalla silmällä, sen toteamiseksi, onko liuoksessa tapahtunut täydellinen hemagglutinaatio vai eikö. Havaintotuloksista saadaan suurin laimennossuhde, jossa vielä on tapahtunut täydellinen hemagglutinaatio. Näytteen F-HA-tiitteri määritetään näin saadun suurimman laimennossuhteen käänteisarvona ja ilmoitetaan yksikkönä HAU. Näytteen laimentamiseksi käytetään 1/75 M PBS:ää, jossa on 0,2 paino/til.-% naudan seerumialbumiinia. Viite-esimerkki 8 PT-tiitterikoe Ihmisen haptoglobiinia (valmistaja ja myyjä Green Cross Corporation, Japani) liuotetaan natriumkarbonaattipuskuriin (ph 9,6) niin, että ihmisen haptoglobiinin lopulliseksi konsentraatioksi tulee 2 pg/ml. Näin saadun seoksen annetaan seistä 4 C:ssa yön yli polystyreenistä valmistetulla mikrolevyllä (valmistaja ja myyjä Greiner Co., Ltd., Länsi-Saksa) niin, että haptoglobiini adsorboituu ja immobilisoituu mikrolevylle. Käyttäen näin saatua

29 haptoglobiini-immobilisoitua mikrolevyä yhdessä anti-ptkaniiniseerumin ja alkalisen fosfataasi-sitoutuneen antikaniini IgG:n kanssa testataan näytteen PT-tiitteri tavanomaisella, tunnetulla ELISA-menetelmällä. Testin tulos on automaattisesti luettavissa ELISA:n lukulaitteelta (valmistaja ja myyjä Dinatech Co., Ltd., USA) ja tuloksen laskee elektroninen tietokone jolloin PT-tiitteri saadaan. PT-tiitteri ilmoitetaan ELISA U/ml. Anti-PT-kaniiniseerumi saadan seuraavalla tavalla. PT adsorboidaan aluminiumfosfaatille ja injektoidaan kaniiniin subkutaanisesti. Noin 40 päivää myöhemmin kanista otetaan verta, joka sentrifugoidaan. Näin saadaan anti- PT-kaniiniseerumi. Alkalinen fosfataasi-sitoutunutta anti-kaniin IgG:tä valmistaa ja myy Miles-Yeda Co., Ltd., Israel. Viite-esimerkki 9 F-HA:n ja PT:n painosuhteen määrittäminen Menetelmä (A): Käyttäen F-HA:n ja PT:n standardinäytteitä, joilla on tunnetut aktiivisuudet ja proteiinimäärät ja puhtaus noin 100 % (saatavissa Japanin kansanterveysinstituutista) testataan näytteen vastaavat F-HA- ja PTaktiivisuudet tavanomaisella, tunnetulla ELISA-menetelmällä ja näin saatujen aktiivisuksien perusteella lasketaan F-HA:n ja PT:n painosuhde. Menetelmä (B): Happamissa olosuhteisa näytteelle suoritetaan polyakryyliamidigeeli-elektroforeesi. Sen jälkeen näin saatu geeli värjätään Coomassie Brilliant Bluella PT- ja F-HA-juovien tekemiseksi näkyviksi. Sitten geelille suoritetaan geelin optisen tiheyden määrittäminen juovien pinta-alojen mittaamiseksi. Jokaisen F-HA- ja PTjuovan pinta-alasta lasketaan F-HA:n ja PT:n painosuhde.

30 29?)6959 Molempien edellä mainituilla menetelmillä (A) ja (B) saatujen, laskettujen painosuhteiden perusteella määritetään lopullisesti F-HA:n ja PT:n painosuhde. viite-esimerkki 10 Endotoksiinin määrän määrittäminen Endotoksiinin määrän määrittämiseksi näytteessä käytetään Limulus-testipakkausta Wako (valmistaja ja myyjä Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japani). Limulus-testissä käytetään Limulus-amebosyyttilysaattia (LAL). Viite-esimerkki 11 Toksoidin toksiiniksi muuttumisen negatiivinen testi Testi suoritetaan hiiren leukosyyttejä sisältävällä testillä ja histamiinin herkkyystestillä, jotka on määritelty artikkelissa "Pertussis vaccine", Japanin terveysja sosiaaliministeriön tiedotteessa ro 159, "Minimum Requirements for Biolocial Products". Viite-esimerkki 12 Testi sekä kurkkumätätoksoidin että jäykkäkouristustoksoidin tiittereiden määrittämiseksi Tavanomaisen hiutale (flocculation) testin mukaisesti käyttäen standardi anti-toksiinia (saatavissa Japanin kansanterveysinstituutilta), testattiin sekä kurkkumätätoksoidin että jäykkäkouristustoksoidin tiitterit. Tiitterit esitetään Lf/ml:na.

31 Viite-esimerkki 13 Rokotteen toksoiditiitterin määrittäminen in vivo (A) Hinkuyskätoksoidin tiitteri testataan hiiren aivojensisäistä altistusta mittaavalla menetelmällä. (B) Kurkkumätätoksoidin tiitteri testataan kaniinin ihonsisäisellä injektiomenetelmällä. (C) Jäykkäkouristustoksoidin tiitteri testataan toksiinialtistusmenetelmällä immunoiduissa marsuissa ja immunoiduissa hiirissä. Edellä mainittujen testien suhteen viitataan artikkeleihin "Purified adsorbed pertussis vaccine", "Adsorbed diphtheria toxoid" ja "Adsorbed tetanus toxoid", jotka sisältyvät Japanin terveys- ja sosiaaliministeriön tiedonantoon nro 159, "Minimum Requirements for Biological Products". Edellä mainituilla testeillä saadut tiitterit ilmoitetaan yksiköissä IU/ml (IU = International Unit). Viite-esimerkki 14 Proteiinitypen määrän määrittäminen Näytteeseen lisätään trikloorietikkahappoa proteiinin saostamiseksi. Näin saostettu proteiini kerätään ja proteiinitypen määrä määritetään tavanomaisella, tunnetulla mikro-kjeldahl-menetelmällä. Esimerkki 1 [Bordetella pertussis kannan TOHAMA (faasi I) viljeleminen] 141 litraa_liuosta, joka sisältää edellä mainitun ensimmäisen ryhmän komponentit, modifoitua Stainer-Scholte-