IGRA-testi TB-diagnostiikassa ja jäljityksessä

Transkriptio

1 IGRA-testi TB-diagnostiikassa ja jäljityksessä Anne J Jääskeläinen Dos., sairaalamikrobiologi HUS, HUSLAB, Kliininen mikrobiologia Virologia ja immunologia

2 SISÄLTÖ Interferonigammaa mittaavat testit (IGRA-testit) Eri IGRA-testien erot ja käyttötarkoitus diagnostiikassa Mihin kysymyksiin IGRA-testit vastaavat? IGRA-testit jäljityksen apuna

3 Interferonigammaa mittaavat testit (IGRA-testit) 2 eri testiä eri valmistajilta Suunnattu mittaamaan soluvälitteistä immuunivastetta (CMI) T- lymfosyyteiltä IGRA-testit eivät erota aktiivista tuberkuloosia latentista tubista (LTBI), ja testitulos voi olla negatiivinen aktiivisessa tuberkuloosissa. IGRA-testiä ei voi käyttää LTBI-hoidon vasteen seurannassa. Uudessa altistumistilanteessa aiemmin positiivisen IGRA-testin uusimisesta ei ole hyötyä.

4 IGRA, Quantiferon (tutkimusnimike B-TbIFNg) Näytemäärät vuodessa tuhansia (HUSLAB) Tehdään muuallakin kuin HUSLABissa ELISA-pohjainen harmaa = nil vihreä = tb1 keltainen = tb2 violetti = mito n ä y t t e n o t t o

5 Quantiferon (B-TbIFNg) Syyskuussa 2016 otettiin käyttöön uusi Quantiferon Gold plus kitti jossa yhden tb-antigeenin sijaan nyt 2 eri tb-antigeeniputkea vanhassa kitissä vain yksi tb-antigeeniseos (1 tb-putki) jossa ESAT-6, CFP-10 ja TB7.7 antigeenit ESAT-6, CFP-10 ja TB7.7 kuuluvat M. tuberculosis -bakteerin RD1-genomiseen alueeseen RD1-genomialue löytyy (RD+): M. tuberculosis complex (M.tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. canettii, M. caprae, M. microti, M. pinnipedii, M. mungi and M. orygis) ja nontuberkuloottisilta mykobakteereilta (NTM) M. gastri, M. kansasii, M. marinum, M. riyadhense ja M. szulgai Huom! M. bovis BCG rokotekannalla ja suurella osalla NTM puuttuu RD1-genomialue uudessa kitissä poistettu TB7.7 -antigeeni mutta lisätty uusi tb2-putki jossa ESAT-6, CFP-10 sekä peptidejä CD8+ T-lymfosyyttien stimulointia varten

6 Quantiferon (B-TbIFNg) harmaa = nil vihreä = tb1 keltainen = tb2 violetti = mito n ä y t t e n o t t o 4 putkea; nil (taustakontrolli), tb1 (tubiantigeenit), tb2 (tubiantigeenit), mitogeeni (valkosolukontrolli) Antigeenit kuivattu putkien seinämille -> sekoitus siis olennainen osa tutkimuksen onnistumista Verinäytteen sisältämät valkosolut/lymfosyytit reagoivat antigeeneihin Mikäli kohdannut M. tuberculosis -bakteerin, tb1 ja tb2-antigeenit saavat aikaan soluissa interferonigamman tuotannon joka mitataan ELISA-pohjaisella testillä

7 Quantiferon (B-TbIFNg) Kirjallisuudessa vanhan ja uuden kitin performanssin on osoitettu olevan samaa luokkaa; esim. Siegel et al. JCM 2018 Validoitiin vanhaan kittiin verraten 30 eri näytteellä testit haluttiin tehdä rinnakkain (uusi ja vanha kitti) joten n-määrä vain 30 yhden potilaan tulkinnassa tasoeroa Uutta kittiä seurattiin vielä eri antigeeni-putkien osalta 176 potilaan verran Antigeenitulkinnoissa ei havaittu merkittäviä eroja Vain kahden potilaan kohdalla uusittiin testi antigeeni-putkitulosten erotessa toisistaan tulkinnallisesti > uusittuna yhtenevät tulokset

8 Quantiferon (B-TbIFNg) ja ekstrapulmonaarinen TB (EPTB): Negatiivinen IGRA-tulos? IGRA-tutkimus voi jäädä negatiiviseksi EPTB-tapauksissa Kim et al BMC Infectious Diseases (2018) 163 EPTB tapausta IGRA NEGAT: 28.8% EPTB potilaista Pleuraan tai luustoon liittyvä TB EPTB diagnoosi pohjautui kliiniseen, histopatologiseen, radiologiseen ja mikrobiologiseen dataan (TB viljely tai PCR) ja luokiteltiin varmistetuksi tai todennäköiseksi

9 Quantiferon (B-TbIFNg) ja non-tuberkuloottiset mykobakteerit (NTM): Positiivinen IGRA-tulos? IGRA-tutkimus vain harvoin positiivinen NTM-tapauksissa Hermansen et al Plos One 2014: 53 potilaalla varmistettu NTM, 8% (4/53) IGRA posit tulos IGRA POSIT: M. abscessus-chelonae (RD-,1kpl), M. celatum (RD-,1kpl), M. kansasii (RD+, 2 kpl) IGRA NEGAT: RD1- : M. avium complex (MAC), M. abscessus-chelonae, M. celatum, M. fortuitum-peregrinum, M. gordonae, M. malmoense, M.xenopi, M. interjectum, M. shimodei RD1+ : M. marinum Siegel et al JCM 2018: 51 potilaalla varmistettu pulmonaarinen NTM, 2% (1/51) IGRA posit tulos IGRA POSIT: M. avium complex (1 kpl, RD-) IGRA NEGAT: M. avium complex (45 kpl, RD-), M. abscessus (5kpl, RD-)

10 Quantiferon (B-TbIFNg) Testin näytteenottoon ja analyysiin liittyviä mahdollisia virhelähteitä: putkessa liian vähäinen/suuri määrä näytettä putkia ei ole sekoitettu huolellisesti potilaan näyte sisältää jo lähtökohtaisesti interferonigammaa (nil korkea) mitogeeni-kontrolli (kontrolloi sitä että näytteessä on tarpeeksi valkosoluja jotta testitulos on luotettava) jää alle rajan (<0.50)

11 Elispot, IGRA-testi (tutkimusnimike B-LyTbIFN) Testi pohjautuu interferonigamman mittaamiseen Näytemäärät ~10% B-TbIFNg näytemääristä (HUSLAB) Tehdään vain HUSLABissa; palvelee nykyään koko Suomea Käsityö, solutyöskentelyä vaativa

12 Workflow Päivä 1. Näyte saapuu HUSLABin virologian ja immunologian laboratorioon (ti tai to, klo13 mennessä; hidas solujenerottelutyövaihe ensimmäisenä päivänä, tähän varattava hyvin aikaa) Valkosolut erotellaan (Leucosept tubes) lihepariiniverestä Solut pestään Lymfosyytti % osuus mitataan = anti-interferonigamma vasta-aine = solu joka tuottaa gammainterferonia kohdattuaan esim. tubiantigeenin

13 Workflow Päivä 2. Solu-antigeeni-interaktio visualisoidaan sakkareaktiolla ja kvantitoidaan spottimäärä per kuoppa. Lopuksi lasketaan suhteutettu spottimäärä per miljoona lymfosyyttiä = entsyymikonjugoitu sekundäärivasta-aine, interferonigammaa kohtaan = entsyymi muodostaa substraatin lisäyksen jälkeen näkyvän sakkareaktion Spotti eli sakkareaktio = interferonigammaa tuottava solu, joka on reagoinut lisättyyn antigeeniin

14 Elispot, IGRA-testi: T-Cell Xtend reagenssi; näytteentoimitusaikaikkuna muuttui 8 tunnista 32 tuntiin WBC LYM T-Cell Xtend lisätty ID PVM kellonaika T-SPOT.TB A T-SPOT.TB B PHA 10^9/l % Lähtömäärä : ,3 92,9 6ml x : ,5 91 6ml : ,3 94,8 6ml x : ,1 92,7 6ml : ,8 93,9 6ml x : ,1 94,1 6ml 8h 32h Valkosolut erotellaan (Leucosept tubes) lihepariiniverestä

15 Eri IGRA-testien erot ja käyttötarkoitukset diagnostiikassa

16 Erot ja ensisijainen käyttötarkoitus (Miksi näin?) Quantiferon (B-TbIFNg), jäljityksen työkalu 4 kpl kitin omia putkia (nil, tb1, tb2, mitogeeni) Ei reagoi BCG-rokotukseen (ei voida siis myöskään käyttää BCG-rokotestatuksen tarkistamiseen) Ei lähtökohtaisesti reagoi atyyppisten mykojen aih. infektioihin, ei voida soveltaa näihin infektioihin Numeerista tulosta ei ole suhteutettu lymfosyyttimäärään ELISA pohjainen Elispot (B-LyTbIFN), erikoistutkimus Li-hepariiniputki (1 putki) Aikuiset ja lapset yli 20 kg: 6 ml Lapset alle 20 kg: 4 ml PPD-reaktio; tuberkuliini-antigeeni: BCG-rokotestatuksen tarkistaminen Rokottamattomilla pienillä lapsilla positiivinen PPD-reaktio yhdessä negatiivisten M. tuberculosis-vasteiden kanssa voi viitata atyyppisten mykobakteerien aih. infektioon (Kontturi et al. PIDJ 2015) Tulos suhteutetaan lymfosyyttimäärään; vastataan spottimääränä 1 milj. lymfosyyttiä kohden Lymfopeniapotilailla luotettavampi Käsityö, solutyö, kalliimpi kuin B-TbIFNg

17 Erot ja ensisijainen käyttötarkoitus (Miksi näin?) Quantiferon (B-TbIFNg) Kriittiset kohdat näyteputkien hyvä ja asiallinen sekoitus (antigeenit putkien seinämillä kuivattuna) inkubaatio oikeassa lämpötilassa näytteenkuljetus huoneenlämpöisinä mikäli ei ole inkuboitu (solujen kunto varmistettava) Inkubointi on oltava riittävä (16-24h) Näyte fuugataan inkuboinnin jälkeen; näytteenkuljetus helpompi (voi lähettää C:ssa) Inkuboidun näytteen saavuttava 3 vrk sisällä tutkivaan laboratorioon Elispot (B-LyTbIFN) Li-hepariiniputki on otettava ja toimitettava huoneenlämpöisenä, ei saa fuugata Li-hepariininäyte toimitettava työnaloituspäivään nähden 32h sisällä Esim. maanantaina otettu näyte joka toimitetaan tiistaiksi laboratorioon klo13 mennessä on soveltuva Esim. tiistaina otettu näyte joka toimitetaan vasta selvästi klo13 jälkeen laboratorioon ei säily torstaihin hyvänä (solut kärsivät, tulos ei enää luotettava) Tekopäivät: tutkimus tehdään useana päivänä viikossa (4-5 kertaa viikossa), nopeampi tutkimus Työnaloituspäivät ja kellonajat tällä hetkellä vain joka tiistai ja torstai klo13, arkipyhistä erilliset aikataulut Työ kokonaisuudessaan kestää aina 2 päivää Näytteitä voi ottaa lähtökohtaisesti ma-to, ei kuitenkaan ennen arkipyhää

18 Mihin kysymyksiin IGRA-testit vastaavat? Kysymys: 1) Onko potilaalla ollut kontakti M. tuberculosis bakteerin kanssa? Vastaus: 1) Quantiferon ja Elispot soveltuvat molemmat (muistaen rajoitteet tulkinnassa). 2) Soveltuuko BCG-rokotestatuksen tarkistamiseen? 2) Quantiferon ei. Elispot lähtökohtaisesti kyllä (PPD-reaktio) 3) Soveltuuko (BCGrokottamattomien) pienten lasten NTM-infektioiden diagnostiikkaan? 3) Quantiferon ei. Elispot kyllä BCGrokottamattomilla lapsilla (PPD-reaktio positiivinen rokottamattomilla)

19 IGRA-testit jäljityksen apuna THL:n ohjeistus 2017, suositus tuberkuloosin tartunnanjäljityksessä. Tartunnanjäljitys on tartuntatautilain mukaista toimintaa. Tärkeimpiä muutoksia ovat: tartuttavan keuhkotuberkuloosin määritelmää muutettu kumulatiivisen altistuksen raja nostettu 40 tuntiin (paitsi alle 7-vuotiaat suuren tartuntariskinosalta) 7 16-vuotiaat tutkitaan perusterveydenhuollossa IGRA-testaus laajennetaan alle 35-vuotiaille ja tartunnan saaneille harkitaan LTBI:n hoitoa Yli 35-vuotiaille ja IGRA-negatiivisille ei keuhkokuvaseurantaa (muutamia poikkeuksia lukuun ottamatta).

20 IGRA-testit jäljityksen apuna, taustaa Tartuttavuus suurin värjäyspositiivisessa keuhkotuberkuloosissa Suurimmassa tartuntariskissä ovat samassa perhepiirissä asuvat Alle 5-vuotiaan rokottamattoman lapsen riski sairastua tuberkuloosiin on erityisen suuri. tauti voi myös herkemmin kehittyä vaikeaksi (yleistynyt tauti tai aivokalvotulehdus) Alle vuoden ikäisistä tartunnan saaneista sairastuu puolet ja 1 5-vuotiaista neljäsosa. Myös teini-ikäisen ja nuoren aikuisen sairastumisriski on huomattavasti suurempi kuin varttuneemman aikuisen.

21 IGRA-testit jäljityksen apuna, taustaa Tartunnanjäljityksen edellytyksenä on, että tuberkuloosi on mikrobiologisesti varmennettu. THL: työryhmän linjaus: Hengitysteiden eritenäytteen värjäys positiivinen + samasta näytteestä nukleiinihapon osoitustesti TbNhO positiivinen (ympäristön NTM on suljettu pois). Värjäysnegatiivisessa keuhkotuberkuloositapauksessa jäljitys voidaan käynnistää ennen viljelyvarmistusta, jos TbNhO on positiivinen tai taudista on vahva kliininen epäily

22 IGRA-testit jäljityksen apuna (THL ohjeistus, <7v) Altistuneet alle 7-vuotiaat tutkitaan ja seurataan erikoissairaanhoidon puolella (lastentautien poliklinikalla). Tavoitteena on todeta ja hoitaa tuberkuloositartunta ennen sen kehittymistä sairaudeksi. Alkututkimuksiin kuuluu mm. haastattelu, kliininen tarkastus, myös BCG-arven tarkastus, THX-rtg jne sekä IGRA-testi, varsinkin jos ensimmäisestä altistumismahdollisuudesta on kulunut yli 1 kuukausi.

23 IGRA-testit jäljityksen apuna (THL ohjeistus, <7v) Jos ehkäisevää hoitoa ei aloiteta esim. altistus vähäinen, rokotettu 1 4-vuotias lapsi, 5 6-vuotias lapsi Uusitaan IGRA-testi, kun viimeisestä altistumismahdollisuudesta on kulunut vähintään 2 kuukautta. Jos lapsella ei todeta tuberkuloositartuntaa, seuranta lopetetaan.

24 IGRA-testit jäljityksen apuna (THL, >7v ja aikuiset) Kouluikäiset ja aikuiset tutkitaan perusterveydenhuollossa tai työterveyshuollossa IGRA-testi tehdään 7 35-vuotiaille 2 kk kuluttua viimeisestä altistumisesta (voidaan tehdä siis yhtäaikaisesti THX-rtg:n kanssa). Mikäli IGRA-testin eli B-TbIFNg tulos on vähintään 1.0 IU/ml lähete erikoissairaanhoitoon LTBI-hoidon arviota varten lapset lastentautien poliklinikalle aikuiset paikallisesti sovitun käytännön mukaisesti keuhko- tai infektiolääkärille IGRA-positiivisten vanhempien alle 7-vuotiaille lapsille voidaan harkita BCGrokotuksen antamista

25 Kiitos kaikille! A lab technician watches an African giant pouched rat sniffing samples at APOPO's training facility in Morogoro, eastern Tanzania where a crack team of trained rats sniff out tuberculosis much faster and more accurately than humans. Carl de Souza / AFP The big advantage is how quick the rats are. They can go through 100 samples in about 20 minutes, and this is what a lab technician will take four days to do, said Mr Cox.