Soluväliaineen tutkimuksen monet ulottuvuudet

Transkriptio

1 ÄYRÄPÄÄN LUENTO Taina Pihlajaniemi Soluväliaineen tutkimuksen monet ulottuvuudet Soluväliaineella on tärkeä kudoksia tukeva rakenteellinen tehtävänsä, jonka lisäksi se säätelee solujen vasteita ympäristölleen niiden kehityksen aikana, jakautuessa, kypsyessä, erilaistuessa ja liikkuessa paikasta toiseen sekä elimistön homeostaasissa ja syöpäsolujen invaasiossa. Nisäkkäillä tavattavien soluväliaineen keskeisten molekyylien joukon, matrisomin, muodostaa noin 300 molekyyliä. Ne voidaan ryhmitellä kollageeneihin, proteoglykaaneihin ja glykoproteiineihin. Kollageeni on elimistön proteiineista yleisin. Nisäkkäillä on 28 eri kollageenityyppiä, joista kolmestatoista on toistaiseksi löydetty perinnöllisiä tautimutaatioita. Tautikirjo heijastelee eri kollageenityyppien esiintymistä ja toiminnallista luonnetta elimistössä. Kollageenien synteesistä ja geenivirheistä saatua tietoa voidaan hyödyntää kehitettäessä perinnöllisten sairauksien diagnostiikkaa ja hoitomenetelmiä. Tutkimustietoa voidaan soveltaa myös fibrotisoivien sairauksien, jopa anemioiden ja iskemioiden hoitomuotojen kehittämisessä Solujen ja soluväliaineen (extracellular matrix) vuorovaikutus säätelee elinten kehitystä ja ylläpitää elimistön homeostaasia. Soluväliaine ympäröi monet elimistön soluista kokonaan, esimerkiksi soluväliainetta tuottavien solujen prototyypit fibroblastit tai luuta muodostavat luu- ja ja rustosolut. Solut voivat myös olla sekä kiinnittyneitä toisiin soluihin että ohuen tyvikalvoksi kutsutun soluväliaineen erikoistuneen muodon päälle. Tämä on ominaista epiteeli- ja endoteelisoluille. Jopa verenkierron vilkkaasti liikkuvat solut tarttuvat tietyissä tilanteissa soluväliaineeseen, kuten valkosolut poistuessaan verenkierrosta kudokseen tai puna solut osallistuessaan hyytymien muodostamiseen. Terve kudos uusiutuu siten, että siinä olevat kantasolut tai jo erilaistuneet solut tuottavat tarvittaessa uusia soluja. Sairauksissa elimistön häiriöt heijastelevat solujen ja soluväli aineen tasapainotilan muutosta, joka voi johtaa esimerkiksi solujen liialliseen jakautumiseen ja syövän syntymiseen. Kiinnostus soluväli aineen ja sitä solujen pinnalla tunnistavien reseptorien toimintaan johtuu näiden monista tehtävistä erilaisissa biologisissa prosesseissa, käytännössä kaikkien solujen toiminnassa sekä siitä, että muutokset tässä vuorovaikutussuhteessa ovat osallisina kaikissa sairausprosesseissa. Ihmisellä ja hiirellä tavattavien keskeisten soluväliaineen molekyylien joukon eli niin sanotun matrisomin muodostaa noin 300 molekyyliä, jotka kattavat 1 1,5 % nisäkkään genomista (Naba ym. 2012). Nämä molekyylit voidaan ryhmitellä kollageeneihin (43 geeniä), proteoglykaaneihin (35 geeniä) ja glykoproteiineihin (200 geeniä). Mikäli mukaan lasketaan soluväliaineen molekyyleihin sitoutuvat kasvutekijät, soluväliainetta muokkaavat entsyymit ja muut väliaineeseen liittyvät molekyylit kuten tietyt lektiinit, lukumäärä ylittää tuhannen. Soluväliaineen vaikutukset välittyvät soluihin näiden pinnan reseptoreiden kautta. Keskeisimmän reseptorien luokan muodostavat integriinit, joita on kaikissa soluissa. Tiedot soluväliaineen rakenteesta, tehtävistä ja yhteyksistä erilaisiin sairauksiin muodostavat erittäin laajan kokonaisuuden. Soluväliaineen tehtävät Elimistössä solua ympäröivät monet erilaiset soluväliaineen molekyylit kuten kollageenit, erilaiset glykoproteiinit kuten fibronektiini ja laminiini sekä monenlaiset proteoglykaanit. Solun pinnalla on reseptoreita, jotka tunnistavat solun ulkopuolelta tulevia signaaleja, kuten kasvutekijöitä tai hormoneja, mutta solukal- Duodecim 2013;129:

2 A Tyypin II kollageenisäikeet Aggrekaani Biglykaani Solun tukiranka COMP Tyypin XIII kollageeni CD44 Dekoriini HA Integriini Fibronektiinisäikeet Tyypin I kollageenisäikeet Laminiini B Tyypin IV kollageeniverkko Nidogeeni Perlekaani DG FGF FGF-reseptori BMP-reseptori BMP Wnt Tyypin XVIII kollageeni TGF-β-kompleksi Mikrofibrilli KUVA 1. A) Soluväliaineen keskeiset molekyylit ja niiden vaikutukset. Monet soluväliaineen molekyylit toimivat solujen ja kudosten tukirakenteina. Tyypin I kollageenin muodostamia paksuja ja säännönmukaisesti järjestäytyneitä säikeitä esiintyy lähes kaikkialla elimistössä lukuun ottamatta rustoa, jossa esiintyy tyypin II kollageenin muodostamia ohuempia ja epäsäännöllisesti järjestäytyneitä säikeitä. Molemmat säietyypit sisältävät myös muita kollageenityyppejä. Säikeitä päällystävät erilaiset proteoglykaanit kuten dekoriini ja biglykaani. Näille sekä muille proteogly kaaneille kuten aggrekaanille ovat ominaisia niiden proteiinirunkoon kovalenttisesti kiinnittyneet glykosaminoglykaaniketjut. Poikkeuksen muodostaa hyaluronihappo (HA), jossa ei ole proteiiniosaa. Transmembraaniproteiineihin lukeutuva tyypin XIII kollageeni on esimerkki säikeitä muodostamattomista kollageenista ja COMP (cartilage oligomeric matrix protein) keskeisistä glykoproteiineista. Solukalvolla on reseptoreita, kuten integriinit ja CD44, jotka sitovat soluväliaineen rakenteita. B) Tyvikalvojen rakenne ja soluväliaineen säätelytehtävät. Monet elimistön soluista ovat kiinnittyneet tyvikalvoihin, joiden pääkomponentit ovat verkkomaisia rakenteita muodostava tyypin IV kollageeni, toisiinsa kiinnittyvät laminiinimolekyylit, näitä molempia polymeerejä yhdistävät nidogeeni, proteoglykaanehin kuuluva perlekaani sekä tyypin XVIII kollageeni. Tyvikalvon molekyylit muokkaavat solujen toimintaa muun muassa integriini- ja dystroglykaanireseptorien kautta. Soluväliaineen molekyylit, kuten tyvikalvojen perlekaani ja tyypin XVIII kollageeni sekä useimmissa kudoksissa esiintyvät mikrofibrillit, voivat sitoa hormoneja ja kasvutekijöitä, kuten fibroblasti- (FGF) ja wingless-kasvutekijöitä (Wnt), luun morfogeneettistä proteiinia (BMP) ja transformoivaa kasvutekijää (TGF-β) sisältävää kompleksia, ja vaikuttaa näiden sitoutumiseen solukalvon reseptoreihin. Soluväliaineen molekyylit vaikuttavat solunpinnan reseptoreiden kautta solujen geeniluentaan (nuolet) Soluväliaineen tutkimuksen monet ulottuvuudet

3 ÄYRÄPÄÄN LUENTO von reseptorit sitovat soluväliaineen molekyylejä myös suoraan (KUVA 1). Solun ulkopuolelta saapuvat signaalit muokkaavat hormonien ja soluväliaineen molekyylien muodossa solujen toimintaa, ja toisaalta solu muokkaa soluväliaineen koostumusta. Soluväliaineen molekyylit ovat yleensä suuria, monesta domeenista koostuvia ja moni mutkaisia. Molekyylien välisten sidosten avulla ne usein muodostavat elimistössä liukenemattoman, lujan rakenteen. Jo kauan on tiedetty, että soluväliaineen tärkeänä tehtävänä on muodostaa kudoksia lujittavia tukirakenteita. Tätä havainnollistaa elektronimikroskooppikuva ihosta, jossa epidermiksen epiteelisolut ovat kiinnittyneet ohueen pääosin kollageenista, laminiinista, nidogeenista ja perlekaanista muodostuneeseen tyvikalvoon (KUVA 2). Tyvikalvon toisella puolella nähdään paksu dermis, jossa on siellä täällä fibroblasteja, joita soluväliaine ympäröi erittäin runsaana. Ihon soluväliaine on suurelta osin kollageenia, joka nähdään kuvassa pitkittäin tai poikittain leikkautuneina säikeinä. Soluväliaineella onkin suuri merkitys kudosten kestävyydelle ja muodolle ihon lisäksi myös luussa, jänteissä, nivelissä, verisuonissa ja kaikissa muissa elimissä, sillä se muodostaa erilaisia tukea antavia säikeitä ja kalvoja, hyytelömäisiä aineita kuten lasiaista sekä muita rakenteita. Myös useimpien kiinteiden kasvainten massasta pääosa on soluväliainetta. Tukirakennetta laajempi tehtäväkirjo on paljastunut viimeaikaisissa tutkimuksissa. Soluväliaineen molekyylit vaikuttavat monin tavoin solujen erilaistumiseen ja toiminnan säätelyyn. Soluväliaine sitoo liukoisia säätelymolekyylejä ja vaikuttaa siihen, millä tavalla solut voivat hyödyntää kasvutekijöitä, kuten fibroblastikasvutekijää FGF ja transformoivaa kasvutekijää TGF-β (KUVA 1). Tästä esimerkkinä ovat heparaanisulfaattia sisältävät proteoglykaanit, jotka ovat välttämättömiä muun muassa FGF-signaloinnissa, sillä ne stabiloivat FGF:n sitoutumisen solunpinnan reseptoriin (Ornitz 2000). Parhaiten tunnettu fibroosia edistävä kasvutekijä TGF-β puolestaan varastoituu latentissa muodossa soluväliaineessa mikrofibrillejä muodostavan fibrilliini-glykoproteiinin yhteyteen (Massam-Wu ym. 2010). Kantasolujen toimintaa ylläpitää ja säätelee turvapaikka (niche). Soluväliaineen rooli 2264 KUVA 2. Elektronimikroskooppikuva ihosta. Epidermiksen basaalisolut (EB) kiinnittyvät ohueen tyvikalvoon (nuoli). Tyvikalvon toisella puolella on dermis, jonka runsas soluväliaine koostuu pääosin kollageenisäikeistä (tähti) ja jossa nähdään soluväliaineen ympäröimiä fibroblasteja (F). Kuva: Raija Sormunen. T. Pihlajaniemi

4 kantasolujen ympäristössä on kiinnostava. Esimerkiksi tyvikalvojen keskeisiin molekyyleihin lukeutuvan laminiinin on osoitettu vaikuttavan hermoston kantasolujen kasvuun, erilaistumiseen ja liikkumiseen (Flanagan ym. 2006). Soluväliaineen elastisuus voi myös vaikuttaa kantasolujen erilaistumiseen (Engler ym. 2006). Tyvikalvot ovat evoluutiossa vanhoja rakenteita, jotka muodostavat alustan solujen kiinnittymiselle ja signaloinnille, ja näin soluväliaineen molekyylit vaikuttavat solujen erilaistumiseen ja toiminnan säätelyyn. Tyvikalvoilla on välttämätön merkitys jo sikiönkehityksen varhaisvaiheista alkaen (Tsang ym. 2010). Soluväliaineen molekyylit säätelevät myös epiteliaalisten ja mesenkymaalisten solujen vuorovaikutusta esimerkiksi kudosten muodostumisessa, tulehdustiloissa ja syövässä (Tsang ym. 2010). Kollageenien tyypit ja synteesi Aikuisessa ihmisessä on noin 4 kg kollageenia. Kollageenit ovatkin nisäkkäillä eniten esiintyvä proteiiniryhmä, joka muodostaa % elimistön kaikesta proteiinista. Kollageenia on kaikissa kudoksissa; erityisen runsaasti ihossa, luussa, rustossa, jänteissä ja verisuonten seinämissä. Kollageeneille ominainen kolmoiskierrerakenne muodostuu, kun kolmen kollageenin alfaketjut kiertyvät kestäväksi kierteeksi toistensa ympärille (Myllyharju ja Kivirikko 2004). Tämä rakenne perustuu alfaketjujen toistuvaan Gly-X-Y-aminohappojärjestykseen, jossa glysiini mahdollistaa ketjujen kiertymisen toistensa ympärille ja X-asemassa usein esiintyvä proliini sekä Y-asemassa esiintyvä hydroksiproliini stabiloivat kierteen. Kolmoiskierre on sauvamainen, mutta useissa kollageeneissa kolmoiskierre voi olla taipuisa Gly-X-Yrakenteen lyhyiden katkosten johdosta. Kollageenimolekyylin N- ja C-terminaalisissa päissä voi olla myös pallomaisia domeeneja. Kollageenin suuressa proteiiniperheessä on 28 erilaista selkärankaisten kollageenityyppiä, joita yhteensä 43 geeniä koodittaa. Kollageenimolekyyli voi koostua keskenään identtisistä alfaketjuista (homotrimeeri) tai erilaisista alfaketjuista (heterotrimeeri) (KUVA 3) (Myllyharju ja Kivirikko 2004, Gordon ja Hahn 2010). Eri kollageenityyppien kudosten jakauma vaihtelee, minkä vuoksi kudosten ominaisuudet ovat myös erilaiset. Kollageenit polymerisoituvat elimistössä ja muodostavat siten rakenteiltaan ja toiminnaltaan erilaistuneita makromolekulaarisia komplekseja. Eniten elimistössä on tyypin I kollageenia, joka muodostaa kudosanalyyseissa havaittavia säikeitä (KUVA 2). Näitä niin sanottuja tyypin I kollageenisäikeitä esiintyy lähes kaikkialla elimistössä rustoa lukuun ottamatta, ja ne sisältävät myös tyyppien III ja V kollageeneja sekä säikeiden pinnalla FACIT-kollageeneja (fibrilassociated collagens with interrupted triple helices). Rustossa puolestaan esiintyy tyypin II kollageenisäikeitä, jotka sisältävät myös tyypin XI kollageenia ja tyypin IX FACITkollageenia. Osa kollageeneista muodostaa säikeiden sijasta verkkoja ja muunlaisia rakenteita (KUVA 3). Kollageenien lisäksi kudokset sisältävät erilaisia proteoglykaaneja. Kollageenien biosynteesi soluissa on monimutkainen tapahtuma, sillä useat eri entsyymireaktiot muokkaavat kollageeniketjuja sekä synteesin aikana että sen jälkeen kun kollageenimolekyylit erittyvät solun ulkopuolelle (Myllyharju ja Kivirikko 2004). Prolyyli- 4-hydroksylaasientsyymin aiheuttama eräiden proliinitähteiden hydroksylaatio on kriittinen, sillä kollageeniketjuun muodostuvat 4-hydroksiproliinitähteet ovat kollageenin kolmoiskierteen kestävyydelle välttämättömiä. Säikeisille kollageeneille ominaisesta esimuodosta, prokollageenista, pilkkoutuu molekyylien kypsyessä N- ja C-päistä osia pois. Kollageenien synteesi tunnetaan nykyään tarkkaan, ja hyvin merkittävä osa tästä tiedosta on peräisin Oulun yliopistosta, johon professori Kari Kivirikko 1970-luvun alussa perusti kollageenien synteesiä tutkivan työryhmän. Tätä työtä jatkavat tällä hetkellä professorien Johanna Myllyharju ja Peppi Karppinen työryhmät. Kollageenitautien laaja kirjo Lukuisissa harvinaisissa perinnöllisissä sairauk sissa on osoitettu mutaatioita kollagee Soluväliaineen tutkimuksen monet ulottuvuudet

5 ÄYRÄPÄÄN LUENTO A. Säikeitä muodostavat kollageenit, I, II, III, V, XI,XXIV ja XXVII Geenit: COL1A1, COL1A2, COL2A1, COL3A1, COL5A1, COL5A2, COL5A3, COL5A4, COL11A1, COL11A2, COL24A1, COL27A1 Kolmoiskierre N-propeptidi C-propeptidi VIII X 300 nm C. Heksagonaalisia verkkoja muodostavat kollageenit VIII ja X Geenit: COL8A1, COL8A2, COL10A1 B. FACIT-kollageenien ryhmä, IX, XII, XIV, XVI, XIX, XX, XXI, XXII ja XXVI Geenit: COL9A1, COL9A2, COL9A3, COL12A1, COL14A1, COL16A1, COL19A1, COL20A1, COL21A1, COL22A1, COL26A1 D. Tyypin IV kollageenien ryhmä E. Helminauharakenne, tyypin VI kollageeni Geenit: COL4A1, COL4A2, COL4A3, COL4A4, COL4A5, COL4A6 7S Dimeeri 7S 200 nm Tetrameeri F. Ankkuroiva säie, tyypin VII kollageeni Geeni: COL7A1 VII Dimeeri 200 nm Ankkuroiva säie Tyvikalvo Ankkuroiva plakki Geenit: COL6A1, COL6A2, COL6A3 G. Transmembraanikollageenit, XIII, XVII, XXIII ja XXV Geeni: COL13A1, COL17A1, COL23A1, COL25A1 PM XIII XVII XXIII XXV IX GAG XII ja XIV H. Multipleksikollageenit, XV ja XVIII GAG GAG Geeni: COL15A1, COL18A1 XVIII XV Tyypin II säie Tyypin I säie VI Dimeeri Tetrameeri Helminauha Restiini Endostatiini KUVA 3. Nisäkkäiden 28 kollageenityyppiä jaoteltuna alaryhmiin muodostamiensa polymeeristen rakenteiden ja muiden erityispiirteiden perusteella. Kolmesta samanlaisesta kollageeniketjusta (homotrimeerit) koostuvia kollageenityyppejä koodittaa yksi geeni ja kahdesta tai useammasta erilaisesta kollageeniketjusta koostuvia kollageenityyppejä koodittaa useampi geeni. A) Säikeitä muodostavien kollageenien alaryhmä. B) Tyypin IX, XII, XIV ja XX FACITkollageenit sekä näitä muistuttavat tyypin XVI, XIX, XXI ja XXII kollageenit. C) Tyypin VIII ja X kollageenit muodostavat heksagonaalisia verkkoja. D) Tyypin IV kollageeni muodostaa verkkoja tyvikalvoissa. Se esiintyy useana isomuotona, joita koodittaa kuusi geeniä. E) Tyypin VI kollageeni muodostaa helminauhamaisia rakenteita. F) Tyypin VII kollageeni muodostaa tyvikalvoja ja sidekudosta yhdistäviä ankkuroivia säikeitä. G) Transmembraanikollageeneilla on solunsisäinen osa, plasmamembraanin (PM) läpäisevä domeeni sekä solunulkoinen kolmoiskierteisiä rakenteita sisältävä osa. H) Tyypin XV ja XVIII kollageeneja kutsutaan multipleksiineiksi (multiple triple helices with interruptions). Niiden N-terminaalisessa päässä on glykosaminoglykaaniketjuja (GAG) ja C-terminaalisessa päässä antiangiogeneettista endostatiini- tai restiini-domeenia. Kuvasta puuttuu vain kaksi lyhyttä kolmoiskierteistä jaksoa sisältävä tyypin XXVI kollageeni, joka ei rakenteeltaan sovi edellä esitettyihin alaryhmiin sekä tyypin XXVIII kollageeni, joka muistuttaa tyypin VI kollageenia fylogeneettisesti, mutta sen muodostamista rakenteista kudoksissa ei ole tietoa. Kuvaa on muokattu ja se julkaistaan alkuperäisen julkaisijan luvalla (Myllyharju ja Kivirikko 2004). FACIT = fibril-associated collagens with interrupted helices 2266 nien geeneissä tai niiden valmistumiseen liittyvissä vaiheissa (TAULUKKO), mutta on myös yleisiä sairauksia, joissa kollageenivirheet altistavat taudille. Tyypin I kollageenin mutaatioita on tutkittu pisimpään, ja on osoitettu, että tämän kollageenin puutos tai rakennevirhe useimmiten johtaa osteogenesis imperfectaan eli synnynnäiseen luutumisvajaukseen, jossa potilailla on hauraat ja herkästi murtuvat luut (Marini ja Blisset 2013). Tämä kollageeni T. Pihlajaniemi

6 TAULUKKO. Kollageenigeenien mutaatioista johtuvia perinnöllisiä sairauksia (Ricard-Blum 2012). Kollageenityyppi Geeni Sairaus I COL1A1, COL1A2 Osteogenesis imperfecta I COL1A2 Ehlers Danlosin oireyhtymä II COL2A1 Dysplasia spondylometaphysialis Dysplasia spondyloepimetaphysialis Akondrogeneesi Hypokondrogeneesi Kniestin ja Sticklerin oireyhtymät III COL3A1 Ehlers Danlosin oireyhtymä IV COL4A1 Familiaalinen porenkefalia Perinnöllinen angiopatia, johon liittyy nefropatiaa, aneurysmia ja kramppeja (HANAC-oireyhtymä) IV COL4A3 Alportin oireyhtymä IV COL4A4 Hyvänlaatuinen familiaalinen hematuria IV COL4A5 Alportin oireyhtymä IV COL4A6 Leiomyomatoosi V COL5A1, COL5A2 Ehlers Danlosin oireyhtymä VI COL6A1 Bethlemin myopatia VI COL6A2, COL6A3 Ulrichin synnynnäinen lihasdystrofia VII COL7A1 Dystrofinen epidermolysis bullosa VIII COL8A2 Sarveiskalvon endoteliaalinen dystrofia IX COL9A1, COL9A Multippeli epifysiaalinen dysplasia IX COL9A3 Multippeli epifysiaalinen dysplasia Autosominen peittyvä Sticklerin oireyhtymä X COL10A1 Schmidin metafyseaalinen kondrodysplasia XI COL11A1 Sticklerin ja Marshallin oireyhtymät XI COL11A2 Sticklerin ja Marshallin oireyhtymät Otospondylomegaepifysiaalinen dysplasia Kuurous XVII COL17A1 Junktionaalinen epidermolysis bullosa XVIII COL18A1 Knoblochin oireyhtymä koostuu kahdesta proα1(i)-ketjusta ja yhdestä proα2(i)-ketjusta. Näitä koodaavasta kahdesta geenistä on löydetty yli 800 erilaista mutaatiota. Valta osa mutaatioista johtaa yhden aminohapon muutokseen, yleensä jonkin kolmoiskierteen toistuvan glysiinin vaihtumiseen toiseksi aminohapoksi, minkä seurauksena muodostuva kollageeni on viallista. Tällainen vähäiseltä tuntuva muutos noin aminohapon suuruisessa molekyylissä voi johtaa kuolemaan sikiökehityksen tai syntymän aikana. Sen sijaan mutaatiot, jotka johtavat määrältään vähentyneeseen mutta rakenteeltaan normaaliin kollageenin muodostumiseen (yleensä ennen aikaisen lopetuskodonin aiheuttavat mutaa tiot) johtavat yleensä lievempään taudinkuvaan. Toisaalta on yleisiä hankinnaisia tauteja, joissa kollageenien aineenvaihdunnassa on muutoksia. Monet krooniset sairaudet johtavat fibroosin muodostumiseen. Siinä elimistön paranemisprosessi on häiriintynyt siten, että fibroblastit aktivoituvat ja tuottavat vaurioituneeseen kudokseen ylen määrin kollageenia ja muita soluväliaineen molekyylejä (Zeisberg ja Kalluri 2012). Fibroosin muodostuminen liittyy usein maksan, munuaisten, keuhkojen, ihon ja sydämen sairauksiin ja voi johtaa parenkyymisolujen toiminnan tuhoutumiseen ja elimen toiminnan lakkaamiseen. Kollageenin puute voi olla myös hankittu tila, josta esimerkkinä on keripukki. Kollageenin synteesissä tarvitaan C-vitamiinia prolyyli-4-hydroksylaasin katalysoimassa reaktiossa. Keripukki 2267 Soluväliaineen tutkimuksen monet ulottuvuudet

7 ÄYRÄPÄÄN LUENTO 2268 YDINASIAT 88Soluväliaineen molekyylit säätelevät elinten kehitystä ja ylläpitävät elimistön homeostaasia sekä ovat osallisina kaikissa tautiprosesseissa. 88Soluväliaine koostuu noin 300:sta kollageenien, proteoglykaanien ja glykoproteiinien muodostamasta molekyylistä. 88Kollageenit ovat nisäkkäillä eniten esiintyvä proteiiniryhmä ja muodostavat % elimistön proteiinista. 88Nisäkkäillä on 28 erilaista kollageenityyppiä, joiden määrä, rakenne, esiintyminen kudoksissa ja tehtävät vaihtelevat suuresti. 88Kolmentoista kollageenityypin osalta on tähän mennessä kuvattu geenivirheitä perinnöllisissä ihmisen taudeissa, joiden kliininen kirjo on laaja. 88Kollageenivaihdunnan häiriöt liittyvät moniin hankittuihin tauteihin, kuten fibrooseihin. johtuu vakavasta C-vitamiinin puutteesta ja taudille ominaiset sidekudosvauriot johtuvat puutteellisesti hydroksyloituneesta toiminnallisesti viallisesta kollageenista. Tutkimussovelluksia kollageenien synteesistä hypoksian säätelyyn Perinnöllisten kollageenitautien tutkimuksen saavutuksia voidaan soveltaa sikiö- ja kantajadiagnostiikassa, mutta mutaatioiden yksilöllisyys ja geenien suuri koko vaikeuttavat näitä analyyseja. Spesifisiä hoitoja pyritään kehittämään myös näille taudeille, mutta tulokset ovat toistaiseksi olleet niukkoja. Uudet lähestymistavat, kuten kantasolujen siirrot ja mikro RNApohjaiset tekniikat, johtanevat kuitenkin edistysaskeliin hoitojen kehittämisessä. Tästä antavat viitteitä peittyvää dystrofista epidermolysis bullosaa sairastavilla potilailla tehdyt kokeet, joissa tyypin VII kollageeniruiskeita ja allogeenisten kantasolujen siirtoja on kokeiltu taudin oireiden lievittämiseksi (Uitto ym. 2012). Prolyyli-4-hydroksylaasi, kollageenin biosynteesin keskeinen entsyymi, on noussut tutkimuksen keskiöön. Hypoksian vaikutuksesta indusoituva tekijä (HIF) on elimistön happitasapainon tärkeä säätelijä ja lääketieteellisesti kiinnostava, sillä sen aktiivisuuden lisääminen voi auttaa vaikeiden anemioiden ja iskeemisten tautitilojen hoitamisessa. HIF-proliinihydroksylaasi säätelee HIF:n aktiivisuutta sen alfa-alayksikön hydroksylaatiolla. Kun happipitoisuus on suuri, HIF:n alfa-alayksikön eräät proliinitähteet hydroksyloituvat, ja näin muokkautunut proteiini hajoaa solussa. Mikäli happipitoisuus on pieni, HIF-prolyylihydroksylaasi ei kykene hydroksyloimaan alfa-alayksikköä, ja muodostuu stabiili, monien geenien luentaa aktivoiva HIF-transkriptiotekijä (Ivan ym. 2001, Jaakkola ym. 2001). HIF-prolyylihydroksylaasit kuuluvat samaan entsyymiperheeseen kollageenien prolyylihydroksylaasien kanssa. Tämä säätelymekanismi on tehnyt mahdolliseksi kehittää pienimolekyylisiä yhdisteitä, jotka stabiloivat HIF:ää mekanismilla, joka hyödyntää tietämystä kollageeneja muokkaavan prolyyli- 4-hydroksylaasin reaktiomekanismista ja aktiivisuuden säätelystä (Myllyharju 2013). Biomateriaalien valmistuksessa kollageenia voidaan hyödyntää muun muassa iho-, luu-, jänne-, rusto- ja verisuoni-istutteissa. Eläinperäisistä lähteistä eristettävään kollageeniin liittyy monia ongelmia, kuten materiaalin saatavuus, lajieroista johtuvien yliherkkyysreaktioiden mahdollisuus sekä patogeenien aiheuttama materiaalin kontaminoituminen. Näiden seikkojen takia kehitimme geeniteknisen menetelmän, jolla voidaan tuottaa hiivasoluissa suuria määriä ihmisen kollageenia (Vuorela ym. 1997). Tässä kehitystyössä muokkasimme hiivasolut tuottamaan aktiivista ihmisen prolyyli-4-hydroksylaasia (KUVA 4), jonka katalysoima proliinitähteiden hydroksylaatio kollageeniketjuissa on välttämätöntä rakenteeltaan kestävän kolmoiskierteisen kollageenin muodostumiselle. Lisäksi veimme hiivasoluihin ihmisen kollageenia koodittavia geenejä ja pystyimme tuottamaan viljellyissä soluissa suuria määriä ihmisen kollageenia. Geeniteknisesti tuotettu kollageeni muodostaa säikeitä samalla tavalla kuin elimistön oma kollageeni. T. Pihlajaniemi

8 Geeniteknisesti tuotettua kollageenia voidaan käyttää moniin lääketieteellisiin sovelluksiin, joista mielenkiintoinen esimerkki on ruotsalaistutkijoiden hiljattain julkaisema kiintoisa potilaskoe (Fagerholm ym. 2009). Siinä ihmisen tyypin III rekombinanttikollageenista tehtiin keinotekoinen sarveiskalvo, jota käytettiin ihmisestä peräisin olevan kudossiirteen sijasta korvaamaan potilaiden sameita sarveiskalvoja. Kaksi vuotta kestäneessä seurannassa siirteet pysyivät kirkkaina. Keinotekoiseen siirteeseen kasvoi morfologisesti normaalilta näyttävä epiteeli, ja myös hermotus kasvoi uudelleen. Etuna kudossiirteeseen verrattuna oli se, että keinotekoinen materiaali ei aiheuttanut hylkimisreaktiota. Onkin odotettavissa, että rekombinanttikollageenipohjaisia biomateriaaleja tullaan käyttämään kudosten uusiutumisen edistämiseksi erilaisissa elinvaurioissa, mahdollisesti yhdistettynä sopiviin kantasoluihin. A B Prolyyli-4- hydroksylaasi OH Hiivasolu Kollageeniketjut OH OH OH OH OH OH OH Mihin tarvitaan vanhoja kollageeneja? C Työryhmäni on löytänyt kolme nisäkkäillä tavattavista kollageeneista: tyypin XIII, joka on osoittautunut koko solukalvon läpäiseväksi transmembraaniproteiiniksi sekä tyypit XV ja XVIII, jotka muodostavat oman alaryhmänsä kollageenien joukossa (KUVAT 1 ja 3). Nämä kolme lukeutuvat niiden harvojen kollageenien joukkoon, jotka ovat säilyneet evoluutiossa elimistölle keskeisten tehtäviensä takia. Esimerkiksi Caenorhabditis elegans -sukkulamadolla on runsaat 150 kollageenigeeniä, mutta näistä nisäkkäiden kollageeneja muistuttavat ainoastaan tyyppien IV, XIII, XV ja XVIII kanssa samanlaiset geenit (Hynes 2012). Tyypin XIII kollageenin mutaatioista johtuvia tauteja ihmisellä ei ole vielä kuvattu. Geneettisesti muokatuilla hiirillä tehtyjen tutkimusten perusteella on selvinnyt, että tämä kollageeni on tarpeen hermo-lihasliitoksen muodostumisessa sekä luurankolihasten toiminnassa (Latvanlehto ym. 2010). Tyypin XIII kollageenia esiintyy myös luussa, jossa sen liiallinen määrä johtaa huomattavaan liikakasvuun (Heikkinen ym. 2012). 200 nm KUVA 4. Ihmisen rekombinanttikollageenin tuottaminen Pichia pastoris -hiivasoluissa. A) Hiivasoluihin on viety ihmisen kollageenia koodittava geeni. Siitä syntyvä kollageeni ei muodosta 37 C:ssa kestäviä kolmoiskierrerakenteita. B) Hiivasoluihin on viety ihmisen kollageenia koodittavan geenin lisäksi ihmisen prolyyli-4-hydroksylaasin alfa- ja beeta-alayksiköitä koodittavat geenit. Hiivasolut tuottavat tämän muokkauksen seurauksena aktiivista prolyyli-4-hydroksylaasin tetrameeriä, jonka katalysoiman proliinitähteiden hydroksylaation seurauksena muodostunut kollageeni on stabiilia 37 C:ssa. C) Hiivasoluista eristetty ihmisen rekombinanttikollageeni muodostaa säikeitä, jotka ovat rakenteeltaan kudoksista eristetyn kollageenin kaltaisia. Elektronimikroskooppikuva (Baez ym. 2005) julkaistaan alkuperäisjulkaisijan luvalla. Tyypin XVIII kollageenin C-terminaalisessa päässä on endostatiiniksi kutsuttu domeeni, jonka on osoitettu estävän tehokkaasti verisuonten muodostumista ja tuumoreiden 2269 Soluväliaineen tutkimuksen monet ulottuvuudet

9 ÄYRÄPÄÄN LUENTO 2270 kasvua koe-eläimillä (O Reilly ym. 1997). Tämän domeenin vaikutuksia tuumoreiden kasvuun on tutkittu myös kliinisissä kokeissa, mutta vaikutukset ovat olleet vähäisiä (Seppinen ja Pihlajaniemi 2011). Toisaalta on esitetty, että suurentunut endostatiinipitoisuus voi suojata syövältä. Down-potilailla, joilla on kromosomin 21 trisomia ja siten ylimääräinen kopio tyypin XVIII kollageenin geenistä sekä 1,6-kertainen pitoisuus endostatiinia verenkierrossaan, on muuta väestöä vähemmän kiinteitä kasvaimia (Folkman 2007). Omissa kokeissamme olemme havainneet endostatiinin ehkäisevän tehokkaammin imusuonten kuin verisuonten muodostumista kokeellisessa ihosyövässä (Brideau ym. 2007), ja onkin mahdollista, että uudet tutkimukset tarkentavat käsitystämme tyypin XVIII kollageenin ja sen endostatiinin merkityksestä syövässä. Tyypin XVIII kollageenin geenimutaatioi den on osoitettu aiheuttavan Knoblochin oire yhtymän, jota sairastavilla potilailla on lasiaisen ja verkkokalvon rappeuma, muutoksia silmän etuosassa sekä osalla myös takaraivossa enkefaloseele (Sertié ym. 2000, Khan ym. 2012). Poistogeenisillä hiirillä tehdyt tutkimukset vahvistavat tämän kollageenin välttämättömyyden silmien normaalille kehittymiselle (Fukai ym. 2002, Ylikärppä ym. 2003). Tyypin XVIII kollageenia on kaikkialla elimistön tyvikalvoissa, ja hiirillä, joilla on tietty geneettinen tausta, tämän kollageenin puutos altistaa ne vesipään kehittymiselle (Utriainen ym. 2004). Tyypin XVIII kollageeni vaikuttaa myös elimistön metaboliaan, sillä sen puutos johtaa hyperlipidemiaan (Bishop ym. 2010). Omien tutkimuksiemme mukaan tyypin XVIII kollageeni on myös tarpeen rasvasolujen kehittymiselle. On myös osoitettu, että endo statiini on osallisena pikkuaivojen hermo synapsien muodostumisessa ja että kollageenin puutos altistaa hiiret maksan toiminnan häiriöille (Su ym. 2012, Duncan ym. 2013). Tyypin XV kollageeni on rakenteeltaan hyvin samantapainen kuin tyypin XVIII, mutta tehtäviltään se on täysin erilainen, sillä sen puutos aiheuttaa hiirillä luurankolihaksen häiriöitä, sydämen toiminnan muutoksia ja verisuonten heikkoutta (Eklund ym. 2001, Rasi ym. 2010). Kiintoisia ovat havainnot, joiden mukaan tällä kollageenilla on syöpämalleissa tuumorisuppressiivisia vaikutuksia (Mutolo ym. 2012). Mitä meidän pitäisi vielä oppia soluväliaineesta? Toistaiseksi tiedämme vasta 13 kollageenin osalta, minkälaisia tauteja niiden geeneissä olevat virheet voivat aiheuttaa. Nisäkkäiden 15 muun kollageenin yhteyksiä ihmisen sairauksiin löydetään varmasti, joten kollageenitautien lista kasvanee entistä mittavammaksi. Fibroottiset muutokset johtavat vakaviin häiriöihin monissa kroonisissa sairauksissa, ja olisi suuri lääketieteellinen edistysaskel, jos voitaisiin kontrolloida kollageenin liiallista kertymistä maksakirroosissa, keuhkofibroosissa ja monia muita elimiä tuhoavissa tiloissa. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kollageeneissa ja eräissä muissa solu väliaineen molekyyleissä on domeeneja, jotka voidaan proteolyyttisesti irrottaa ja jotka sen jälkeen voivat säädellä erilaisia biologisia prosesseja, kuten verisuonten muodostusta. Näiden matrikryptiineiksi kutsuttujen domeenien merkityksen ymmärtäminen on välttämätöntä normaalien biologisten prosessien ymmärtämiseksi, ja niillä saattaa olla diagnostista ja hoidollista merkitystä (Ricard-Blum 2012). Kollageeneihin kohdistuu eniten erilaisia translaationjälkeisiä muokkausreaktioita. On mielenkiintoista, että aiemmin kollageeneille ominaisena pidettyä proliinitähteiden hydroksylaatiota hyödynnetään täysin toisenlaisessa tehtävässä elimistön hypoksiavasteen säätelyssä. Havaintojemme mukaan syvällinen ymmärrys yhdestä kohteesta, tässä tapauksessa kollageenien biosynteesistä, on nopeasti sovellettavissa täysin toisenlaiseen aiheeseen ja jopa niin, että uusia lääkkeitä voidaan sen myötä odottaa kehitettävän. Lopuksi Oulun yliopistossa toimii vuosina solujen ja soluväliaineen tutkimuksen huippuyksikkö. Tutkimme solujen ja soluväliaineen vuorovaikutusta elinten kehityksessä, kanta- T. Pihlajaniemi

10 solujen ylläpidossa ja erilaistumisessa sekä kudosten tasapainossa ja mekaanisessa säätelyssä. Selvitämme tautimekanismeja eräissä verisuoni-, luu- ja hermosairauksissa sekä syövän synnyssä. Ideanamme on yhdistää kuuden tutkimusryhmän osaaminen elinten kehityksen ja toiminnan avainmolekyylien tunnistamisesta, kudosten happiosapaineen säätelystä, soluväliaineen molekyylien ja niiden solureseptoreiden vaikutuksesta sekä DNA:ssa solujen hyvinvointiin ja uusiutumistasapainoon vaikuttavien muutosten tutkimuksesta niin, että monia ainutlaatuisia soluviljely- ja eläinmalleja hyödynnetään uudella tavalla. Pyrimme ymmärtämään, miten nämä kaikki osa-alueet yhdessä vaikuttavat kudoksissa. Uskomme löytävämme uusia tapoja hyödyntää kantasoluja ja soluväliaineen molekyylejä kudosterapioissa. Kehitämme myös uusia työkaluja rintasyövän seulontaan ja tunnistamme uusia tautimekanismeja. Tulokset mahdollistavat uusien diagnostisten menetelmien ja hoitokäytäntöjen kehittämisen. * * * Kiitän professori Johanna Myllyharjua, dosentti Raija Sormusta ja tytärtäni Sini Korhosta avusta kuvien tekemisessä. TAINA PIHLAJANIEMI, LKT, professori Oulun yliopisto, biolääketieteen laitos SIDONNAISUUDET Ei sidonnaisuuksia KIRJALLISUUTTA Baez J, Olsen D, Polarek JW. Recombinant microbial systems for the production of human collagen and gelatin. App Microbiol Biotechnol 2005;69: Bishop JR, Passos-Bueno MR, Fong L, ym. Deletion of the basement membrane heparan sulfate proteoglycan type XVIII collagen causes hypertri glyceridemia in mice and humans. PLoS One 2010;5:e Brideau G, Mäkinen MJ, Elamaa H, ym. Endostatin overexpression inhibits lymphangiogenesis and lymph node metastasis in mice. Cancer Res 2007;67: Duncan MB, Yang C, Tanjore H, ym. Type XVIII collagen is essential for survival during acute liver injury in mice. Dis Model Mech 2013;6: Eklund L, Piuhola J, Komulainen J, ym. Lack of type XV collagen causes a skeletal myopathy and cardiovascular defects in mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2001;98: Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, Discher DE. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell 2006;126: Fagerholm P, Lagali NS, Merrett K, ym. Biosynthetic alternative to human donor tissue for inducing corneal regeneration: 24-month follow-up of a phase 1 clinical study. Sci Transl Med 2009;2: Flanagan LA, Rebaza LM, Derzic S, Schwartz PH, Monuki ES. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J Neurosci Res 2006;83: Folkman J. Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery? Nat Rev Drug Discover 2007;6: Fukai N, Eklund L, Marneros AG, ym. Lack of collagen XVIII/endostatin results in eye abnormalities. EMBO J 2002;21: Gordon MK, Hahn RA. Collagens. Cell Tissue Res 2010;339: Heikkinen A, Tu H, Pihlajaniemi T. Collagen XIII: a type II transmembrane protein with relevance to musculoskeletal tissues, microvessels and inflammation. Int J Biochem Cell Biol 2012;44: Hynes RO. The evolution of metazoan extracellular matrix. J Cell Biol 2012;196: Ivan M, Kondo K, Yang H, ym. HIFalpha targeted for VHL-mediated destruction by proline hydroxylation: implications for O2 sensing. Science 2001;292: Jaakkola P, Mole DR, Tian YM, ym. Targeting of HIF-alpha to the von Hippel- Lindau ubiquitylation complex by O2- regulated prolyl hydroxylation. Science 2001;292: Khan AO, Aldahmesh MA, Mohamed JY, Al-Mesfer S, Alkuraya FS. The distinct ophthalmic phenotype of Knobloch syndrome in children. Br J Ophthalmol 2012;96: Latvanlehto A, Fox MA, Sormunen R, ym. Muscle-derived collagen XIII regulates maturation of the skeletal neuromuscular junction. J Neurosci 2010;30: Marini JC, Blissett AR. New genes in bone development: what s new in osteogenesis imperfecta. J Clin Endocrinol Metab 2013;98: Massam-Wu T, Chiu M, Choudhury R, ym. Assembly of fibrillin microfibrils governs extracellular deposition of latent TGF beta. J Cell Sci 2010;123: Myllyharju J. Prolyl 4-hydroxylases, master regulators of the hypoxia response. Acta Physiol (Oxf) 2013;208: Myllyharju J, Kivirikko KI. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends Genet 2004;20: Mutolo MJ, Morris KJ, Leir SH, ym. Tumor suppression by collagen XV is independent of the restin domain. Matrix Biol 2012;31; Naba A, Clauser KR, Hoersch S, Liu H, Carr SA, Hynes RO. The matrisome: in silico definition and in vivo characterization by proteomics of normal and tumor extracellular matrices. Mol Cell Proteomics 2012;11:M O Reilly MS, Boehm T, Shing Y, ym. Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997;88: Ornitz DM. FGFs, heparan sulfate and FGFRs: complex interactions essential for development. Bioessays 2000;22: Rasi K, Piuhola J, Czabanka M, ym. Collagen XV is necessary for modeling of the extracellular matrix and its deficiency predisposes to cardiomyopathy. Circ Res 2010;107: Soluväliaineen tutkimuksen monet ulottuvuudet

11 ÄYRÄPÄÄN LUENTO Ricard-Blum S. The collagen family. Kirjassa: Hynes RO, Yamada KM, toim. Extracellular matrix biology. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012, s Seppinen L, Pihlajaniemi T. The multiple functions of collagen XVIII in development and disease. Matrix Biol 2011; 30: Sertié AL, Sossi V, Camargo AA, Zatz M, Brahe C, Passos-Bueno MR. Collagen XVIII, containing an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth, plays a critical role in the maintenance of retinal structure and in neural tube closure (Knobloch syndrome). Hum Mol Genet 2000;9: Su J, Stenbjorn RS, Gorse K, ym. Target-derived matricryptins organize cerebellar synapse formation through α3β1 integrins. Cell Rep 2012;2: Tsang KY, Cheung MCH, Chan D, Cheah KSE. The developmental roles of the extracellular matrix: beyond structure to regulation. Cell Tissue Res 2010; 339: Uitto J, Christiano AM, McLean WH, McGrath JA. Novel molecular therapies for heritable skin disorders. J Invest Dermatol 2012;132: Utriainen A, Sormunen R, Kettunen M, ym. Structurally altered basement membranes and hydrocephalus in a type XVIII collagen deficient mouse line. Hum Mol Genet 2004;13: Vuorela A, Myllyharju J, Nissi R, Pihlajaniemi T, Kivirikko KI. Assembly of human prolyl 4-hydroxylase and type III collagen in the yeast Pichia pastoris: formation of a stable enzyme tetramer requires coexpression with collagen and assembly of a stable collagen requires coexpression with prolyl 4-hydroxylase. EMBO J 1997;16: Ylikärppä R, Eklund L, Sormunen R, ym. Lack of type XVIII collagen results in anterior ocular defects. FASEB J 2003;17: Zeisberg M, Kalluri R. Cellular mechanisms of tissue fibrosis. 1. Common and organ-specific mechanisms associated with tissue fibrosis. Am J Physiol Cell Physiol 2013;304: Summary Many dimensions of extracellular matrix research In addition to the important structural function in supporting tissues, extracellular matrix regulates the responses of cells to their environment during development, cellular division, maturation and differentiation, migration of cells from one site to another, in the homeostasis of the body and in cancer cell invasion. An essential group of extracellular matrix molecules, the matrisome, is formed by approximately 300 molecules that can be grouped into collagens, proteoglycans and glycoproteins. Information obtained from the synthesis of collagens and gene defects can be utilized in the development of diagnostics and treatment methods for hereditary diseases T. Pihlajaniemi