Histokemia ja histologinen valmiste. Pertti Panula Biolääketieteen laitos 2013

Transkriptio

1 Histokemia ja histologinen valmiste Pertti Panula Biolääketieteen laitos 2013

2 Mittakaavat: Alberts 5; s580 makroanatomia, mikroanatomia eli histologia, Silmä(lasit) Luuppi Valomikroskooppi solubiologia, molekyylibiologia, kemia, Valomikroskooppi EM-skooppi EM-skooppi (atomifysiikka) (hiukkasfysiikka) EM-skooppi Biokemia Kemia

3 Valomikroskooppinen histologinen kudostutkimus on edelleen tärkein patologian alan diagnostinen menetelmä Maksakudosta immunohistokemia, in situ hybridisaatio, elektronimikroskopia täydentävät ja tarkentavat diagnostiikkaa

4 Näytetyyppejä Traditionaalinen kudosbiopsia Leikataan irti pala kudosta Ohut- ja paksuneulabiopsiat Endoskooppisesti otetut kudosnäytteet Barretin ruokatorvi (metaplasia) Sivelyvalmisteet Papa-näyte

5 Histologinen valmiste Viljelty solu valomikroskoopissa Sama solu vaihevastakohta valomikroskoopissa Sama interferenssi (Nomarski)-optiikalla Solu ilman värjäystä ilman värjäystä ilman värjäystä Lähde: Alberts Solun ääriviivat erottuvat vaivoin. Solun sisällä erottuu vain jokunen jyvänen Solun ja tuman ääriviivat erottuvat selvästi. Sytoplasman rakenteita erotettavissa. Samat asiat erottuvat, mutta muodostavat korkokuvan. Elintä tai kudospalaa ei voi tarkastella sellaisenaan solukerrokset projisioituvat päällekkäin. Ratkaisu: Tehdään ohut leike ja värjätään se histologinen valmiste. Tässä kasvin juuren kärjen poikkileikkaus.

6 Histologisen näytteen valmistaminen 1) Kiinnittäminen - formaliiniliuos yleisin - jotta kudos kestäisi jatkokäsittelyt 2) Leikkaamisen valmistelu kudoksen kovettaminen pehmeää kudosta ei voi leikata, parafiini kovettaa kudoksen - jäädyttämällä dehydraatio saadaan - alkoholisarja kudos kovetetuksi (50%,70%, ilman 95%, alkoholia, abs, abs) xyleeniä paraffiinivalu ja parafiinia - ksyleenin jääleiketekniikka kautta on lisäksi nopea 3) Leikkaaminen mikronia

7 Histologisen näytteen valmistaminen 1) Kiinnittäminen - formaliiniliuos yleisin 2) Leikkaamisen valmistelu kudoksen kovettaminen pehmeää kudosta ei voi leikata, parafiini kovettaa kudoksen - jäädyttämällä saadaan kudos kovetetuksi ilman alkoholia, xyleeniä ja parafiinia jääleiketekniikka on lisäksi nopea 3) Leikkaaminen mikronia

8 Leikkaaminen Kuva: Karppinen

9 LEIKE, vielä ryppyinen Kuva: Karppinen

10 Histologisen näytteen valmistaminen 1) Kiinnittäminen - formaliiniliuos yleisin - jotta kudos kestäisi jatkokäsittelyt 2) Leikkaamisen valmistelu kudoksen kovettaminen pehmeää kudosta ei voi leikata, parafiini kovettaa kudoksen dehydraatio - alkoholisarja (50%,70%, 95%, abs, abs) paraffiinivalu - ksyleenin kautta 3) Leikkaaminen mikronia 4) Värjäyksen valmistelu = parafiinin poisto ksyleenillä ja vesiliuokseen vienti (käänteinen alkoholisarja), koska parafiini estää värin tarttumisen 5) Värjääminen tapahtuu yleensä vesiliuoksessa - esim. hematoksyliini-eosiini (HE) 6) Kestovalmisteen teko - näyte päällystetään peitinlasilla

11 Värjääminen Värjääminen voidaan tehdä joko käsin (vieressä) tai automaatilla (alla). Parafiini liuotetaan ensin pois ksyleenissä. Kuva:

12 Histologinen värjäys (HE) 1) Hematoksyliini on sininen väriaine. Se käyttäytyy värjäysliuoksessa kuin emäksinen väriaine, joka ionisoituu vesiliuoksessa positiiviseksi ioniksi (kationi) Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + 2) Kudoksessa erityisesti DNA ja RNA (sekä happamat yhdisteet) varautuvat negatiivisesti luovutettuaan vesiliuoksessa H + :n DNA RNA

13 Histologinen värjäys (HE) 1) Hematoksyliini on sininen väriaine. Se käyttäytyy värjäysliuoksessa kuin emäksinen väriaine, joka ionisoituu vesiliuoksessa positiiviseksi ioniksi (kationi) Väri + Väri + Väri + Väri + Väri + 2) Kudoksessa erityisesti DNA ja RNA (sekä happamat yhdisteet) varautuvat negatiivisesti luovutettuaan vesiliuoksessa H + :n 3) Positiivisesti varautuneet hematoksyliini-ionit sitoutuvat kudoksen negatiivisiin varauksiin 4) Näytteessä DNA ja RNA värjäytyvät siis hematoksyliinilla, emäksisellä värillä basofiilisesti Tässä näytteessä tumat värjäytyvät basofiilisesti Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri DNA Väri Väri Väri RNA Väri Väri Väri Väri Väri Väri + Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Väri Kerr: Atlas of Functional Histology. 1st edition, 1999 Mosby

14 Nucleolus on tumma Tuman rakenteita H = Heterokromatiini on tummaa E = Eukromatiini on vaaleaa Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby TEMkuva

15 Nisslin jyväset Valomikroskoopissa ribosomikertymät (rer) erottuvat basofilisinä läiskinä, Nisslin jyväsinä Neuronilla on vahvasti kehittynyt RER, jossa valtava määrä ribosomeja Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Lähde: J.F.Kerr, Atlas of Functional Histology

16 Histologinen värjäys (HE) 1) Eosiini on punainen väriaine. Se on hapan väriaine, joka ionisoituu negatiiviseksi ioniksi (anioni) 2) Kudoksen proteiinien aminoryhmät varautuvat vesiliuoksessa positiivisesti. Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini - Eosiini Eosiini- - Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiini - Eosiini -Eosiini - Eosiini- Eosiini - Eosiini- Eosiini- Eosiini- Eosiinip r o t e i + i n i Heikki Hervonen HY, BLL, 2004

17 Histologinen värjäys (HE) 1) Eosiini on punainen väriaine. Se on hapan väriaine, joka ionisoituu negatiiviseksi ioniksi (anioni) Eosiini - Eosiini - Eosiini- Eosiini- Eosiini- 2) Kudoksen proteiinien aminoryhmät varautuvat Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini vesiliuoksessa positiivisesti. + p r o t e i i + Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini n i Eosiini 3) Negatiivisesti varautunut eosiini sitoutuu kudoksen positiivisiin varauksiin (erik. proteiineihin) - mm.kollageenisäiket ja sytoplasmiset tukirankasäikeet + Eosiini Eosiini + + Eosiini + Eosiini Eosiini Eosiini Eosiini 4) Näytteessä siis proteiinit värjäytyvät eosinofiilisesti (=asidofiiisesti) Tässä lihassolun proteiinit värjäytyvät eosiinilla punaiseksi Tumat hematoksyliinilla siniseksi. Kerr: Atlas Heikki of Functional Hervonen HistologyHY, 1999, BLL, Mosby 2004

18 Proteiinipitoinen sytoplasma värjäytyy yleensä eosinofiilisesti Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Hikirauhassolujen sytoplasma värjäytyy voimakkaan eosinofiilisesti Mahan limakalvon epitelisolujen ja rauhassolujen sytoplasma värjäytyy voimakkaan eosinofiilisesti

19 Sileälihassoluja HE-värjäyksessä. Proteiinirikas sytoplasma näkyy homogeenisen punaisena, kun taas perifeeriset tumat hematoksyliinillä sinertävinä Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

20 Myös soluväliaineen proteiinit, tässä kollageeni, värjäytyvät eosiinilla Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Edellinen kuva Kollageenisyiden välissä olevat fibroblastien tumat värjäytyvät kuvassa basofiilisesti

21 Haiman eksokriininen solu Miten tämä solu värjäytyy HE-värjäyksessä??? Eriterakkuloissa on proteiineja - solun kärkiosa värjäytyy siis.? Tuman ympärillä on runsaasti RER:a solun tyviosa värjäytyy siis.? Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

22 Haiman eksokriininen solu Eriterakkuloissa on proteiineja - solun kärkiosa värjäytyy siis eosinofiilisesti Tuman ympärillä on runsaasti RER:a, solun tyviosa värjäytyy siis basofiilisesti

23 Eksokriinisen haiman rauhasrakenne Basofiilinen karkeapintainen endoplasmakalvosto (RER, ribosomeja!) ja eosinofiiliset eritejyväset (proteiineja) Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby Heikki Hervonen HY, BLL, 2004

24 Rasvapisarat ovat liuenneet pois tavallisesta näytteestä Rasvasolun sytoplasma erottuu ohuena juosteena kadonneen rasvapisaran ympärillä. Erikoismenetelmillä rasva saadaan säilymään ja voidaan värjätä = triglyseridejä Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby N = rasvasolun tuma Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

25 Histokemia ja entsyymihistokemia Histokemialliset värjäykset: PAS-värjäykset hiilihydraateille, Alcian-Blue happamille mukopolysakkarideille, hopesuoloihin perustuvat värjäykset retikuliinisäikeille ja hermosoluille Entsyymihistokemiassa käytetään hyväksi solujen omia, hajottavia entsyymeitä, jotka saadaan näkyviksi: entsyymien substraattina käytetään tällöin metallisuoloja, jotka hajotessaan jäävät paikalleen sakkana ja näkyvät mikroskoopissa

26 Hiilihydraatit eivät värjäydy hematoksyliini-eosiini-värjäyksellä Pikarisolujen erite (hiilihydraatteja) näyttäytyy epiteelin värjäytymättömänä alueena Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

27 PAS-värjäys on histokemiallinen värjäysmenetelmä hiilihydraateille PAS-värjäys värjää myös glycokalyksin ja tyvikalvon glykoproteiinit PAS värjäys värjää pikarisolun eritteen kirkkaan punaiseksi PAS = PeriodicAcid- Schiff eli perjodihappo-schiff Kerr: Atlas of Functional Histology 1999, Mosby

28 Immunohistokemia Kuva: Minna Takkunen: Epithelialmesenchymal transition in oral squamous carcinoma cells. Väitöskirja

29 Immunohistokemia Immunohistokemiassa käytetään hyväksi elimistön tuottamia vasta-aineita, humoraalista immunovastetta Koe-eläin immunisoidaan, rokotetaan halutulla (makro)molekyylillä (antigeeni). Tämä stimuloi immuunisoluja tuottamaan spesifisiä vasta-aineita ja muistisoluja. Kun rokotus toistetaan saadaan voimistuva immuunivaste 2-4 immunisaation jälkeen voidaan seerumista kerätä suurempia määriä vasta-aineita, jotka tunnistavat spesifisesti ainoastaan immunisaatiossa käytetyn proteiinin eli antigeenin Monoklonaaliset vasta-aineet tuotetaan soluviljelmissä Virtanen 2009

30 Vasta-aineen rakenne Kaksi identtistä raskasta ketjua ja kaksi identtistä kevyttä ketjua Y:n muodossa antigeenia sitova alue antigeenia sitova alue vaihteleva alue pysyvä alue nivelalue aminopää Y-muotoisen vastaainemolekyylin käsissä vaihteleva alue, johon vasta-aine sitoutuu Vasta-aineen raskaissa ketjuissa samanlaiset alueet kevyt ketju raskas ketju carboksyylipää komplementtia sitova alue F c -fragmentti F ab -fragmentti Ross & Pawlina: Histology. A Text and Atlas, LWW 2011

31 Epäsuoran immunohistokemia Antigeenissa oleva antigeeninen rakenne A Primaariset vasta-aineet: kanissa syntyneet vasta-aineet antigeeni A:ta kohtaan Esim. lampaassa syntyneet sekundaariset vasta-aineet, joihin on kiinnitetty visualisoitava markkeri kanivastaaineita kohtaan Alberts et al.: Molecular Biology of The Cell 5.ed, 2008 Garland Science markkeri 1. Ns. polyklonaalinen kanissa nostatettu vasta-aine antigeenia A kohtaan. 2. Lampaassa nostatettu antigeeni kanin vasta-ainemolekyylin Fc-osaa vastaan, joka on merkitty fluoresoivalla molekyylillä. Markkerina voi olla vasta-aineeseen kytketty fluorokromi, esim. fluoreskeiini vasta-aineeseen kytketty entsyymimolekyyli vasta-aineeseen kytketty kultapartikkeli (EM)

32 Immunohistokemiallinen kuva vimentiini-välikokoisista säikeistä monoklonaalisen vasta-aineen avulla. Fibroblasti Virtanen 2009

33 Immunovärjäys diagnostiikassa: Lupus nefriitissä (munuaistauti) munuaiskeräseen kertyy proteiineja. Virtanen 2009

34 Hybridisaatio, erityisesti in situ hybridisaatio Perustuu siihen, että yksinkertainen RNA tai DNA ketju (probe, koitin) sitoutuu spesifisesti vastinsekvenssiinsä kohteessa (DNA, mrna) Reaktio voi tapahtua liuoksessa, geelissä tai kudoksessa (in situ) Reaktiolla voidaan tunnistaa tietyt sekvenssit tai määrittää niiden esiintymispaikka kromosomeissa/ soluissa/ kudoksissa Kun käytetään eri värisiä fluorokromeja eri koittimien merkitsemiseen, voidaan samassa preparaatissa värjätä useita kohteita.

35 In situ hybridisaatio a. Peruselementit ovat DNA koitin ja kohdesekvenssi (emäsjärjestys) b. Koitin voidaan leimata suoraan fluorokromilla c. Koitin ja kohde DNA denaturoidaan, jotta saadaan aikaan yksisäikeinen (single stranded) DNA d. Nämä yksisäikeiset DNA:t saatetaan yhteen, mikä sallii vastinketjujen sitoutumisen kohdakkain e. Fluorokromilla merkitty koitin voidaan viedä mikroskopiaan.

36

37 Dongmei Cui: Atlas of Histology with Functional and Clinical Correlations, LWW, 2011 Ross & Pawlina: Histology. A Text and Atlas, LWW 2011 Jeffrey B. Kerr: Atlas of Functional Histology. Mosby 1999

38 Immunohistokemia Kuva: Minna Takkunen: Epithelialmesenchymal transition in oral squamous carcinoma cells. Väitöskirja