Rab23:n vaikutus pitkien luiden kehitykseen

Transkriptio

1 Rab23:n vaikutus pitkien luiden kehitykseen Lauri Mäkinen Hammaslääketieteen kandidaatti Lääketieteen laitos Suu- ja leukasairauksien osasto Helsinki Tutkielma Prof. David Rice, FT Maarit Takatalo Helsingin yliopisto Lääketieteellinen tiedekunta

2 i HELSINGIN YLIOPISTO HELSINGFORS UNIVERSITET Tiedekunta/Osasto Fakultet/Sektion Faculty Lääketieteellinen tiedekunta Laitos Institution Department Suu- ja leukasairauksien osasto Tekijä Författare Author Lauri Mäkinen Työn nimi Arbetets titel Title Rab23:n vaikutus pitkien luiden kehitykseen Oppiaine Läroämne Subject Ortodontia Työn laji Arbetets art Level Syventävä tutkielma Aika Datum Month and year 6/2012-4/2016 Sivumäärä -Sidoantal - Number of pages 20 Tiivistelmä Referat Abstract Rab23:n vaikutukset intramembranoottiseen luutumiseen ovat olleet tunnetut 2000-luvun alusta, mutta geenin täsmälliset vaikutukset endokondraalisten luiden kehitykselle ovat yhä osittain epäselvät. Tämän tutkielman tavoitteena on havainnoida ja dokumentoida Rab23 opb2 - genotyypin vaikutukset pitkien luiden fenotyyppiin käyttäen aineistona 15,5-18,5 sikiövuorokautisten hiirten olka- ja reisiluita ja menetelminä histokemiallisia värjäyksiä sekä in situ hybridisaatiota. Tutkimuksessa havaittiin Rab23 opb2 -mutaation vaikuttavan hiirten olkaluiden kokonaispituuteen (p<0,05) sekä mineralisoituneen korteksin (p<0,05) ja distaalisen proliferoivan vyöhykkeen pituuksiin. Lisäksi kondrosyyttien maturaatiossa havaittiin epäjärjestäytyneisyyttä reservin kondrosyyttien muuntuessa proliferoiviksi. Löydökset sopivat yhteen aiemman tutkimuksen kanssa, jonka perusteella Rab23:n tiedetään osallistuvan hedgehog-signaloinnin säätelyyn. Sen sijaan havainto kondrosyyttien maturaation epäjärjestäytyneisyydestä voi olla riippumaton hedgehog-signaloinnista. Aihe edellyttää jatkotutkimuksia. (100 sanaa) Avainsanat Nyckelord Keywords Hedgehog signaling, Rab23, Bone Säilytyspaikka Förvaringställe Where deposited Muita tietoja Övriga uppgifter Additional information

3 ii Sisällys 1 Johdanto Kirjallisuuskatsaus Hedgehog-signalointi Rab23 kehityksen säätelijänä Kondrosyytit endokondraalisessa luutumisessa Aineisto ja menetelmät Kudosten käsittely Histokemialliset värjäykset In situ hybridisaatio Tulokset Olkaluiden pituudet Olkaluiden mineralisaatio Kasvulevyjen rakenne In situ hybridisaatio Yhteenveto ja pohdinta Yhteenveto Tulevaisuuden haasteita Lähteet... 19

4 1 1 Johdanto Rab23 on RAB GTPaaseihin kuuluva proteiini, jonka vaikutus hedgehog-signaloinnin toimintaan havaittiin 2000-luvun alussa (1). Vuonna 2007 Rab23:n homotsygootilla nonsense-mutaatiolla todettiin olevan yhteys resessiiviseen autosomaalisesti periytyvään Carpenterin syndroomaan, jonka eräs tyyppioire on kallon keskisauman suturoiden kraniosynostoosi (2). Perustutkimus Rab23:n toiminnan paremmaksi ymmärtämiseksi voi tulevaisuudessa avata mahdollisuuksia uusien hoitomuotojen kehitykseen esimerkiksi kraniosynostoosin, syövän tai siliaaristen sairauksien saralla. Vaikka Rab23:n on tiedetty vaikuttavan kallon luiden ennenaikaiseen fuusioitumiseen lähes kymmenen vuoden ajan, geenin merkitys endokondraaliselle luutumiselle on jäänyt vaille huomiota. Tämän tutkielman tavoitteena on havainnoida ja dokumentoida Rab23 opb2 - mutaation vaikutukset endokondraaliseen luutumiseen 15,5-18,5 sikiövuorokautisten hiirten olka- ja reisiluissa.

5 2 2 Kirjallisuuskatsaus Solujen välisen viestinnän kehittyminen on ollut edellytys monisoluisten eliöiden syntymiselle. Tämä solujen välinen viestintä on välttämätöntä, jotta kudosten normaali kasvu on mahdollista. Häiriöt solujen välisessä viestinnässä havaitaan usein epänormaalina kehityksenä kuten anatomisena poikkeavuutena tai hallitsemattomana kasvuna. (3) Solujen välistä vuorovaikutusta tapahtuu sekä solujen pinnalla sijaitsevien molekyylien että liukoisten molekyylien, mitogeenien, välityksellä. Signaalimolekyylejä on useita erilaisia ja ne aiheuttavat kukin kohdesolussaan erilaisen vasteen. (3) 2.1 Hedgehog-signalointi Hedgehog-signalointi on esimerkki solujen välisestä viestinnästä. Tarkasti säädelty joukko soluja erittää hedgehog-ligandeja soluvälitilaan, jossa liukoiset molekyylit diffundoituvat kohdesolun solukalvon reseptoriin (3). Hedgehog-signaalimolekyyleihin kuuluu kolme erilaista ligandi-proteiinia: Sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh) ja Desert hedgehog (Dhh). Ligandit eroavat rakenteeltaan toisistaan vain vähän: ne sitoutuvat samoihin reseptoreihin ja eksogeenisillä Shh-ligandeilla voidaan koeolosuhteissa indusoida muiden ligandien kaltainen vaste kohdesolussa. (4) Vaikka hedgehog-ligandit toimivat samankaltaisesti, niillä on kullakin oma roolinsa alkion kehityksessä. Raajojen kehityksen kannalta olannaisia ovat Shh:n toiminta anterioriposteriori-suunnan kaavoittamisessa (5) ja Ihh:n funktio kasvulevyjen kondrosyyttien proliferaation säätelyssä (6). Hedgehog-ligandien lisäksi tunnettuja signaalireitin jäseniä ovat Patched-reseptorit, Smoothened (Smo) signaalinvoimistaja sekä kolme eri Gli-transkriptiotekijää. Hedgehogligandin sitoutuminen Patched-reseptoriin aiheuttaa solussa transkriptiotekijän aktiivisen (GliA) ja repressoivan (GliR) muodon välisen suhteen muutokseen. Tämä voi aikaansaada muutoksen solun toiminnassa. Kolmesta transkriptiotekijästä Gli1 ja Gli2 toimivat lähinnä aktivoidussa muodossa, Gli3 toimii tavallisesti repressorina. (7) Hedgehog-signaalireitin ollessa epäaktiivinen Patched inhiboi epäsuorasti Smoothenedia aktivoimasta Gli-transkriptiotekijöitä ja transkriptiotekijät pilkotaan autoproteolyyttisesti repressoivaan GliR-muotoon. Hedgehog-ligandin sitoutuminen kohdesolun solukalvon

6 3 Patched-reseptoriin estää tämän epäsuoran inhibition ja Smoothened aktivoi Glitranskriptiotekijöitä aktiiviseen GliA-muotoon. (7) 2.2 Rab23 kehityksen säätelijänä Carpenterin syndrooma on pleiotrooppinen autosomaalisesti resessiivisesti periytyvä sairaus, jonka tyyppioireita ovat polysyndaktylia, obeesius, kallon keskisaumojen kraniosynostoosi sekä sydämen kehityshäiriöt. Vuonna 2007 tämän harvinaisen sairauden havaittiin olevan yhteydessä Rab23:n mutaatioihin. (2) Rab23 ja hedgehog-signalointi Rab23 on RAB GTPaaseihin kuuluva proteiini, jonka tiedetään toimivan hedgehogsignaloinnin negatiivisena säätelijänä sijoittuen Smo:n ja Gli-transkriptiotekijöiden välille signaalireitillä. Rab23 opb2 -mutanteilla hiirillä tehdyissä kokeissa hedgehog-signaloinnin on havaittu vaikuttavan kohdesoluissa tavallista voimakkaammin, mikä havaitaan muun muassa hermostoputken dorsaalisten neuronien kehityksen häiriintymisenä. Rab23:n toiminnan täsmälliset molekulaariset mekanismit ovat kuitenkin toistaiseksi epäselviä. (1,8) Useiden Rab GTPaasien on havaittu osallistuvan solun kalvorakenteiden kuljetukseen. Evans ja kumppanit havaitsivat 2003 fluoresenssimikroskoopilla geneettisesti muunnellun jatkuvasti aktiivisen Rab23:n sijaitsevan solukalvolla kun taas inaktivoitu Rab23 paikantui sytosoliin. Samassa tutkimuksessa Rab23:n ja Patchedin immunofluoresenssit kuvautuivat samoille alueille. Rab23:n yhtenevästä paikantumisesta transferriinin kanssa vedettiin johtopäätös Rab23:n osallistumisesta endosytoosiin. (9) Rab23 opb2 -mutanteissa hiirissä on havaittu muutoksia Smo:n kertymisessä solukalvolle. Rab23:n on spekuloitu säätelevän hedgehog-signalointia kierrättämällä aktivoitunutta Smo:ta takaisin varastorakkuloihin odottamaan myöhempää uudelleenaktivointia. (10) Rab23:lla on havaittu olevan myös hedgehog-signaloinnista riippumaton funktio alkiolevyn vasen-oikea-asymmetrian kehittymisessä (11) Rab23 ja primaari silia Primaari silia on liikkumaton solukalvon uloke, joka havaitaan kaikissa tumallisissa eukaryoottisoluissa. Primaari silia toimii solujen välisessä signaloinnissa antennina, jonka reseptoreihin soluvälitilassa diffuntoituvat mitogeenit voivat tarttua. Silian sisällä mikrotubulusten muodostaman säikeen ympärillä toimii intraflagellaarinen kuljetus, jonka

7 4 välityksellä silian pinnan reseptoreiden aktivoituminen aikaansaa vasteen solussa. Primarin silian poikkeava toiminta vaikuttaa voimakkaasti muun muassa hedgehog-signaloinnin välittymiseen kohdesolussa, mutta myös Wnt-signaloinnissa on raportoitu muutoksia. (12,13) On havaittu, että Rab23 opb2 -mutanteissa soluissa primaarin silian muodostuminen on tavanomaisesta poikkeavaa. Rab23:n normaali toiminta vaikuttaa olevan välttämätöntä primaarin silian muodostumiselle. (14) 2.3 Kondrosyytit endokondraalisessa luutumisessa Tarkastelen pitkien luiden kehitystä tässä luvussa mesenkymaalisten kantasolujen kondensoitumisesta alkaen, koska tämä vaihe on tutkielman koejärjestelyiden kannalta relevantti Rustoisen mallin muodostuminen Endokondraalisen luutumisen alkaessa mesenkymaalinsen kondensaation ytimen solut erilaistuvat Sox9-positiivisiksi kondrosyyteiksi mahdollisesti Wnt- ja Fgf-signaloinnin vähenemisen myötä. Samalla erilaistuneet solut alkavat erittää soluvälitilaan rustosoluille tyypillisiä tyypin II, IX ja XI kollageeneja. Kondensaation reunan solut muodostavat perikondriumin. (15) Luun kehityksen edetessä rustoisen mallin ytimen solut muuntuvat hypertrofisiksi alkaen samalla erittämään tyypin X kollageenia soluvälitilaan. Muuntumisen vaikutuksesta solut lakkaavat ilmentämästä Sox9:a ja alkavat ilmentämään prehypertrofisille ja hypertrofisille kondrosyyteille tyypillisiä Ihh:a ja Runx2:a. (15) Hypertrofiset kondrosyytit säätelevät perikondriumia ympäröivien mesenkymaalisten kantasolujen erilaistumista osteoblasteiksi sekä verisuonten invaasiota rustoiseen malliin. Verisuonten kehittyminen mahdollistaa osteoblastien tunkeutumisen rustoisen mallin sisään ja muodostuu primaarinen luutumiskeskus. Samanaikaisesti luun mineralisoituminen alkaa rustoisen mallin pinnan solujen erilaistuessa osteoblasteiksi ja alkaessa erittämään tyypin I kollageenia ja mineralisoitunutta soluväliainetta. (16,17) Kondrosyyttien maturaatio ja luun pituuskasvu Primaarin luutumiskeskuksen ja luun pään väliin jäävät kondrosyytit muodostavat kasvulevyn, josta on histologisesti erotettavissa hypertrofinen, proliferoiva ja reservikondrosyyttien vyöhykkeet. Luun pituuskasvu tapahtuu kasvulevyn toiminnan välityksellä. Sopivat kasvutekijät stimuloivat kondrosyyttien proliferaatiota ja myöhemmin

8 5 niiden hypertrofista muuntumista. Tätä prosessia kutsutaan kondrosyyttien maturaatioksi. (17) Proliferaation myötä luun solumäärä kasvaa. Hypertrofiset kondrosyytit taas erittävät soluvälitilaan runsaasti soluväliainetta kasvattaen luun kokoa. Reservin kondrosyyttien muuntuminen proliferoiviksi ja edelleen hypertrofisiksi on jatkuvat prosessi, joka ilman säätelyä säätelyä hypertrofisen vyöhykkeen pitenemiseen. (16) Vastavaikuttajana tälle laajenemiselle toimivat primaarin luutumiskeskuksen puolelta hypertrofista vyöhykettä nakertavat osteoklastit, jotka houkuttelevat perässään osteoblasteja ja verisuonten kantasoluja. Tämä mekanismi ylläpitää kasvulevyn rakennetta. (18) Luiden pituuskasvu on mahdollista kasvulevyjen luutumiseen asti, mikä tapahtuu ihmisellä pian puberteetin jälkeen (17). Yksi runsaasti tutkittu luun pituuskasvua säätelevä mitogeeni on prehypertrofisten kondrosyyttien erittämä Ihh, jonka on havaittu stimuloivan reservikondrosyyttien proliferaatiota (6). Myöhemmin Smo-kimeereillä hiirillä tehdyissä kokeissa Ihh-signaloinnin on havaittu olevan välttämätöntä osteoblastien erilaistumiselle endokondraalisessa luutumisessa (19). Aktiivinen Ihh-signalointi saa aikaan Gli3 R -transkriptiotekijän pilkkoutumisen kohdesoluissa, jolloin repressoivan säätelyn puuttuminen stimuloi reservikondrosyyttejä erittämään proliferaatiota ylläpitävää PTHrP:ta (parathyroid hormone related peptide). (20) Negatiivisen takaisinkytkennän periaatteen mukaisesti proliferoivien kondrosyyttien etääntyessä PTHrP:ta erittävistä soluista niiden proliferaatiota ylläpitävä stimulus vähenee ja lopulta proliferoivat kondrosyytit muuntuvat hypertrofisiksi (21). Prehypertrofisten kondrosyyttien ja perikondriumin solujen ilmentämä luun kehityksen mestarigeeni Runx2 stimuloi kondrosyyttien hypertrofista erilaistumista (22). Gli3-poistogeenisillä hiirillä kondrosyyttien maturaation on havaittu tapahtuvan villityyppejä nopeammin, minkä johdosta reservivyöhykkeen sekä proliferoivan vyöhykkeen pituudet ovat lyhentyneet. Tutkimuksen perusteella Gli3 toimii reservikondrosyyttien erilaistumisen negatiivisena säätelijänä ja PTHrP stimuloi proliferoivien kondrosyyttien maturaatio Gli3 funktiosta riippumattomasti. (20) Myöhemmin Ihh:lla on todettu olevan myös PTHrP:sta riippumaton mekanismi kondrosyyttien hypertrofisen maturaation säätelyssä (23). Myös Fgf-signaloinnin on havaittu osallistuvan kondrosyyttien maturaation säätelyyn. Parhaiten tunnettu mekanismi on Fgfr3, jota proliferoivat kondrosyytit ilmentävät. Fgfr3-

9 6 poistogeenisillä hiirillä tehdyissä kokeissa geenin on havaittu inhiboivan kondrosyyttien proliferaatiota ja differentiaatiota johtaen proliferoivan vyöhykkeen pitenemiseen. (24) Myös Fgf2-, 18- ja 23-mutanttien hiirten luustossa on havaittu poikkeavuuksia, mutta näiden geenien funktiot endokondraalisessa luutumisessa ovat toistaiseksi osin epäselviä (16).

10 7 3 Aineisto ja menetelmät Tutkimusaineisto koostui sikiövuorokausina 15,5-18,5 (e15,5-18,5 1 ) kerätyistä näytteistä. Tutkimuksessa käytettyyn hiirikantaan on risteytetty Rab23 opb -mutaatio, joka estää Rab23- proteiinin normaalin toiminnan. Hiirikanta on saatu ystävällisesti professori Jonathan Eggenschwileriltä, jonka kiinnostuksen kohteena ovat erityisesti Rab23:n vaikutukset primaarin silian toimintaan. (1,12) Tutkimusta varten kerättiin näytteitä yhteensä 18 poikueesta. Koska mutantit hiiret kuolevat anatomisten poikkeavuuksien vuoksi pian syntymän jälkeen, mutaation postnataalien vaikutusten tutkiminen ei ollut mahdollista. Pitkien luiden rakenteiden selvittämiseksi sikiöiltä kerättiin etu- ja takaraajat olka- ja reisiluiden rakenteiden havainnoimiseksi. Sikiöiden genotyypin määrittämistä varten niiden hännistä leikattiin pala DNA:n eristämistä varten. Genotyypin perusteella näytteet jaettiin villityyppeihin, heterotsygootteihin ja mutantteihin. Tehtyjen tutkimusten tavoitteena oli havainnoida ja dokumentoida Rab23 mutanttien hiirten pitkien luiden kehityksen poikkeavuudet villityyppeihin verrattuna. Haasteena tutkimuksessa oli löytää menetelmät, joilla luiden histologiset poikkeavuudet saadaan dokumentoitua toistettavasti ja muutokset hyvin kuvaavasti. 3.1 Kudosten käsittely Kudosnäytteet kerättiin fosfaattipuskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS) ja fiksattiin 4 % paraformaldehydi-pbs-liuoksessa yön yli. Osa e17,5- ja e18,5-ikäisistä näytteistä dekalsifioitiin EDTA-PBS liuoksessa leikkeiden leikkaamisen helpottamiseksi. Näytteet dehydroitiin nousevalla alkoholisarjalla, kirkastettiin xyleenillä, inkuboitiin yön yli sulassa parafiinissa ja valettiin parafiiniblokkeihin seuraavana päivänä. Histokemiallisia värjäyksiä ja in situ hybridisaatiota varten näytteet leikattiin 7 μm paksuisiksi leikkeiksi ja kiinnitettiin objektilaseihin. Leikkeitä inkuboitiin yön yli +42 C lämpötilassa, minkä jälkeen näytteitä säilytettiin käyttöön asti +4 C lämmössä. 3.2 Histokemialliset värjäykset Luuston poikkeavuuksien esittämiseksi leikesarjoille suoritetiin erilaisia histokemiallisia värjäyksiä. Hematoksyliini-eosiini -värjäys (HE) on yleisimmin käytetty histokemiallinen värjäys. Fysiologisessa ph:ssa negatiivisesti varautuneet soluelimet värjäytyvät 1 e = embryonic day

11 8 tummansinisiksi ja positiivisesti varautuneet rakenteet punaisiksi. HE värjäyksessä tumat värjäytyvät sinisiksi DNA:n ja RNA:n negatiivisten varausten vuoksi, kun taas proteiinit sytoplasmassa ja soluvälitilassa värjäytyvät positiivisen varauksen vuoksi punertaviksi. (25) Von Kossa -luustovärjäystä voidaan käyttää mineralisoituneen luun määrän arvioimiseen. Värjäysliuoksen hopeaionit reagoivat leikkeiden mineralisoituneen luun fosfaattien kanssa muodostaen mustaa sakkaa luutuneille alueille. Luuvärjäyksen korostamiseksi ja kudosrakenteen paljastamiseksi leikkeille tehtiin punaisen värin aikaansaava Safranin O - taustavärjäys. (25) Histokemiallisesti värjätyille leikkeille mitattaviksi muuttujiksi valittiin luun kokonaispituus (suurin pituus luun distaalisesta päästä luun proksimaaliseen päähän), kasvulevyjen proksimaalisen ja distaalisen proliferoivan vyöhykkeen kokonaispituudet (ensimmäisistä hypertrofisista soluista luun päähän kokonaispituuden suunnan mukaisesti mitaten) ja mineralisoituneen luun pinnan pituudet von Kossa värjäyksissä (luun reunojen mineralisoituneen korteksin pituuksien keskiarvo). Laadullista arviointia apuna käyttäen havainnoitiin proliferaation alkamisen säätelyä, kolumnaaristen kondrosyyttien järjestyneisyyttä, pitkien luiden taipumista sekä luutumisen yleistä kehitysastetta. (25) 3.3 In situ hybridisaatio In situ hybridisaatio on menetelmä soluissa ilmentyvien geenien osoittamiseksi. In situ hybridisaatiolla osoitettua muutosta geenien ilmentymisessä pidetään vahvana osoituksena fenotyypin muutoksesta. Tässä tutkimuksessa in situ hybridisaatiolla pyrittiin osoittamaan kasvulevyn rakennetta säätelevien geenien mahdollinen poikkeava ilmentyminen In situ hybridisaatiossa kudosleikkeistä poistetaan parafiini ja leikkeet rehydroidaan laskevalla alkoholisarjalla. Leikkeitä käsitellään maleiinihapolla solukalvon läpäisevyyden lisäämiseksi. Laseille pipetoitiin digoksigeeni-leimattuja RNA-koettimia, jonka jälkeen näytelaseja inkuboitiin yön yli koettimen ominaisuuksista riippuen C lämpötilassa. Näin aikaansaadaan leimattujen koettimien hybridisoituminen leikkeen RNA:han. Ylimäärä koettimista huuhdottiin pois näytelaseilta ja niille asetetaan reagensseja, jotka reagoivat kiinnittyneiden koettimien kanssa aiheuttaen värireaktion. Näin pystytään havainnoimaan valittujen geenien ilmentymistä. Alustavien HE- ja toluidiinisini-värjäysten perusteella katsottiin aiheelliseksi epäillä muutoksia pitkien luiden kasvulevyjen rakenteessa. In situ hybridisaatioon valittiin

12 9 tutkittavaksi kasvulevyjen prehypertrofisissa kondrosyyteissä ilmentyvät Indian hedgehog (Ihh) ja tyypin X kollageeni (ColX).

13 10 4 Tulokset 4.1 Olkaluiden pituudet Mutanttien olkaluiden pituuksien arvioimiseen käytettiin histokemiallisesti värjättyjä leikkeitä e15,5-17,5-ikäisistä sikiöistä sekä e16,5- ja e18,5-ikäisten hiirten Alcian blue / Alizarin red värjättyjä luurankoja. Mittaustulokset on analysoitu poikueittain, koska saman poikueen sikiöt ovat toistensa parhaita verrokkeja saman hedelmöittymishetken ja kasvuolosuhteiden samankaltaisuuden vuoksi. Taulukko 1: Olkaluiden pituudet e15,5-17,5-ikäisissä poikueissa histokemiallisesti värjätyissä leikkeissä, missä ka = olkaluiden suhteelliset pituudet villityyppeihin verrattuna, s = keskihajonta. Olkaluiden pituudet histokemiallisissa leikkeissä e15,5 I-poikue e15,5 II-poikue e16,5 ka s ka s ka s Rab23 +/+ 1,00 0,0071 1,00 0,0632 1,00 0,0240 Rab23 opb2 0,97 0,0003 0,94 0,0052 0,87 0,0286 p: 0,1497 p: 0,1419 p: 0,0032 e17,5 I-poikue e17,5 II-poikue ka s ka s Rab23 +/+ 1,00 0,0606 Rab23 opb/+ 1,00 0,0184 Rab23 opb2 0,98 0,0412 Rab23 opb2 0,85 0,0149 p: - p: - Taulukossa 1 on esitetty mittaustulokset histokemiallisesti värjätyistä leikkeistä. E17,5- ikäisissä poikueissa ryhmien välille ei laskettu p-arvoja näytteiden vähäisyyden vuoksi. E17,5 II-poikueessa verrokkeina käytettiin poikkeuksellisesti Rab23 opb/+ -genotyypin sikiötä. Yksikään mutanttien hiirten olkaluista ei ollut verrokkiryhmän keskiarvoa pidempi. Vaikka histologisista leikkeistä mitattujen olkaluiden kokonaispituudessa havaittiin tilastollisesti merkittävä ero vain yhdessä poikueessa viidestä, voidaan mutanttien hiirten olkaluiden sanoa todennäköisesti olevan villityyppejä lyhyempiä. Alcian blue / Alizarin red värjätyistä sikiöistä mitatut olkaluiden pituudet on esitetty taulukossa 2. Kuvausprojektion vaihtelusta johtuen tuloksia voidaan pitää lähinnä suuntaaantavina. Mutanttien sikiöiden olkaluut olivat kaikissa poikueissa verrokkeja lyhempiä. E18,5 II-poikueessa verrokkeina käytettiin poikkeuksellisesti Rab23 opb/+ -genotyypin sikiötä.

14 11 Taulukko 2: Olkaluiden pituudet e16,5- ja e18,5-ikäisissä poikueissa Alcian blue / Alizarin red -värjätyissä näytteissä, missä ka = olkaluiden suhteelliset pituudet villityyppeihin verrattuna, s = keskihajonta. Olkaluiden pituudet Alcian blue / Alizarin red luustovärjäyksissä e18,5 I-poikue e18,5 III-poikue e16,5 ka s ka s ka s Rab23 +/+ 1,00 0,0153 1,00 0,0037 1,00 0,0350 Rab23 opb2 0,94 0,0225 0,97 0,0976 0,86 0,0595 p: 0,0129 p: 0,6734 p: 0,2407 e18,5 II-poikue ka s Rab23 opb/+ 1,00 0,0292 Rab23 opb2 0,94 0,0344 p: 0,0691 Kaikkien poikueiden näytteet huomioiden mutanttien hiirten olkaluut olivat keskimäärin 92,6 % verrokkiryhmästä vaihteluvälin ollessa %. Taulukoiden 1 ja 2 tulosten perusteella mutanttien hiirten olkaluiden voidaan todeta olevan villityyppejä lyhempiä. 4.2 Olkaluiden mineralisaatio Luun mineralisoitumisasteen määrittämiseksi e15,5-17,5-ikäisille poikueille suoritettiin von Kossa / Safranin O -värjäys. Mineralisoitumisen etenemistä arvioitiin mittaamalla olkaluun varren mineralisoituneen korteksin pituus sekä tarkastelemalla silmämääräisesti hohkaluun mineralisaatioastetta. Tilastollisesti merkittävä ero (p<0.05) mineralisoituneen korteksin pituudessa havaittiin kahdessa poikueessa kolmesta (Taulukko 3). E17,5-ikäisessä poikueessa p-arvon laskeminen ei ollut mahdollista näytteiden niukkuuden vuoksi, mutta mineralisoitunut korteksi oli mutanteilla merkittävästi villityyppiä lyhempi. Taulukko 3: Mineralisoituneen korteksin pituudet e15,5-17,5-ikäisissä poikueissa, missä ka = mineralisoituneen korteksin suhteellinen pituus villityyppeihin verrattuna, s = keskihajonta. Mineralisoituneiden korteksien pituudet e15,5 e16,5 e17,5 ka s ka s ka s Rab23 +/+ 1,00 0,0076 1,00 0,0626 1,00 - Rab23 opb2 0,82 0,0166 0,67 0,0280 0,58 0,0631 p: 0,0284 p: 0,0100 p: -

15 12 Kuva 1: e15,5- ja e16,5-ikäisten olkaluiden von Kossa / Safranin O -värjäys, mittapalkki 500 µm. Mutanttien hiirten (C,D) mineralisoitunut korteksi (keltainen viiva) on tilastollisesti merkittävästi lyhempi villityyppeihin (A, B) verrattuna. Luun mineralisaation voidaan todeta olevan mutanteilla merkittävästi verrokkeja jäljessä e15,5-17,5-ikäisissä poikueissa ja aineisto antaa viitteitä suhteellisen eron kasvamiseen luutumisen edetessä. Luuytimen mineralisoitumisessa ei havaita eroja kuvan 1 e15,5-16,5- ikäisissä näytteissä, mutta e17,5-ikäisissä näytteissä (Kuva 2, keltainen nuoli) ero on havaittavissa. Kuvan 2 leikkeissä voidaan lisäksi nähdä ero mineralisoituneen korteksin (kuva 2, musta nuoli) ja distaalisen proliferoivan vyöhykkeen (kuva 2, valkoinen nuoli) pituuksissa. Kuvassa 2 mutantin hiiren mineralisoitunut korteksi on merkittävästi lyhyempi, distaalinen proliferoiva vyöhyke on pidempi ja hohkaluun mineralisaatio on vähäisempää.

16 13 Kuva 2: e17,5-ikäisten olkaluiden von Kossa / Safranin O -värjäys, mittapalkki 500 µm. Mutanttien hiirten (B) mineralisaatio on vähäisempää luuytimen alueella (keltainen nuoli), proliferoiva vyöhyke on pidempi (valkoinen nuoli) ja mineralisoitunut korteksi on lyhempi (musta nuoli) villityyppeihin (A) verrattuna. 4.3 Kasvulevyjen rakenne Olkaluiden pituuseron selvittämiseksi katsottiin aiheelliseksi arvioida olkaluiden kasvulevyjen rakennetta. Koska yksi mahdollinen pituuseroa selittävä tekijä oli muutos kondrosyyttien proliferaationopeudessa, olkaluun proksimaalisen ja distaalisen proliferoivan vyöhykkeen pituuksien mittaukset katsottiin aiheelliseksi. Yksinkertaisesti toistettavaksi menetelmäksi osoittautui suorittaa mittaus proliferoivan ja hypertrofisen vyöhykkeen rajalta luun päähän (Kuva 3A).

17 14 Proliferoivien vyöhykkeiden pituuksien määrittämiseksi neljästä poikueesta kerätyille näytteille suoritettiin HE-värjäys. Mittausten tulokset olivat osin ristiriitaisia. Mutanttien sikiöiden distaaliset proliferoivat vyöhykkeet olivat kaikissa poikueissa verrokkeja pidemmät, mutta erot eivät olleet tilastollisesti merkittäviä (Taulukko 4). Proksimaalisten proliferoivien vyöhykkeiden pituuksissa ei havaittu eroja, mikä voi viitata proliferoivien vyöhykkeiden pituuserojen aiheutuvan sikiöiden kehityksen eritahtisuudesta. Taulukko 4: Proliferoivien vyöhykkeiden pituudet, missä ka = proliferoiva vyöhykkeen suhteellinen pituus villityyppeihin verrattuna, s = keskihajonta. Proliferoivien vyöhykkeiden pituudet Distaalinen proliferoiva vyöhyke e15,5 I-poikue e15,5 II-poikue e16,5 e17,5 ka s ka s ka s ka s Rab23 +/+ 1,00 0,015 1,00 0,069 1,00 0,010 1,00 0,044 Rab23 opb2 1,13 0,017 1,03 0,070 1,10 0,092 1,05 p: 0,031 p: 0,781 p: 0,250 - Proksimaalinen proliferoiva vyöhyke e15,5 I-poikue e15,5 II-poikue e16,5 e17,5 ka s ka s ka s ka s Rab23 +/+ 1,00 0,004 1,00 0,070 1,00 0,017 1,00 0,041 Rab23 opb2 1,11 0,010 0,99 0,026 0,98 0,010 1,00 p: 0,000 p: 0,854 p: 0,372 - Kuva 3: e15,5- ja e16,5-ikäisten olkaluiden HE-värjäys missä a = distaalinen proliferoiva vyöhyke, b = proksimaalinen proliferoiva vyöhyke, c = luun kokonaispituus, mittapalkki 500 µm. Mutanttien hiirten (C, D) distaalinen proliferoiva vyöhyke on pidempi ja kokonaispituus on lyhempi villityyppeihin (A, B) verrattuna.

18 15 Pienet muutokset luiden ja proliferoivien vyöhykkeiden pituuksissa sekä aiempi tutkimus Rab23:n osallistumisesta Hedgehog-signaloinnin säätelyyn (1) antoivat aiheen epäillä muutoksia proliferaation alun säätelyssä. Proliferoivan vyöhykkeen pituutta olennaisempi muutos havaitaan tarkasteltaessa reservisolukon muuntumista proliferoiviksi kolumnaarisiksi kondrosyyteiksi. Verrokkihiirten kasvulevyissä muutos solujen histologiassa on osoitettavissa muutaman solukerroksen tarkkuudella. Mutanteilla hiirillä kondrosyyttien proliferaation alku on vaikeampaa havaita. Löydös on havainnollistettu kuvassa 4, jossa proliferoivan vyöhykkeen alku on merkitty katkoviivalla. Mutantin hiiren (Kuva 4B) proliferaation alun säätelyn epätasaisuutta on havainnollistettu osoittamalla nuolilla kolumnaaristen kondrosyyttien joukossa yksittäisiä pyöreämpiä reservisoluja ja reservisolukossa litteämpiä proliferoivia soluja. Kuva 4: e17,5-ikäisten reisiluiden proksimaalisen kasvulevyn HE-värjäys, mittapalkki 250 µm. Mutantilla (B) havaitaan proliferoivan vyöhykkeen (mustien viivojen välinen alue) epäjärjestäytyneisyyttä. Kolumnaaristen kondrosyyttien joukossa on pyöreitä reservikondrosyyttejä ja reservikondrosyyttien joukossa litteitä proliferoivia soluja (mustat nuolet). 4.4 In situ hybridisaatio Koska proliferatiivisten vyöhykkeiden histologiset muutokset olivat niukkoja, solujen erilaistumisen häiriöt pyrittiin todistamaan osoittamalla kondrosyyteissä geenien poikkeavaa

19 16 ilmentymistä. Tutkittaviksi geeneiksi valittiin prehypertrofisissa soluissa ilmentyvät tyypin X kollageeni (ColX) ja Indian hedgehog (Ihh). Lukuisista yrityksistä huolimatta Ihh:n in situ hybridisaation signaalia ei saatu riittävän voimakkaasti mutanttien ja villityyppien välisten erojen havainnoimiseksi. Prehypertrofisissa soluissa havaittiin parhaimmillaan hyvin heikkoa värjäytymistä, mutta signaali ei ollut riittävän voimakas luotettavien havaintojen tekemiseen. ColX ilmentyy prehypertrofisissa kondrosyyteissä merkittävästi Ihh:a runsaampana, mikä on todennäköisesti selittää eron geenien in situ hybridisaation voimakkuudessa. Kuva 5: e17,5-ikäisen olkaluun ColX in situ hybridisaatio, mittapalkki 500µm. ColXpositiivisten solujen vyöhykkeet ovat mutanteilla (B) ja villityypeillä (A) pituudeltaan samaa suuruusluokkaa, mutta proliferoivat vyöhykkeet ColX-positiivisista soluista luun päähän mitattuna (keltaiset katkoviivat) vaikuttavat pidemmiltä mutanteilla hiirillä. ColX ilmentymisessä ei havaita merkittävää eroa mutanttien ja verrokkien välillä. Suoritettu ColX in situ hybridisaatio kuitenkin vahvistaa käsitystä proliferoivien vyöhykkeiden pidentymisestä (Kuva 5, keltainen katkoviiva). Proliferoivien vyöhykkeiden pituuserot eivät olleet tilastollisesti merkittäviä tällä näytemäärällä.

20 17 5 Yhteenveto ja pohdinta 5.1 Yhteenveto Erot mutanttien ja villityyppien endokondraalisessa luutumisessa eivät olleet dramaattisia. Mutanteilla hiirillä kehittyi olka- ja reisiluut, jotka silmämääräisesti muistuttivat villityyppien vastaavia luita. On mahdollista, että erot hiirten ja luiden kehityksessä kasvaisivat syntymän jälkeen. Käytetty hiirikanta ei kuitenkaan tarjoa mahdollisuutta postnataalien muutosten tutkimiselle, sillä mutantit hiiret eivät olleet elinkelpoisia. Tutkimuksessa havaittiin tilastollisesti merkittävä ero e15,5-18,5-ikäisten hiirten olkaluiden pituuksissa, sekä mineralisoituneen korteksin pituuksissa. Mutanttien hiirten olkaluut ja mineralisoitunut korteksi olivat villityyppejä lyhempiä. Lisäksi aineisto antoi viitteitä proliferoivien vyöhykkeiden erilaistumisen häiriöistä. Mutanttien sikiöiden proliferaation alku vaikutti HE-värjätyissä leikkeissä epäjärjestäytyneeltä ja proliferoivien vyöhykkeiden pituuksissa havaittiin pieniä eroja. Erot mineralisaatiossa sekä olkaluiden ja proliferoivien vyöhykkeiden pituuksissa voivat selittyä mutanttien kehityksen hidastumisella. Muutokset reservikondrosyyttien muuntumisessa proliferoiviksi ovat kuitenkin todennäköisesti suoraan yhteydessä Rab23- proteiinin toimintaan, koska tutkimuksessa tämä muuntuminen vaikuttaa hyvin järjestyneeltä villityyppien kaikissa kehitysvaiheissa. 5.2 Tulevaisuuden haasteita Tutkimus ei tarjoa vastausta kysymykseen, onko proliferoivan vyöhykkeen epäjärjestyneisyys seurausta Rab23:n funktiosta hedgehog-signaloinnin säätelyssä. Mahdollisia lisätutkimuksia proliferoivan vyöhykkeen muutosten analysointiin ovat muun muassa EdU-värjäys ja in situ hybridisaatio. EdU-värjäyksen avulla on mahdollista havainnoida solujen jakaantumisnopeutta (26). Rab23 opb2 -genotyypin kannalta erityisen kiinnostavaa olisi tietää jakautuvien solujen suhteellinen osuus reservin ja varhaisten proliferoivien kondrosyyttien populaatiossa. Havaitaanko mutanttien ja villityyppien välillä eroja ja selittävätkö muutokset erot luiden kehityksessä? Poikkeavan geenien ilmentymisen osoittaminen in situ hybridisaatiolla olisi silmämääräistä histologisten muutosten havainnointia vahvempi näyttö rakenteellisista poikkeavuuksista. In

21 18 situ hybridisaation osalta erityisen kiinnostavaa olisi tarkastella varhaisten proliferoivien kondrosyyttien geenien ilmentymistä mutanttien hiirten kasvulevyissä. Radioaktiivisilla BrdU-leimatuilla koettimilla suoritettu in situ hybridisaatio olisi mahdollisesti DIG-leimattua koettimia herkempi, mutta on toisaalta teknisesti haastavampi toteuttaa ja näytteissä havaitaan tavallisesti myös enemmän kohinaa. Olisi kiinnostavaa tietää, onko mutanttien hiirten Ihh-positiivisten solujen määrä samaa suuruusluokkaa villityyppeihin verrattuna ja toisaalta ilmentyykö varhaisten proliferoivien kondrosyyttien markkereita poikkeavilla alueilla. Tutkimuksessa käytettiin olka- ja reisiluita endokondraalisen luutumisen mallina niiden suuren koon ja täten helpomman käsiteltävyyden vuoksi. Tutkielman kirjoittamisen aikana jatketuissa tutkimuksissa on havaittu, etteivät luiden kehityksessä havaittavat poikkeamat ole täysin yleistettävissä kaikkiin endokondraalisesti kehittyviin luihin. Kaikki endokondraalisesti kehittyvät luut eivät noudata tämän tutkielman mallia ja ole 2-15 % villityyppien vastaavia luita lyhempiä. Alizarin red / Alcian blue -värjättyjä sikiöitä tarkastelemalla on voitu havaita jopa eräiden luiden puuttuminen Rab23 opb2 -mutanteilta hiiriltä. (27) Vaikka luut kehittyvät samalla mekanismilla, on jatkotutkimukset aiheellista kohdentaa luihin, joissa muutokset ovat suuremmat.

22 19 Lähteet (1) Eggenschwiler JT, Espinoza E, Anderson KV. Rab23 is an essential negative regulator of the mouse Sonic hedgehog signalling pathway. Nature 2001 Jul 12;412(6843): (2) Jenkins D, Seelow D, Jehee FS, Perlyn CA, Alonso LG, Bueno DF, et al. RAB23 mutations in Carpenter syndrome imply an unexpected role for hedgehog signaling in cranial-suture development and obesity. Am J Hum Genet 2007 Jun;80(6): (3) Sariola H, Frilander M. Kehitysbiologia : solusta yksilöksi. 2. uud. p. ed. Helsinki: Duodecim; (4) Ingham PW, McMahon AP. Hedgehog signaling in animal development: paradigms and principles. Genes Dev 2001 Dec 1;15(23): (5) Capdevila J, Izpisua Belmonte JC. Patterning mechanisms controlling vertebrate limb development. Annu Rev Cell Dev Biol 2001;17: (6) St-Jacques B, Hammerschmidt M, McMahon AP. Indian hedgehog signaling regulates proliferation and differentiation of chondrocytes and is essential for bone formation. Genes Dev 1999 Aug 15;13(16): (7) Hui CC, Angers S. Gli proteins in development and disease. Annu Rev Cell Dev Biol 2011 Nov 10;27: (8) Eggenschwiler JT, Bulgakov OV, Qin J, Li T, Anderson KV. Mouse Rab23 regulates hedgehog signaling from smoothened to Gli proteins. Dev Biol 2006 Feb 1;290(1):1-12. (9) Evans TM, Ferguson C, Wainwright BJ, Parton RG, Wicking C. Rab23, a negative regulator of hedgehog signaling, localizes to the plasma membrane and the endocytic pathway. Traffic 2003 Dec;4(12): (10) Boehlke C, Bashkurov M, Buescher A, Krick T, John AK, Nitschke R, et al. Differential role of Rab proteins in ciliary trafficking: Rab23 regulates smoothened levels. J Cell Sci 2010 May 1;123(Pt 9): (11) Fuller K, O'Connell JT, Gordon J, Mauti O, Eggenschwiler J. Rab23 regulates Nodal signaling in vertebrate left-right patterning independently of the Hedgehog pathway. Dev Biol 2014 Jul 15;391(2): (12) Eggenschwiler JT, Anderson KV. Cilia and developmental signaling. Annu Rev Cell Dev Biol 2007;23: (13) Goetz SC, Anderson KV. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nat Rev Genet 2010 May;11(5): (14) Yoshimura S, Egerer J, Fuchs E, Haas AK, Barr FA. Functional dissection of Rab GTPases involved in primary cilium formation. J Cell Biol 2007 Jul 30;178(3):

23 20 (15) Horton WA, Degnin CR. FGFs in endochondral skeletal development. Trends Endocrinol Metab 2009 Sep;20(7): (16) Kronenberg HM. Developmental regulation of the growth plate. Nature 2003 May 15;423(6937): (17) Schoenwolf GC, Bleyl SB, Brauer PR, Francis-West PH. Larsen's human embryology. Fifth edition. ed. Philadelphia, PA: Elsevier/Saunders; cop (18) Mackie EJ, Ahmed YA, Tatarczuch L, Chen KS, Mirams M. Endochondral ossification: how cartilage is converted into bone in the developing skeleton. Int J Biochem Cell Biol 2008;40(1): (19) Long F, Chung UI, Ohba S, McMahon J, Kronenberg HM, McMahon AP. Ihh signaling is directly required for the osteoblast lineage in the endochondral skeleton. Development 2004 Mar;131(6): (20) Koziel L, Wuelling M, Schneider S, Vortkamp A. Gli3 acts as a repressor downstream of Ihh in regulating two distinct steps of chondrocyte differentiation. Development 2005 Dec;132(23): (21) Kronenberg HM. PTHrP and skeletal development. Ann N Y Acad Sci 2006 Apr;1068:1-13. (22) Goldring MB, Tsuchimochi K, Ijiri K. The control of chondrogenesis. J Cell Biochem 2006 Jan 1;97(1): (23) Mak KK, Kronenberg HM, Chuang PT, Mackem S, Yang Y. Indian hedgehog signals independently of PTHrP to promote chondrocyte hypertrophy. Development 2008 Jun;135(11): (24) Naski MC, Colvin JS, Coffin JD, Ornitz DM. Repression of hedgehog signaling and BMP4 expression in growth plate cartilage by fibroblast growth factor receptor 3. Development 1998 Dec;125(24): (25) Bancroft JD, Gamble M. Theory and practice of histological techniques. 5th ed. ed. Edinburgh: Churchill Livingstone; (26) Salic A, Mitchison TJ. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 2008 Feb 19;105(7): (27) Hasan R. Suullinen tiedonanto,