MARIA LEHTIVAARA LIPOPROTEIINIMALLIEN PINTAJÄNNITYKSEN MÄÄRITTÄ- MINEN MOLEKYYLIDYNAMIIKKASIMULAATIOISTA. Kandidaatintyö

MARIA LEHTIVAARA LIPOPROTEIINIMALLIEN PINTAJÄNNITYKSEN MÄÄRITTÄ- MINEN MOLEKYYLIDYNAMIIKKASIMULAATIOISTA Kandidaatintyö Tarkastaja: Heikki Huttunen Ohjaajat: Samuli Ollila, Ilpo Vattulainen 20.2.2010

I TIIVISTELMÄ TAMPEREEN TEKNILLINEN YLIOPISTO Biotekniikan koulutusohjelma MARIA LEHTIVAARA: LIPOPROTEIINIMALLIEN PINTAJÄNNITYKSEN MÄÄ- RITTÄMINEN MOLEKYYLIDYNAMIIKKASIMULAATIOISTA Kandidaatintyö, 30 sivua 19. helmikuuta 2010 Pääaine: Laskennallinen systeemibiologia Tarkastaja: Heikki Huttunen Ohjaajat: Samuli Ollila, Ilpo Vattulainen Avainsanat: Lipoproteiinit, molekyylidynamiikka, HDL, LDL, pintajännitys Ateroskleroosi on hyvinvointivaltioissa yleinen, sydänkohtauksiin johtava sairaus, jossa sydämen verisuonten seinämät paksuuntuvat ja verenkierto sydämessä estyy. Seinämien paksuuntuminen johtuu niihin kerääntyvistä ja kiinnittyvistä LDLpartikkeleista, joita tämän vuoksi kutsutaan myös "pahaksi kolesteroliksi". "Hyväksi kolesteroliksi" kutsutut HDL-partikkelit puolestaan kuljettavat kolesterolia takaisin maksaan. Kuljetettavat hydrofobiset lipidit sijaitsevat lipoproteiinien ytimessä, ja niitä suojaa amfifiilisten fosfolipidien kuori. Liporoteiinien pinnalla on lisäksi yksi tai useampi apolipoproteiini. LDL-partikkelien fuusioituminen edistää ateroskleroosin syntyä, ja lipoproteiinien suuri pintajännitys edistää niiden fuusioitumista. Tässä työssä tutkitaan lipoproteiinien pintajännitystä molekyylidynamiikkasimulaatioiden avulla. Tavoitteena on verrata simulaatioista määritettyjä pintajännityksen arvoja kokeellisiin tuloksiin. Kokeellisesti pintajännitys on määritetty tensiometrin avulla suurille, lipoproteiinipartikkeleita muistuttaville systeemeille, joissa on triglyseridiydin sekä pinnalla fosfolipidikalvo ja apolipoproteiini apob:n osia. Pintajännitys on kokeissa mitattu pelkälle ytimelle (32 mn/m), ytimelle ja fosfolipikalvolle (22 mn/m) sekä ytimelle, fosfolipidikalvolle ja proteiinille (11 mn/m). Vertailua varten simulaatiot toteutettiin vastaaville systeemeille HDL:n ja LDL:n molekyylisuhteilla. Suoran vertailun vuoksi tehtiin myös simulaatioita, jossa on trioleaattia (triglyseridi) vedessä. Tutkimuksen tavoitteena on paitsi selvittää, saadaanko karkeistetuilla molekyylidynamiikkasimulaatioilla kokeellisia tuloksia vastaavia arvoja erilaisten lipoproteiinimodifikaatioiden pintajännitykselle, myös tutkia kuinka apolipoproteiinin lisäys partikkelin pinnalle ja partikkelin pieni koko vaikuttavat pintajännitykseen. Simulaatioista määritetyt pintajännitykset trioleaatille vedessä vastaavat hyvin kokeellisia arvoja (n. 32 mn/m). Pintajännityksen riippuvuutta partikkelin koosta ei näissä tutkimuksissa havaittu. Myös fosfolipidikalvon aiheuttama pintajännityksen lasku verrattuna pelkän ytimen pintajännitykseen vastasi kokeellisista tuloksista

II määritettyä eroa (noin 10 mn/m). Nämä tulokset vakuuttavat molekyylidynamiikkasimulaatioiden toimivuudesta pienten partikkelien pintajännityksen määrittämisessä. Sen sijaan kokeellisissa tuloksissa nähtyä apolipoproteiinisekvenssien aiheuttamaa laskua partikkelin pintajännityksessä ei havaita simulaatiotuloksissa. Tämä voi johtua simulaatioiden epätarkkuudesta, mutta on myös mahdollista, että kokeellisissa määrityksissä proteiinisekvenssit peittävät koko partikkelin pinnan syrjäyttäen fosfolipidikalvon, ja että havaittu pintajännityksen lasku johtuisi tästä. Näin ollen suurilla partikkeleilla tehdyistä tensiometrikokeista tehdyt johtopäätökset eivät välttämättä päde pienillä lipoproteiineilla, joissa on vain muutama apolipoproteiini ja rajallinen määrä molekyylejä.

III ALKUSANAT Tähän kandidaatintyöhön liittyvät tutkimukset on tehty Biologisen fysiikan tutkimusryhmässä Tampereen teknillisen yliopiston fysiikan laitoksella. Tahdon kiittää ryhmän johtajaa, Ilpo Vattulaista, mahdollisuudesta tehdä mielenkiintoista, monipuolista ja relevanttia tutkimusta hienossa tutkimusryhmässä. Kaikesta työhön liittyvästä ohjauksesta ja opetuksesta kiitän suuresti ohjaajaani Samuli Ollilaa. Olen saanut paljon apua kaikenlaisiin ongelmiin koko tutkimusryhmän jäseniltä, joista erityisesti haluan kiittää Antti Lambergia. Perusteellisesti työhön opastamisesta kiitän lämpimästi Matti Javanaista ja Eero Hytöstä. Kirjoitusprosessin etenemisen ohjaamisesta, kannustamisesta sekä kärsivällisestä seminaariesitelmien kuuntelusta kiitän Konsta Koppista ja Heikki Huttusta. Erittäin huolellisesta tekstinhuollosta tahdon kiittää isoisääni Rauli Lehtivaaraa. Maria Lehtivaara 20.2.2010

IV SISÄLTÖ 1. Lyhenteet ja symbolit 1 2. Johdanto 4 3. Teoria 6 3.1 Lipoproteiinit............................... 6 3.1.1 Lipoproteiinien metabolia ja lipidien kuljetus elimistössä... 6 3.1.2 Ateroskleroosi........................... 7 3.1.3 Lipoproteiinien rakenne..................... 8 3.1.4 Molekyyleistä........................... 9 3.2 Pintajännitys............................... 10 3.2.1 Pintajännitys lipoproteiineissa.................. 11 3.2.2 Pintajännityksen mittaaminen kokeellisesti........... 12 4. Menetelmät ja materiaalit 14 4.1 Molekyylidynamiikka........................... 14 4.2 Voimakentän parametrit......................... 16 4.3 Simuloidut systeemit........................... 18 4.4 Pintajännityksen laskeminen molekyylidynamiikkasimulaatioista............................... 21 5. Tulokset ja niiden tarkastelu 23 5.1 Menetelmien toimivuus.......................... 23 5.2 Tulosten vertailu kokeellisiin arvoihin.................. 23 6. Johtopäätökset 26 6.1 Päätelmät................................. 26 6.2 Jatkotutkimus............................... 26 Kirjallisuutta 28

1 1. LYHENTEET JA SYMBOLIT HDL High Density Lipoprotein, kuljettaa lipidejä verenkierrosta takaisin maksaan LDL Low Density Lipoprotein, kuljettaa lipidejä maksasta soluille IDL Intermediate Density Lipoprotein, kuljettaa lipidejä maksasta soluille VLDL Very Low Density Lipoprotein, kuljettaa lipidejä maksasta soluille ApoA-I HDL:n pinnalla oleva Apolipoproteiini A-I ApoB-100 LDL:n pinnalla oleva Apolipoproteiini B-100 CHOL Kolesteroli, lipidimolekyyli, jota solut tarvitsevat mm. soluseinän rakenneosana CHES Kolesteroliesteri, kolesterolin varastomuoto TRIOL Trioleaatti, lipideihin kuuluva triglyseridi koostuu glyserolista, johon on liittyneenä kolme öljyhappoa POPC Palmitoyylioleaattifosfatidyylikoliini, fosfolipideihin kuuluva fosfatidyylikoliini, jonka glyserolirunkoon on liittyneenä kaksi rasvahappoa ja yksi fosfaattiryhmä, johon edelleen on liittyneenä koliini LysoPC Palmitoyylifosfatidyylikoliini, fosfatidyylikoliini, josta on entsymaattisesti katkaistu toinen rasvahappohäntä

1. Lyhenteet ja symbolit 2 TRIOL-2, TRIOL-4 Simuloidut trioleaattipisarat, joiden säteet ovat 2 nm ja 4 nm TRIOL-pinta Tasaisen trioleaattilevyn simulaatiosysteemi HDL-ydin, LDL-ydin HDL:n ja LDL:n sisusmolekyylit sisältävät simulaatiosysteemit HDL-lipoprot, LDL-lipoprot HDL:n ja LDL:n simulaatiosysteemi HDL-emulsio, LDL-emulsio HDL:n ja LDL:n sisusmolekyylit ja fosfolipidit sisältävät simulaatiosysteemit MD Molekyylidynamiikka LJ Lennard-Jones vuorovaikutus P Paine P N Partikkelin säteen suuntainen painekomponentti P T Partikkelin tangentin suuntainen painekomponentti σ Pintajännitys R Pallomaisen partikkelin Laplacen säde, eli sen pinnan säde, jolla pintajännitys vaikuttaa r Säde, etäisyys partikkelin massakeskipisteestä i, j, k, h Kemiallisiin sidoksiin osallistuvat partikkelit F i Partikkeliin i vaikuttava voima v i Partikkelin i nopeus δt Aika-askel V Potentiaalienergia

1. Lyhenteet ja symbolit 3 m i Partikkelin i massa r i Partikkelin i paikkavektori r ij Partikkelien i ja j välinen etäisyys b ij Partikkelien i ja j välinen energiaminimietäisyys θ ijk Partikkelien i, j ja k välinen kulma θ 0,ijk Partikkelien i, j ja k välinen energiaminimin mukainen kulma q i, q j Partikkelien i ja j varaukset k θ ijk Sidoksen taipumista kuvaava voimavakio k ij Sidoksen venymistä kuvaava voimavakio k Dihedraalikulman taipumisen voimavakio n Dihedraalikulman taipumisen energiaminimien lukumäärä ω ijkl Dihedraalikulman taipumisen arvo ω s Dihedraalikulman taipumisen referenssiarvo σ ij Lennard-Jones vuorovaikutuksen referenssipituus ε ij Lennard-Jones vuorovaikutuksen vahvuus ε rel Suhteellinen permittiivisyys

4 2. JOHDANTO Sydän- ja verisuonitaudit ovat kehittyneissä maissa yleisin kuolinsyy. Sydäninfarktiin usein johtava ateroskleroosi ja siihen oleellisesti kytkeytyvät lipoproteiinit ovat tärkeytensä vuoksi laajalti tutkittu ala. Ateroskleroosi kehittyy, kun LDL-partikkelit jäävät kiinni verisuonten sisäkalvoon (tunica intima), hapettuvat ja aiheuttavat tulehdusreaktion [1]. LDL-partikkelien fuusioituminen edesauttaa niiden kiinnittymistä sisäkalvon sidekudosverkkoon ja täten ateroskleroosin syntyä [2]. Toisin sanoen estämällä partikkelien fuusioituminen pienennettäisiin ateroskleroosin käynnistymisen todennäköisyyttä. Partikkelien pintajännitys on tärkeä tekijä partikkelien fuusioitumisessa: pintajännitykseltään suuret partikkelit fuusioituvat helposti. Pintajännitys määrää myös partikkelien muodon ja koon. Yksittäisiä lipoproteiineja ja niiden fuusioitumista ei juurikaan voida pienen kokonsa vuoksi tutkia suoraan kokeellisesti. Kuitenkin lipoproteiineja vastaavien rakenteiden pintajännitystä on mitattu tensiometrillä [3]. Lipoproteiinin mallina on näissä kokeissa useimmiten millimetrin kokoluokkaa oleva öljypisara, jonka päälle on lisätty fosfolipidejä ja/tai polypeptidejä/proteiineja. Useimmat näistä tutkimuksista koskevat proteiinien adsorpoitumista öljyn tai fosfolipidien pinnalle ja proteiinin eri osien toiminnallisuutta [4 6]. Koejärjestelyt eivät täysin vastaa lipoproteiinipartikkeleja, sillä kokeissa käytetty pisara on makroskooppinen nanoskaalan sijaan, ja lipoproteiineissa on todellisuudessa vain muutama apolipoproteiini millilitrojen sijaan. Tutkimuksissa on havaittu, että vesi-öljy-rajapinnalle lisätty fosfolipidikerros vähentää pintajännitystä [6]. Proteiinien vaikutuksesta tiedetään, että niiden hydrofobiset osat absorboituvat vesi-öljy -rajapinnalle lujemmin ja hydrofiilisemmät osat taas heikommin, niin että ne pystyvät tasoittamaan pintajännityksen muutoksia irtoamalla ja taas liittymällä pintaan [7]. Proteiinien vaikutusta fosfolipidipäällysteisen öljypisaran pintajännitykseen ei ole varsinaisesti tutkittu, mutta A. Ledford tutkimusryhmineen on havainnut tutkimiensa peptidisekvenssien alentavan tällaisen dropletin pintajännitystä [6]. Molekyylidynamiikka(MD)-simulaatiot on yksi mahdollinen tapa saada yksityiskohtaisempaa tietoa yksittäisistä lipoproteiinipartikkeleista. Nykyiset MD-menetelmät mahdollistavat lipoproteiinipartikkelien simuloimisen oikeilla molekyylisuhteilla. Pintajännityksen laskeminen simulaatiotuloksista paineprofiilien avulla on tullut mahdolliseksi vasta hiljattain [8].

2. Johdanto 5 Simulaatioilla pyritään usein saamaan varmuutta kokeellisiin tuloksiin tai osoittamaan, että tutkimusta on jatkettava, mikäli nykyisten kokeellisten tulosten valossa simulaatioita ei pystytä rakentamaan niiden kanssa yhteensopiviksi. Näin simulaatioiden perusteella voidaan myös suunnata jatkotutkimusta tuloksia antavaan suuntaan. Mikäli simulaatiotulokset ovat yhdensuuntaiset kokeellisten tulosten kanssa, voidaan simulaation mallia parhaassa tapauksessa käyttää ennustamaan mallin kuvaaman systeemin ominaisuuksia ja käyttäytymistä. Ennustamisesta on suurta hyötyä etenkin sellaisissa systeemeissä, joita ei niiden ominaisuuksien vuoksi voida helposti tutkia kokeellisesti; rajoittava tekijä voi olla esimerkiksi tutkittavan systeemin kompleksisuus tai pieni koko. Tämän tutkimuksen ja aiheeseen liittyvien jatkotutkimusten tarkoituksena on selvittää, saadaanko karkeistetuilla molekyylidynamiikkasimulaatioilla kokeellisia tuloksia vastaavia arvoja erilaisten lipoproteiinikompleksien ja niiden modifikaatioiden pintajännityksille. Tämän jälkeen voidaan arvioida, miten yksittäisten proteiinien lisäys öljypisaran pinnalle ja pisaran suuri kaarevuus vaikuttavat pisaran pintajännitykseen. Kun nämä asiat tunnetaan, voidaan tehdä johtopäätöksiä tensiometrikokeiden tulosten pätevyydestä lipoproteiineihin. Myös simulaatiomallin muiden mahdollisten sovelluskohteiden vuoksi on syytä tarkistaa siitä määritetyn pintajännityksen oikeellisuus. Tensiometrillä mitattuja kokeellisia tuloksia on julkaistu pelkän trioleaattipisaran, siihen lisätyn fosfolipidikerroksen sekä edelleen tähän lisätyn proteiinisekvenssin pintajännityksistä. Tämän vuoksi työssä tehtiin kolme simulaatiosarjaa: 1) erikokoiset trioleaattipisarat vedessä, 2) kokonainen HDL-partikkeli, HDL-partikkeli ilman apolipoproteiinia ja HDL-partikkeli josta on poistettu apolipoproteiini ja lipidiyksöiskalvo sekä 3) samat variaatiot LDL-partikkelista. Mallien lähtökohtana toimivat tutkimusryhmässämme aiemmin kehitetyt karkeistetut lipoproteiinimallit LDL:stä ja HDL:stä [2, 9]. Näitä malleja käytettiin suoraan ja niistä muokkaamalla saatiin loput alkurakenteet simulaatioille. Simulaatiot toteutettiin GROMACS -MD-ohjelmalla [10] [11], ja tarvittavat parametrit saatiin MARTINI-voimakentästä [12]. Simuloitujen partikkelien pintajännitykset laskettiin paineprofiilien avulla [8]. Työni teoriaosuudessa perehdyn tarkemmin molekyylidynamiikkasimulaatioihin, pintajännitykseen sekä lipoproteiinien biologiaan ja biokemiaan. Materiaalit ja metodit -luvussa kuvataan tarkemmin työssä käytetyt lipoproteiinimallit sekä pintajännityksen laskeminen. Työn loppuosa keskittyy pohtimaan tuloksia ja niiden merkitystä.

6 3. TEORIA 3.1 Lipoproteiinit 3.1.1 Lipoproteiinien metabolia ja lipidien kuljetus elimistössä Lipidit ovat monimuotoinen ryhmä molekyylejä, joille tunnusomaista on niiden heikko liukeneminen veteen ja muihin polaarisiin liuottimiin. Lipideihin kuuluvat muun muassa fosfolipidit, triglyseridit ja sterolit, kuten kolesteroli. Elimistö käyttää ravinnosta saatuja ja syntetisoituja lipidejä muun muassa solukalvojen rakennusaineena, solusignaloinnissa, solunsisäisessä kuljetuksessa ja energiavarastona. Lipidien kuljetus elimistössä on täten välttämätöntä. [13] Lipidien hydrofobisten (vesipakoinen, vrt. hydrofiilinen eli vesihakuinen) osien vuoksi ne muodostavat proteiinien kanssa vesiliukoisia lipoproteiineiksi kutsuttuja molekyylikomplekseja voidakseen kulkeutua veressä, josta suurin osa on vettä. Lipoproteiinit ovat pallomaisia nanopartikkeleja, joilla on lipideistä koostuva hydrofobinen sisus, jota peittävät amfipaattiset (molekyylillä on sekä hydrofiilinen että hydrofobinen osa) surfaktanttimolekyylit (surfaktantti = pintajännitystä alentava aine). Elimistön lipoproteiinit jaetaan tiheytensä perusteella viiteen luokkaan, jotka eroavat myös kokonsa, koostumuksensa ja toimintansa suhteen. [1, 13] Ravinnon mukana tulleet lipidit pilkotaan rasvahapoiksi ohutsuolessa, josta ne kulkeutuvat suolen pintasoluihin ja pakkautuvat yhdessä kolesterolin kanssa kylomikroneiksi (chylomicrons) kutsuttuihin lipoproteiineihin. Kylomikronit kulkeutuvat imusuoniston kautta verenkiertoon. Kylomikronit kuljettavat rasvahappoja lihassoluille, ja partikkelin jäänteet kulkeutuvat maksaan. Maksa voi käyttää loput molekyylit energiaksi, ja ylimääräiset triasyyliglyserolit pakataan VLDL -komplekseihin (VLDL = very low density lipoprotein). [1, 13] VLDL kuljettaa edelleen triglyseridejä ja kolesterolia soluille. Lipoproteiinilipaasientsyymin hajotettua VLDL:n lipidejä ja partikkelin tiheyden muututtua syntyy IDL (intermediate density lipoprotein), ja edelleen IDL:n jäännepartikkelina muodostuu LDL (low density lipoprotein). Sekä IDL että LDL kuljettavat myös kolesterolia ja triglyseridejä soluille. Maksassa on reseptoreja LDL:lle, VLDL:lle ja kylomikroneille. [1, 13] HDL (high density lipoprotein) kuljettaa kolesterolia soluista takaisin verenkiertoon. HDL muodostuu maksassa apolipoproteiini Apo A-I:n ja fosfolipidien muo-

3. Teoria 7 dostamana levymäisenä partikkelina. Se kerää pintaansa kolesterolia solujen solukalvoista ja muuntaa sitä hydrofobiseksi kolesteroliesteriksi, joka täyttää HDL:n hiljalleen muuttaen partikkelin pallomaiseksi. Erilaiset siirtäjäproteiinit muokkaavat lipoproteiinien koostumusta siirtämällä kolesterolia ja fosfolipidejä niiden välillä. Luovuttamalla kolesteroliesteriä VLDL-IDL-LDL -ketjun lipoproteiineille HDL voi kerätä edelleen lisää kolesterolia soluista. [1, 13] 3.1.2 Ateroskleroosi Ateroskeloosi on sydän- ja verisuonitauti, jossa valtimoiden kovettuminen ja kaventuminen vaikeuttaa veren virtausta. Tällöin valtimon sisäkalvoon kerääntyy kolesterolia, jonka päälle muodostuu kova kollageenikatto (fibrous cap). Kollageenikaton repeäminen johtaa kolesterolin purkautumiseen hyytymänä (thrombus) intimasta valtimononteloon, mikä usein aiheuttaa veritulpan. Erityisen kohtalokas trombi on aivoverisuonissa tai sepelvaltimossa, joissa se voi aiheuttaa aivo- tai sydäninfarktin. [13] Ateroskleroosin alkuvaiheista on useita teorioita. Yhden selityksen mukaan taudin kehittyminen alkaa, kun kolesterolia kertyy valtimon sisäkalvoon sitä kuljettavien LDL-partikkelien jäädessä kiinni endoteelin alla olevaan, proteoglykaaneista koostuvaan sidekudosverkkoon. LDL-partikkelit jäävät negatiivisesti varautuneeseen verkkoon kiinni niiden apolipoproteiinin (apob-100) positiivisesti varautuneiden, proteoglykaaneihin sitoutuvien osien vuoksi [14]. Jos LDL-partikkelit jäävät pitkäksi aikaa kiinni verkkoon, niiden sisältämät rasvahapot alkavat hapettua tai niiden rakenne alkaa hajota aiheuttaen partikkeleiden epästabiilisuuden ja fuusion. Fuusioituneet ja hapettuneet LDL-partikkelit houkuttelevat paikalle makrofageja, jotka fagosytoivat partikkelit. Muuntuneita LDL-partikkeleja sisältäviä makrofageja kutsutaan vaahtosoluiksi (foam cells). [13] On huomattava, että vaahtosolujen muodostamia rasvajuosteita tavataan jo muutaman kuukauden ikäisillä lapsilla, ja ateroskleroosista voitaneenkin puhua vasta, kun kolesterolia kertyy myös vaahtosolujen ulkopuolelle. Tällöin kyseessä on aterooma eli kolesteroliydin, jonka päälle syntyy kollageenikatto. Kollageenikaton ohentuminen ja tätä edesauttava tulehdusreaktio johtavat helposti katon rikkoutumiseen ja trombin syntyyn. [1] HDL-partikkelit voivat intimaan kulkeutuessaan poistaa vaahtosoluista kolesterolia ja kuljettaa sen takaisin verenkiertoon, ehkäisten näin ateroskleroosin etenemistä. Tämän vuoksi HDL-partikkeleja kutsutaan usein "hyväksi kolesteroliksi"ja LDL:ää taas "pahaksi kolesteroliksi", ja terveydenhuollossa pyritään monin keinoin saamaan LDL:n määrä verenkierrossa vähenemään ja HDL:n määrä kasvamaan. Tutkimukset ovat osoittaneet, että vaahtosolut voivat muuttua takaisin makrofageiksi, jos niistä virtaa riittävästi kolesterolia pois. Tämä on voitu osoittaa lisäämällä vaahtosolujen

3. Teoria 8 kasvatusmaljoille ja ateroskleroottisiin eläimiin kolesteroliakseptoreja. [15] 3.1.3 Lipoproteiinien rakenne Lipoproteiinit ovat pallomaisia biokemiallisia komplekseja, jotka koostuvat proteiineista ja lipideistä. Proteiini(t) ja amfipaattiset lipidit muodostavat yksinkertaisen kalvon (monolayer), joka suojaa hydrofobisia sisusmolekyylejä vesimäisessä ympäristössä; veressä. Rakennetta koossa pitävät voimat ovat ei-kovalenttisia. Yleisnimi tämänkaltaiselle rakenteelle on mikroemulsiopartikkeli. Apolipoproteiini on paikoitellen kosketuksessa hydrofobisiin molekyyleihin. Kuva 3.1 havainnollistaa lipoproteiinien kaksijakoista rakennetta ja proteiinin sijaintia partikkelin pinnalla. Lipoproteiinipartikkelien koko vaihtelee aina niiden tyypin ja kierron vaiheen mukaan välillä 7-1000 nm. Kuten yllä kuvattiin, lipoproteiinit jaetaan viiteen ryhmään: tämä tutkimus käsittelee HDL:ää ja LDL:ää. [13] LDL-partikkeleiden sisuksessa on keskimäärin 170 triglyseridi- ja 1600 kolesteroliesterimolekyyliä. Muutama prosentti jälkimmäisistä molekyyleistä sijaitsee partikkelin pinnalla. Kolesterolia LDL-partikkeleissa on keskimäärin 600 molekyyliä, joista osa on partikkelin pintaosissa ja loput sisuksessa. Partikkelin pinta koostuu kolesterolin lisäksi 700 fosfolipidistä (joista keskimäärin 450 fosfatidyylikoliinia, 80 lysofosfatidyylikoliinia, 185 sfingomyeliiniä, 10 fosfatidyylietanolamiinia, 7 diasyyliglyserolia ja 2 seramidia) ja yhdestä 4536 aminohappoa pitkästä apob-100 -apolipoproteiinista [16]. LDL-partikkelien halkaisija on keskimäärin noin 20-25 nm, mutta niiden koko ja tiheys vaihtelevat. [17] HDL-partikkelit ovat keskimäärin pienempiä kuin LDL-partikkelit. Niiden halkaisija on luokkaa 10 nm. Kummassakin partikkelissa on samoja molekyylejä eri suhteissa. HDL:ssä on paljon enemmän fosfolipidejä ja triglyseridejä, ja vähemmän kolesterolia ja kolesteroliesteriä kuin LDL:ssä [2]. Partikkelin pinnalla on sen kierron vaiheen mukaisesti yksi tai useampi 243 aminohappoa pitkää apoa-i -apolipoproteiinia [18]. HDL-partikkelit voidaan edelleen luokitella HDL3:ksi, HDL2:ksi ja kiekkomaiseksi (discoidal) HDL:ksi. Tämän vuoksi on vaikea määritellä keskimääräisen HDL-partikkelin tarkkaa molekyylikoostumusta. HDL-partikkelit muodostuvat maksassa fosfolipideistä ja apoa-i:sta ja erittyvät verenkiertoon kiekkomaisina rakenteina, joissa apolipoproteiini kiertää aitamaisesti kaksoiskalvoksi asettuneita fosfolipidejä suojaten niiden hydrofobisia osia. HDL:n kerätessä ylimääräistä kolesterolia toisilta lipoproteiineilta ja solujen membraaneista sen muoto muuttuu pallomaisemmaksi. [1] [17]

3. Teoria 9 Kuva 3.1: Kaavakuva LDL:n rakenteesta. Kuvassa tummansinisellä fosfatidyylikoliinit ja vaaleansinisellä sfingomyeliinit (surfaktanttimolekyylit), keltaisella kolesteroliesterit, punaisella kolesteroli ja vihreällä triglyseridit (sisusmolekyylit) sekä harmaalla apolipoproteiini (apob-100). [17] 3.1.4 Molekyyleistä Kolesterolilla (CHOL) on tärkeä merkitys eläinsolujen solukalvon rakennetta vahvistavana osana; kolesteroli asettuu membraanin lipidikaksoiskalvossa lipidien hydrofobisten häntien väliin rajoittaen niiden liikkuvuutta. Kolesteroli tulee maksaan joko lipoproteiinien mukana elimistöstä tai se syntetisoidaan. Maksassa kolesteroli voidaan varastoida kolesteroliesterinä, erittää sappeen sappinesteessä edistämään ruuansulatusta tai erittää edelleen vereen VLDL:n mukana. Kolesteroliesteri (CHES) on kolesterolin varastointi- ja kuljetusmuoto. Yleisin kolesteroliesteri on kolesterolioleaatti. Triglyseridit ovat rasvojen ryhmä, joissa glyserolin kolmeen hydroksyyliryhmään (-OH) on liittyneenä kolme (eri) rasvahappoa; trioleaatin (TRIOL) tapauksessa kolme 18 hiilen pituista, tyydyttynyttä öljyhappoa [13]. Fosfolipidit ovat triglyseridien tapaan glyserolin ja rasvahappojen estereitä, mutta niissä yksi glyserolin hydroksyyli-ryhmä on korvautunut fosfaattiryhmällä (katso kuva 3.2). Fosfaattiryhmään voi edelleen liittyä jokin alkoholi. Fosfolipidien hydrofobisia rasvahappo-osia kutsutaan joskus hänniksi (tail) ja hydrofiilista glyserolija fosfaattiosaa pääksi (head). Eniten lipoproteiineissa on fosfolipideistä fosfatidyylikoliinia, lysofosfatidyylikoliinia ja sfingomyeliiniä. Fosfatidyylikoliinissa (esim. palmitoyylioleaattifosfatidyylikoliini (POPC) ) fosfaattiryhmään on liittynyt koliini. Lysofosfatidyylikoliinin (esim. palmitoyylifosfatidyylikoliini (lysopc) ) rakenne syntyy, kun fosfatidyylikoliinista poistetaan toinen rasvahappohäntä fosfolipaasien katalysoimassa reaktiossa. Sfingomyeliini on fosfatidyylikoliinia vastaava rakenne, jossa

3. Teoria 10 glyserolin ja yhden rasvahapon tilalla on seramidi (sfingosiini liittyneenä rasvahappoon). Yllä mainittujen lipoproteiinien yleisimpien molekyylien rakennekaavat on esitetty kuvassa 3.2. [13] Apolipoproteiinien tehtävänä on muun muassa sitoutua lipoproteiinireseptoreihin ja ohjata näin lipoproteiinien kulkua ja muuntautumista elimistössä. ApoB-100 - apolipoproteiinia on VLDL-IDL-LDL-ketjun lipoproteiineissa. LDL:n pinnalla on yksi tälläinen 4536 aminohappoa pitkä proteiini [16]. HDL:n pinnalla on yksi tai useampia 243 aminohappoa pitkää ApoAI-apolipoproteiinia [18]. Kuva 3.2: Lipoproteiinien yleisimpien ja simulaatioissa käytettyjen molekyylien kaavat. Vasemmalta oikealle: kolesteroli (CHOL), kolesteroli-oleyyliesteri (CHES), palmitoyylifosfatidyylikoliini (lysopc), palmitoyylioleaattifosfatidyylikoliini (POPC) ja trioleaatti (TRIOL). 3.2 Pintajännitys Pintajännitys (Surface tension) on kahden faasin välisen rajapinnan energia yksikköpinta-alaa kohden (pintajännityksen yksikkö on [ J m 2 ] tai [ N m ]). Sitä voidaan kuvailla energiaerona rajapinnalla sijaitsevan molekyylin ja bulkkimolekyylin eli kokonaan

3. Teoria 11 toisessa faasissa sijaitsevan molekyylin välillä. Näiden kahden molekyylin energiassa on ero, sillä niihin kohdistuvat vuorovaikutukset ovat erilaiset; molekyylin oman faasin toiset molekyylit vetävät sitä puoleensa ja toisen faasin hylkivät. Toisaalta pintajännitys voidaan määritellä uuden rajapinnan luomiseen molekyylejä liikuttelemalla vaadittavana energiana luotua alaa kohden. [19] Mekaanisen tasapainon saavuttamiseksi jonkin voiman on tasapainotettava pintajännitystä. Pallomaisissa systeemeissä (esim. ilmakupla vedessä) tämä voima on pinnansisäinen paine, jonka pintajännitys luo pyrkiessään pienentämään pinnan alaa [19]. Young-Laplacen yhtälö (alla) kuvaa tätä suhdetta pinnan kaarevuuden ja pinnan ulkoisen ja sisäisen paineen erossa. Yhtälö voidaan johtaa (pallomaisille partikkeleille) mikromekaanisesti ja termodynaamisesti [20]: ΔP = 2σ R, (3.1) jossa ΔP on sisäisen ja ulkoisen paineen erotus, σ on pintajännitys ja R on pallomaisen partikkelin säde, jota kutsutaan myös Laplacen säteeksi (surface of tension). Pintajännitystä pidetään kahden aineen rajapintaan liittyvänä vakiona, mutta vain tiettyyn kaarevuuteen asti. Pintajännitys saattaa riippua pinnan kaarevuudesta etenkin erittäin pienillä partikkeleilla (joilla on suuri kaarevuus). Lipoproteiinipartikkelien säteet ovat nanometrin kokoluokkaa, joten niiden tapauksessa kaarevuuden vaikutus pintajännitykseen saattaa olla merkittävä. Tällöin pintajännityksen (σ) riippuvuus kaarevuudesta tulisi ottaa huomioon yhtälössä 3.1. [20] 3.2.1 Pintajännitys lipoproteiineissa Lipoproteiineissa pintajännitys on seurausta hydrofobisen ytimen ja veden kontaktista. Pintajännitys pyrkii minimoimaan pinnan alan, mikä luo painetta partikkelin sisälle. Toisaalta pinnan yksinkertainen lipidikalvo suojaa lipoproteiinin ydintä suoralta kosketukselta veden kanssa ja näin ollen pienentää pintajännitystä [6]. Partikkelin kokonaispintajännitys riippuu pintamolekyylien määrän suhteesta sisusmolekyylien määrään ja pintamolekyylien ominaisuuksista. Koska lipoproteiinit ovat jatkuvasti dynaamisessa tilassa vaihtaessaan molekyylejä sekä keskenään että solujen kanssa, muuttuvat niiden molekyylisuhteet sekä pintajännitys jatkuvasti. LDL:n tapauksessa apolipoproteiinien uskotaan tasapainottavan lipoproteiinien pintajännityksen muutoksia muodostamalla vähemmän affinitiivisten osiensa avulla partikkelin pinnasta irti olevia silmukoita, jotka voivat tarvittaessa kiinnittyä takaisin lipoproteiinin pinnalle [7]. Pintajännityksen suuruudesta tai riippuvuuksista yksittäisen lipoproteiinipartikkelin pinnalla ei tiettävästi ole olemassa aikaisempia tutkimuksia.

3. Teoria 12 Pintajännitys saattaa vaikuttaa lipoproteiinien fuusioitumiseen, sillä korkea pintajännitys vaatii pienempää alaa, joka voidaan saavuttaa fuusioitumalla. Tämä voidaan nähdä emulsiopartikkelikokeissa, joissa pintajännityksen kasvattaminen nopeuttaa emulsiopartikkelien fuusiota [19]. Toisaalta pintajännitys pitää partikkkelit pallonmuotoisina, koska silloin ala minimoituu suhteessa tilavuuteen; tämä saattaa olla tilanne maksassa syntyvissä kiekkomaisissa HDL-partikkeleissa. 3.2.2 Pintajännityksen mittaaminen kokeellisesti Kokeellisesti pintajännitystä voidaan mitata tensiometrillä, jonka rakennetta on selvennetty kuvassa 3.3. Tensiometri koostuu kolmesta pääosasta: optisesta kyvetistä, johon pisara pumpataan pipetin kautta ja nesteet lisätään, kamerasta, joka kuvaa pipetin kärkeen muodostuvan pisaran profiilin sekä ohjelmistosta, joka määrittää pisaran kuvasta sen alan, tilavuuden ja pintajännityksen. Pintajännityksen laskuun ohjelma käyttää Young-Laplacen yhtälön yleistä muotoa [3]. Ymmärrettävästi pipetin kärkeen muodostuva pisara on millimetrien kokoluokkaa kuvattavuuden ja siitä syntyvien virherajojen vuoksi, mikä on melko kaukana lipoproteiinipartikkelien todellisesta säteestä, joka on nanometrien luokkaa. [3] Kuva 3.3: Havainnollistus S. Ledfordin tutkimusryhmän koejärjestelyistä [3] (kuvaa muokattu) trioleaattipisaran pintajännityksen mittaamiseksi tensiometrillä. Ensin (1) kyvettiin, jossa on vettä, muodostetaan pipetin kärkeen trioleaattipisara. Veteen lisätyt "Intralipid" -fosfolipidit kiinnittyvät trioleaatin pintaan. Seuraavaksi (2) liuokseen lisätään ApoB-fragmentit, jotka edelleen kiinnittyvät pisaran pintaan. Pisaran pintajännitys määritetään ottamalla kuva pisaran profiilista. S. Ledfordin ryhmä [6] tutki kahden eri apob -fragmentin toimintaa lisäämällä trioleiinipisaran (10 μl ) päälle ensin fosfolipidikerroksen ("Intralipid"niminen kaupallinen liuos) ja sen jälkeen 15μl toista apob -fragmenteista (apob20.1 tai apob19). Sama koe tehtiin myös lisäämällä fragmenttia suoraan trioleiinipisaran päälle ilman fosfolipidikerrosta. Pintajännityksen muutosta tarkkailtiin tensiometrin avulla. Koejärjestelyjä on havainnollistettu kuvassa 3.3. Ensimmäisessä kokeessa havaittiin fosfolipidikerroksen vähentävän pintajännitystä noin 10 mn/m (32 mn/m

3. Teoria 13 22 mn/m) ja apob:n noin 11 mn/m (22 mn/m 11 mn/m). Toisessa kokeessa havaittiin vastaava ero pelkän apolipoproteiinin kanssa; apob pudotti trioleaattipisaran pintajännitystä noin 20 mn/m (32 mn/m 11 mn/m). Tämän tuloksen valossa vaikuttaisi siltä, että fosfolipidikerroksen merkitys pintajännitykselle olisi merkityksetön kun pinnalla on apob-proteiinia. Tutkimuksen tekijät eivät kiinnitä asiaan suuresti huomiota, sillä heidän kokeensa tarkoitus oli tutkia apob-fragmenttien eroavaisuuksia pintaan sitoutumisessa. On kuitenkin mahdollista, että kokeessa apolipoproteiinifragmentit peittivät koko pisaran, ja ensimmäisessä kokeessa mahdollisesti syrjäyttivät fosfolipidit pisaran pinnalta. Tällöin molemmissa kokeissa mitattu noin 11 mn/m pintajännitys vastaisi tilannetta, jossa trioleiinipisaran pinnalla on vain ApoB-fragmenttia eikä fragmentin ja fosfolipidien sekoitusta kuten oikeassa lipoproteiinipartikkelissa. Pintajännityksen arvot pelkälle trioleaatille, trioleaatille ja fosfolipidikerrokselle sekä trioleaatille, fosfolipikerrokselle ja apob:lle on koottu taulukkoon 3.1. Myös Donald M. Smallin ryhmän tekemien tutkimusten [4, 5] mukaan apobsekvenssien lisääminen vesi-trioleiini-rajapinnalle laskee pisaran pintajännitystä. Heidän tutkimuksistaan käy myös ilmi, että apob-proteiinin eri osilla on erilainen affiniteetti trioleiiniin ja voivat näin ollen vastustaa pintajännityksen muutoksia irtoamalla ja kiinnittymällä jälleen pisaran pintaan. [7] Tutkimus toteutettiin muuttamalla trioleaattipisaran tilavuutta pumppaamalla sitä tensiometrin pipetillä. Koetilanne Pintajännitys (mn/m) Trioleaatti 32 Trioleaatti ja Intralipidi 22 Trioleaatti, Intralipidi ja apolipoproteiinisegmentti 11 Trioleaatti ja apolipoproteiinisegmentti 11 Taulukko 3.1: Yhteenveto lipoproteiinimallien pintajännityksen kokeellisista mittauksista [6]

14 4. MENETELMÄT JA MATERIAALIT 4.1 Molekyylidynamiikka Monia fysikaalisia ominaisuuksia on vaikeaa mitata kokeellisesti pienistä systeemeistä, nanoskaalasta usein mahdotonta. Molekyylidynamiikkasimulaatiot ovat yhä käytetympi väline arvioimaan pienen skaalan tapahtumia ja suureita. Simulaatioiden etuja ovat usein niiden nopeus ja halvat kustannukset, etenkin verrattuina kokeellisiin tutkimuksiin. Simulaatioiden suurimmat rajoitukset ovat lyhyet simulaatioajat, suhteellisen pienet systeemien koot ja mallien epätarkkuus. Systeemien kokoa ja simulaatioaikoja voidaan kuitenkin kasvattaa karkeistamalla simulaatiomalleja; tällöin kuitenkin simulaation tarkkuus heikkenee. Simulaatioita ei niissä käytettyjen approksimaatioiden ja karkeistusten vuoksi yksistään voida käyttää osoittamaan mitään ilmiötä todeksi, vaan tueksi tarvitaan aina myös kokeellisia tuloksia. Nykyään matemaattista mallinnusta ja simulaatioita käytetään esimerkiksi tehokkaaseen tiedon keräämiseen jo saavutetuista kokeellisista tuloksista, kompleksisten ja monia muuttujia sisältävien systeemien toiminnan ennustamiseen sekä kokeellisen tutkimuksen ohjaamiseen malleista paljastuvien havaintojen avulla. Yllättävää kyllä, lipoproteiineja on tutkittu molekyylidynamiikka (MD)-simulaatioiden avulla melko vähän, ja näissä tutkimuksissa on keskitytty muun muassa apolipoproteiinin mallintamiseen levymäisen lipoproteiinimallin pinnalla [21] ja lipoproteiinien rakenteeseen [22]. Tässä tutkimuksessa tutkitaan HDL- ja LDL-partikkelien pintajännitystä MD-simulaatioiden avulla. Tutkimuksessa käytetään GRO- MACS MD -ohjelmistoa ja partikkelit on mallinnettu karkeistetusti (coarse graining, CG). Karkeistamisella pyritään keventämään simulaatioita jättämällä tuloksen kannalta epärelevantteja tekijöitä huomiotta. Käytännössä sillä tarkoitetaan usein useamman atomin ryhmän käsittelemistä yhtenä ominaisuuksiltaan yhtenäisenä kokonaisuutena, simulaatiopartikkelina (simulation bead). MD-simulaatioiden lähtökohtana on alkurakenne, joka kertoo mallinnettavan systeemin simulaatiopartikkelien sijainnit koordinaatistossa ja niiden alkunopeudet. Voimakenttä (forcefield, FF) taas kuvaa systeemin simulaatiopartikkelien väliset vuorovaikutukset potentiaaliyhtälöiden avulla. [11] Alkurakenteesta systeemiä simuloidaan ratkaisemalla tietyn aika-askeleen välein Newtonin liikeyhtälöstä (=Newtonin toinen laki) uudet koordinaatit ja nopeudet simulaatiopartikkeleille [10]. Riittävän pitkän simulaation jälkeen voidaan systee-

4. Menetelmät ja materiaalit 15 mi todeta stabiloituneeksi, ja simulaatiosta saatujen eri ajanhetkien koordinaattien ja nopeuksien (trajektorien) avulla voidaan määrittää haluttuja suureita tai todeta ilmiöitä. On huomattava, että MD-simulaatioissa molekyylien konfiguraatio ei koskaan muutu, ainoastaan konformaatio. Toisin sanoen kemiallisia sidoksia ei katkea tai muodostu, vaan kaikki systeemin (kovalenttiset) sidokset annetaan simulaatiolle alkurakenteessa. Useimmiten simulaatiopartikkelien vuorovaikusta kuvataan viidellä eri potentiaaliyhtälöllä, joista on kerrottu tarkemmin MARTINI-voimakentän yhteydessä. Näistä viidestä eri vuorovaikutustyypistä laskettujen potentiaalienergioiden summasta V saadaan ratkaistua yhteen partikkeliin i kohdistuva kokonaisvoima: F i = V (4.1) josta edelleen saadaan ratkaistua partikkelin i uusi paikka ja nopeus integroimalla numeerisesti Newtonin liikeyhtälöä; jossa m i on partikkelin i massa ja r i paikka. [10] m i d 2 r i dt 2 = F i (4.2) GROMACS-ohjelmisto käyttää ns. leap frog -algoritmia partikkelien uusien sijaintien ja nopeuksien laskemiseen. Se tarkoittaa, että partikkelin paikkaa ja nopeutta ei lasketa samalla ajanhetkellä, vaan vuorotellen (algoritmin nimi tullee ajatuksesta toistensa yli hyppivistä sammakoista). Matemaattisesti leap frog -algoritmi näyttää tältä [11]: v i (t + δt 2 ) = v i(t δt 2 ) + F i (t) δt (4.3) 2m r i (t + δt) = r i (t) + v i (t + δ t )δt (4.4) 2 Simuloitavalle systeemille määritellään myös olosuhteet; tilavuus, lämpötila ja paine. Tilavuus määräytyy simulaatiolaatikon (simulation box) koon mukaan. Laatikon kokoa ja muotoa määritettäessä on otettava huomioon MD-simulaatioissa usein käytetyt periodiset reunaehdot (periodic boundary conditions, PBC), joilla tarkoitetaan, että määritellyn simulaatiolaatikon reunasta ajatellaan alkavan uudelleen saman laatikon vastakkainen reuna. Toisin sanoen laatikon reunan ylittävä molekyyli

4. Menetelmät ja materiaalit 16 palaa laatikkoon toiselta reunalta. Tällä menettelyllä vältetään keinotekoisten reunojen vaikutus systeemiin, kun sitä ajatellaan suuremman systeemin pienenä, kaukana todellisista reunoista sijaitsevana osana. Laatikon on kuitenkin oltava riittävän suuri, jotta suuret molekyylit eivät vuorovaikuta itsensä kanssa reunojen yli. Systeemin lämpötila ja paine määritellään parhaiten systeemin luonnollista tilaa kuvaavaksi, ja useimmiten niiden pysyminen säädetyn arvon tuntumassa varmistetaan skaalaamalla partikkelien nopeuksia ja laatikon kokoa Berendsenin algoritmilla. Tämä algoritmi tasoittaa simulaation kuluessa tilavuus-paine-lämpötila suhteen sopivaksi. [10] 4.2 Voimakentän parametrit Tässä tutkimuksessa simulointiin käytettiin karkeistettua MARTINI -voimakenttää 1, sillä kohtuullisen suurien systeemien ollessa kyseessä se mahdollisti riittävän suuret ja pitkät simulaatiot antaen kuitenkin tulosten laskuun riittävän tarkkuuden. MARTINI karkeistaa molekyylien rakenteen siten, että noin neljän atomin (vetyä ei tässä yhteydessä huomioida atomina) ominaisuuksiltaan yhtenäinen ryhmä liitetään yhdeksi pyöreäksi simulaatiorakeeksi, jolla on yhteiset ominaisuudet. Esimerkiksi neljä vesimolekyyliä muodostaa yhden simulaatiopartikkelin, samoin metyyliryhmä. MARTINI määrittelee 16 erilaista simulaatiopartikkelia, jotka eroavat toisistaan varaukseltaan, jonka mukaan niiden vaikutus muihin partikkeleihin määräytyy. Nämä 16 luokkaa jakautuvat neljään yläluokkaan: polaarisiin (hydrofiilisiin), poolittomiin (hydrofobisiin), ei-polaraasiiin (amfifiilisiin) ja varauksellisiin simulaatiopartikkeleihin. Kaikilla partikkeleilla on sama massa ja tilavuus, joskin rengasrakenteille on luotu omia, suurempia partikkelityyppejä. Eroa laskentakuormassa atomistisiin simulaatioihin verrattuna havainnollistaa simulaatiopartikkelien määrä; vedyt pois lukien 28 atomista koostuva kolesterolimolekyyli karkeistettiin kahdeksaksi simulaatiopartikkeliksi. Karkeistusta on havainnollistettu kuvassa 4.1. [12] Simulaatiopartikkelit voivat yleensä MD-simulaatioissa vuorovaikuttaa toisiinsa viidellä tavalla; kemiallista sidosvuorovaikutusta (bonded interactions) kuvaa kolme eri termiä ja ei-kovalenttista, pitkän kantaman vuorovaikutuksta kaksi (nonbonded interactions). Sidoksia kuvataan niiden venymisellä (strecthing), sidoskulman taipumisella (bond angle) ja dihedraalikulmien taipumisella (dihedral angle). Sidosvuorovaikutuksen eri tyyppejä on havainnollistettu kuvassa 4.2. Ei-kovalenttiset vuorovaikutukset jaetaan varautuneiden partikkelien välisiin vuorovaikutuksiin, joita kuvataan Coulombin yhtälöllä ja varautumattomien partikkelien välisiin Lennart Jones -vuorovaikutuksiin. [12] 1 http:// http://md.chem.rug.nl/ marrink/coarsegrain.html/

4. Menetelmät ja materiaalit 17 Kuva 4.1: Havainnollistus karkeistamisesta: kolesterolimolekyyli (vasemmalla) on karkeistettu kahdeksaksi simulaatiopartikkeliksi, ja neljä vesimolekyyliä (oikealla) yhdeksi. Kovalenttisen sidoksen venymistä kuvataan harmonisen potentiaalin lausekkeella: V (r ij ) = 1 2 k ij(r ij b ij ) 2, (4.5) jossa i, j ja k kuvaavat kolmea sidokseen osallistuvaa partikkelia tässä järjestyksessä, k ij on voimavakio, r ij partikkelien välinen etäisyys ja b ij partikkelien välinen energiaminimietäisyys. Kovalenttisen sidoksen sidoskulman taipumista kuvataan samaan tapaan kuin sidoksen venymistä: V (θ ijk ) = 1 2 kθ ijk(θ ijk θ 0,ijk ) 2, (4.6) jossa k θ ijk on voimavakio, θ ijk kuvan 4.2 mukainen kulma ja θ 0,ijk energiaminimin mukainen referenssikulma. Dihedraalikulmalla (torsiokulma) tarkoitetaan neljän partikkelin muodostaman kahden tason välistä kulmaa siten, että ensimmäiset ja viimeiset kolme partikkelia määrävät tasot. Siis jos dihedraalikulma on nolla, kyseessä on cis-konfiguraatio, ja kulman ollessa 180 astetta trans-konfiguraatio. MD-simulaatioissa voidaan käyttää seuraavaa kaavaa dihedraalikulmien energiaa laskettaessa: V (ω ijkl ) = k ω (1 + cos(nω ijkl kω s )), (4.7) jossa k on voimavakio ja n energiaminimien lukumäärä, ω ijkl dihedraalikulman

4. Menetelmät ja materiaalit 18 arvo ja ω s dihedraalikulman referenssiarvo. r i θ k i ω i j j j k l Kuva 4.2: Havainnollistus kovalenttisten sidosten muuttujista Van der Waals -vuorovaikutuksia kuvataan Lennard-Jones (LJ) potentiaaleilla: V LJ (r ij ) = 4ε ij ( σij r ij ) 12 ( ) 6 σij r ij, (4.8) jossa σ ij ja ε ij määrittelevät referenssipituuden ja vuorovaikutuksen vahvuuden ja ovat kullekin partikkelityypille yksilölliset. MARTINI-voimakentässä vakion ε arvo vaihtelee välillä 2, 0 5, 6 kj/mol partikkelin polaarisuusasteen mukaan. Simulaatioiden keventämiseksi nopeasti merkittömäksi vähenevää LJ-potentiaalin arvoa voidaan lakata tietyn katkoetäisyyden (cut-off distance) päästä laskemasta. MARTINI-voimakentässä katkoetäisyytenä käytetään 1, 2 nm. Potentiaalin arvoa alettiin laskea 0, 9 nm etäisyydellä, jotta vältettäisiin energian epäjatkuvuudelta katkaisukohdassa (shift-function). Naapurilistoilla (neighbour lists) pidetään kirjaa kustakin partikkelista katkoetäisyydellä olevista partikkeleista. Naapurilistojen käyttö pitkän kantaman vuorovaikutuksia laskettaessa nopeuttaa simulaatioita oleellisesti. [12] Coulombin yhtälöllä lasketaan varautuneiden partikkelien väliset vuorovaikutukset: V (rij ) = q i q j 4πε 0 ε rel r ij, (4.9) jossa q i ja q j ovat partikkelien i ja j varaukset. Suhteellinen permittiivisyys on MARTINI-voimakentässä määritelty ε rel = 15. MARTINI-malli käyttää Coulombin vuorovaikutuksen laskemiseen samanlaista shift-funktiota kuin LJ-vuorovaikutukselle (1, 2 nm ja 0, 9 nm). [12] 4.3 Simuloidut systeemit Simulaatioista määritetyn pintajännityksen vertaamiseksi kokeellisiin tuloksiin simuloitiin trioleiini-vesi-rajapintaa kolmella eri tavalla: tasaisella trioleaattilevyllä vedessä (TRIOL-pinta) sekä 2 nm ja 4 nm säteisellä trioleaattipisaralla vedessä (TRIOL-2

4. Menetelmät ja materiaalit 19 ja TRIOL-4). Yksinkertaisen lipidikalvon ja apolipoproteiinin vaikutusta pintajännitykseen tutkittiin simuloimalla kolmea variaatiota lipoproteiinin rakenteesta: ytimen molekyyleistä koostuvaa pisaraa (ydin), ytimen ja lipidikalvon molekyyleistä koostuvaa pisaraa (emulsio) sekä ytimestä, lipidikalvosta ja apolipoproteiinista koostuvaa, kokonaista lipoproteiinipartikkelia vastaavaa pisaraa (lipoprot.). Nämä kolme rakennevariaatiota tehtiin sekä HDL- että LDL-partikkeleille. Systeemien sisältämät molekyylit on listattu taulukossa 4.1. Simulaatio TRIOL CHES POPC LysoPC CHOL Proteiini TRIOL-2 39 TRIOL-4 180 TRIOL-pinta 92 HDL-lipoprot. 39 122 260 10 49 2 ApoA-I HDL-emulsio 39 122 260 10 49 HDL-ydin 39 122 LDL-lipoprot. 180 1600 630 80 600 1 ApoB100 LDL-emulsio 180 1600 630 80 600 LDL-ydin 180 1600 Taulukko 4.1: Simulaatioiden molekyylikoostumus Kaikkien alkurakenteiden pohjana käytettiin ryhmässämme aikaisemmin rakennettuja, karkeistettuja HDL- ja LDL-partikkelien malleja [2, 9] ja niissä käytettyjä karkeistettuja molekyylimalleja. Niiden rakenne on tehty hyödyntäen MARTINIvoimakentän parametreja [12]. Rakenteiden toimivuutta on testattu vertaamalla niitä atomistisiin simulaatioihin vastaavilla molekyyleillä. Kolesterolin molekyylimallissa on kahdeksan simulaatiopartikkelia, ja kolesterolioleaattissa kolmetoista simulaatiopartikkelia. Käytetty kolesterolimalli hakeutuu simulaatioissa lipidikalvoon sen polaarisen hydroksyyliryhmän vuoksi. Tämän vuoksi se katsotaan kuuluvaksi lipoproteiinin pintakerrokseen, vaikka sen on aikaisemmin ajateltu sijaitsevan osittain ytimessä ja osittain pinnalla. Triglyseridin mallina käytettiin trioleaattia (TRIOL), jota kuvattiin 13 simulaatiopartikkelilla. Trioleaatissa glyseroliin on liittynyt kolme tyydyttynyttä, 18 hiiltä pitkää öljyhappoa. [2] Lipoproteiinien fosfolipideistä lysofosfatidyylikoliinia kuvaamaan käytettiin 1-palmitoyyli-3-fosfatidyylikoliinia (PPC, 7 simulaatiopartikkelia), rasvahapponaan 16- hiilinen palmitiinihappo. Fosfatidyylikoliinia kuvaa 1-palmitoyyli-2-oleyyli-3-fosfatidyylikoliinia (POPC, 13 simulaatiopartikkelia), jossa rasvahappoina ovat siis palmitiini ja öljyhappo. Näillä kahdella molekyylimallilla kuvataan lipoproteiineista löytyviä fosfolipidejä, lukuun ottamatta sfingomyeliinejä, joita ei toimivan mallin puuttuessa ole kuvattu lainkaan. [2, 13] Apolipoproteiinimallit on otettu suoraan ryhmässämme aikaisemmin tehdyistä

4. Menetelmät ja materiaalit 20 tutkimuksista. LDL:n pinnalla oleva ApoB-100 -apolipoproteiini on mallinnettu siten, että jokainen aminohappo (4536 kpl) on karkeistettu 1-5 simulaatiopartikkeliksi. Vastaavasti on toteutettu HDL:n kaksi ApoAI -apolipoproteiinia, joissa on kummassakin 243 aminohappoa. [23] Simulaatioissa on MARTINI-voimakentän vesimallia, jossa neljää vesimolekyyliä vastaa yksi simulaatiopartikkeli. MARTINI-voimakentästä löytyivät myös antifreezepartikkelit (WF), joilla estettiin osaa simulaatioista "jäätymästä". WF-partikkelit vastaavat tavallista W-partikkelia, mutta niiden koko on hieman suurempi ja vuorovaikutukset hieman eriävät. Nämä tekijät estävät vesimolekyylejä järjestäytymästä liikaa simulaation aikana. [12] Kokonaisten (LDL-lipoprot, HDL-lipoprot) ja apolipoproteiinittomien (LDL-emulsio, HDL-emulsio) partikkeleiden simulaatiot oli toteutettu ryhmässämme jo aiemmin [2, 9]. Pelkkiä sisusmolekyylejä (TRIOL, CHES) sisältävien systeemien alkurakenteet tehtiin poistamalla edellisistä rakenteista kaikki muut molekyylit. Samoin rakennettiin vain trioleaattia sisältävät partikkelit. Tasomaisen trioleaattipinnan (TRIOL-pinta) alkurakenne toteutettiin sijoittamalla yksittäisiä trioleaattimolekyylejä 5x5x16 nm kokoisen simulaatiolaatikon keskelle niin, että niistä muodostui noin 7 nm kerros. LDL:n ja sen modifikaatioiden simulaatiorakenteet on esitetty esimerkkinä kuvassa 4.3. Kaikkien systeemien energia minimoitiin käyttäen steepest descent -algoritmia [11]. Seuraavaksi simulaatiolaatikkoon lisättiin vesipartikkelit jonka jälkeen systeemejä simuloitiin jonkin aikaa NTP-olosuhteissa, jotta niistä muodostui pallomainen partikkeli tai TRIOL-pinnan tapauksessa tasainen pinta. Lopuksi poistettiin pallomaisen partikkelin ja trioleaattikerroksen sisälle joutuneet vedet "vesitaskujen" muodostumisen estämiseksi. Joissakin systeemeissä vesipartikkelien havaittiin järjestäytyvän. Näissä tapauksissa 10% partikkeleista korvattiin MARTINI-voimakentän kehittäjien luomilla antifreeze-partikkeleilla [12], jotka estivät hyvin veden jäätymisen. Simulaatiot toteutettiin GROMACS 4.2 MD-ohjelmalla [11]. Kaikkia systeemejä simuloitiin vähintään 1 μs. Analyysissa käytettiin vain simulaatioiden varmasti stabiloituneita osia. Pallomaisten systeemien katsottiin olevan stabiili, kun systeemin simulaatiolaatikon koko ja partikkelien gyraatiosäteet (radius of gyration) pysyivät vakioarvon tuntumassa [11]. TRIOL-pinnan simulaatiossa simulaatiolaatikon x- ja y- pituudet pidettiin vakioina, ja paine määriteltiin erikseen xy-suunnassa ja z-suunnassa (semi-isotropic pressure), jotta trioleaatti saatiin pysymään levymäisenä. Muutoin simulaatioissa käytettiin normaalia MARTINI-simulaatioprotokollaa, joka on kuvattu viitteessä [12].

4. Menetelmät ja materiaalit 21 Kuva 4.3: LDL:n simulaatiosysteemit (vasemmalta oikealle): LDL-ydin, LDL-emulsio ja LDL-lipoprot. Kuvassa tummansinisellä fosfatidyylikoliinit ja vaaleansinisellä sfingomyeliinit (surfaktanttimolekyylit), keltaisella kolesteroliesterit, punaisella kolesteroli ja vihreällä triglyseridit (sisusmolekyylit) sekä harmaalla apolipoproteiini (apob-100). 4.4 Pintajännityksen laskeminen molekyylidynamiikkasimulaatioista Pintajännitys voidaan laskea painetensorin avulla käyttäen seuraavia yhtälöitä [24]: R S 3 = 0 r 2 [P N (r) P T (r)] dr 0 r 1 dr [P N (r) P T (r)] dr, (4.10) σ S = r 0 R S 2 [PN (r) P T (r)] dr, (4.11) jossa R on Laplacen säde, σ pintajännitys, P N partikkelin säteen suuntainen painekomponentti, P T tangentiaalinen painekomponentti ja r etäisyys partikkelin (massa)keskipisteestä. Pintajännityksen laskemiseksi täytyy siis laskea systeemin painejakauma. Painejakauman laskuun käytettiin tutkimusryhmässämme kehitettyä menetelmää pallomaisten systeemien painejakauman laskemiseksi molekyylidynamiikkasimulaatiosta [8]. Laskuissa simulaatiolaatikon tilavuus jaettiin 100x100x100 osatilavuuteen. Kullekin osatilavuudelle laskettiin erilliset painetensorit P (x, y, z). Kukin tensori muunnettiin karteesisista koordinaateista ( P (x, y, z)) pallokoordinaatteihin (P (r, θ, φ)) muunnosmatriisin T [8] avulla seuraavasti: P = T P T. Painetensorin tangentiaalinen ja radiaalinen komponentti säteen funktiona laskettiin pallon kuorelle osuvien osatilavuuksien painetensorien keskiarvona. Pintajännitys ja pinnan Laplacen säde laskettiin kaavojen 4.10 ja 4.11 avulla. Tasomaisen TRIOL-pinnan pintajännitys määritettiin GROMACS-ohjelman g energy -nimisellä ohjelmalla [11]. Molekyylidynamiikkasimulaatioden antamien tulosten virhe koostuu mm. karkeis-

4. Menetelmät ja materiaalit 22 tamisen aiheuttamasta epävarmuudesta, parametrisoinnin epävarmuudesta sekä käytettyjen matemaattisten sovellusten iteroinneista (esim. integraalien laskeminen numeerisesti). Tässä työssä virhetarkastelu tehtiin jakamalla trajektoritiedostot ajallisesti viiteen osaan, joille laskettiin erikseen paineprofiilit ja pintajännitykset. Virherajat saatiin keskiarvon keskivirheenä. Tulosten virheet on taulukoitu taulukkoon 5.1. Virheiden suuruus vaihtelee hieman; tasapainottumattomien trajektorien poiston jälkeen lyhyemmiksi jääneillä simulaatioilla virherajat ovat suuremmat.

23 5. TULOKSET JA NIIDEN TARKASTELU 5.1 Menetelmien toimivuus Simulaatioista määritetyistä massatiheysjakaumista nähdään, että systeemit muodostuvat odotetulla tavalla; hydrofobiset molekyylit muodostivat partikkelien keskusosan, jota amfifiiliset molekyylit ympäröivät. Proteiini asettui partikkelien pinnalle. Kuvaajista näkyy myös kolesterolin taipumus asettua partikkelin pinnalle. Samoin nähdään, ettei partikkelin rajapinta ole yksikäsitteisesti määritettävissä. Massatiheysjakaumakuvaajien osoittamaa partikkelien sädettä voidaan verrata pintajännityksen yhteydessä laskettuun Laplacen säteeseen ja havaita, että ne vastaavat toisiaan kohtuullisen hyvin. Kuvassa 5.1 on esimerkkinä kolmen simulaatiosysteemin (HDL-lipoprot, HDL-ydin ja TRIOL-4) massatiheys. Kuvassa 5.1 on esitetty myös esimerkkinä HDL-lipoprot.:n, HDL-ytimen ja TRIOL- 4:n simulaatiosta laskettu paineprofiili. Paineprofiileissa näkyy hyvin homogeeniset alueet partikkelin sisällä (TRIOL, CHES) ja ulkona (vesi), joissa paineen säteen ja tangentin suuntaiset komponentit ovat samat. Pintajännitys näkyy tangentin suuntaisessa painekomponentissa piikkinä pinnan kohdalla. Myös paineen komponentit ovat pintajännityksen vuoksi erisuuruiset partikkelin pinnalla. Painetensorin komponenttien arvot vaihtelevat suuresti lähellä partikkelin keskipistettä, sillä siellä osatilavuuksien keskiarvona laskettavaan paineen arvoon vaikuttavia osatilavuuksia on vähän. Painejakaumista näkyy selvästi partikkelien sisäinen paine, joka on seurausta pintajännityksestä, kuten yhtälöstä 3.1. nähdään. Partikkelien sisäisen paineen arvot vaihtelevat välillä 50 250 bar. Suuret arvot johtuvat partikkelin pienestä koosta, joka on kääntäen verrannollinen paineeseen (yhtälö 3.1). Sisäisen paineen riippuvuus partikkelin koosta on nähtävissä tuloksista: pienemmillä partikkeleilla on suurempi sisäinen paine. Partikkelien suurella sisäisellä paineella saattaa olla vaikutusta esimerkiksi sisusmolekyylien faasiin. Tässä työssä ei kuitenkaan keskitytä tähän asiaan. 5.2 Tulosten vertailu kokeellisiin arvoihin Simuloiduille systeemeille lasketut pintajännitykset on esitetty taulukossa 5.1. Tuloksista käy ilmi, että pintajännitys kaikille trioleiinisysteemeille on hyvin lähellä