Siklosporiinin määritysmenetelmät elinsiirroissa ii i Kaija Inkinen HUSLAB Kirurginen sairaala Labquality-päivät 4.2.2010
Elinsiirrot Suomessa Kiinteiden elinten siirrot ovat vakiintuneet käyväksi hoidoksi viimeisten parin vuosikymmenen aikana Suomessa saavutetut siirtotulokset ovat kansainvälisesti erittäin hyvää tasoa
Elinsiirrot Suomessa Vuosittain tehdään vajaat 400 elinsiirtoa Näistä 250 on kiinteiden id elinten siirtoja ja 125 luuytimen- tai veren kantasolujen siirtoja Siirteen saajista noin 40 on lapsia Tavanomaisten elin- ja kudossiirtojen ohella tehdään myös kuodosten kuten luun, ihon, verisuonten ja sarveiskalvon siirtoja
Elinsiirrot Suomessa Elinsiirtojen alkamisvuosi Suomessa Munainen 1964 Mk Maksa 1982 Sydän 1985 Sydänkeuhko 1988 Keuhko 1990
Elinsiirrot Suomessa Kiinteiden elinten siirrot Suomessa Elin 2008 Yhteensä 1964-2008 Munainen 150 5451 Maksa 47 752 Sydän 21 437 Keuhko 12 111 Sydänkeuhko - 35 Yhteensä 6786
Elinsiirteiden hyljinnän esto immunosuppressiolla pyritään estämään haitallinen immunolginen vaste, akuutti rejektio elinsiirroissa käytössä yleisesti kolmois- hoitoa, jossa yhdistettään kolmea erityyppistä lääkettä: immunofiliineihin sitoutujat solusalpaaja glukokortikoidit
Kaavamainen yleiskuva solujen vuorovaikutuksesta T-solu aktivaatiossa Sytotoksinen Tsolu IFN-γ γ Il-2 Makrofagi Aktivoitunut Tsolu Il-2 B solu Il-4 IL-5 Il-6 Plasma solu T solujen klonaalinen ekspansio Va sta -a ine
Activation of IL-2 gene Antigen-preseting cell Costimulatory signal T- cell receptor Calcineurin T-c ell CTLA4 NFAT NFAT Activa ted ca lcineurin Il-2 Il-2
No activation i of transcription i Antigen-preseting cell Costimulatory tory signa l T-cell receptor Tcell T-cell Ca lcineurin Cyclophilin NFAT CTLA4 Ca 2+ Cyclosporin Ina ctive NFAT AP1 Il-2- gene promotor Tra nsc riptio Il-2
Siklosporiinin molekyylirakenne Eristettiin sienestä: Tolypocladium inlatum 1970 (Thiele ja Kies) Immunosuppressiivinen ominaisuus keksittiin 1972 (Borel) On lipofiilinen polypeptidi Mw 1203
Siklosporiini veri/plasma suhde Siklosporiini on hyvin lipofiilinen Siklosporiinista sitoutuu n. 58% veren punasoluihin ja 33% plasmaan Plasmafraktio pääasiallisesti sitoutunut proteiineihin lähinnä lipoproteiineihin
Siklosporiinin farmakokinetiikka Annetaan sekä laskimoon että suun kautta, jolloin imeytymisen i huippu saavutetaan noin 2-4 tunnissa Imeytyy maha-suolikanavasta Imeytyminen vaihtelee samallakin henkilöllä päivästä toiseen Biologinen hyötyosuus on vaihteleva (alle 50%) Eliminaation puoliintumisaika veressä on 12-10 10 h
Siklosporiinin farmakokinetiikka CYP3A4 isoentsyymin toimintaa indusoivien tai estävien lääkkeiden samanaikainen käyttö voi aiheuttaa huomattavia lääkepitoisuuden muutoksia Osa annnoksesta erittyy virtsan kautta metaboliitteina
Siklosporiinin farmakokinetiikka Metaboloituu maksassa mikrosomallisen sytokromi P450-isoentsyymin CYP3A4:n välityksellä CYP3A4 isoentsyymin geneettinen vaihtelu on osasyynä yksilöiden välisiin eroavaikusksiin CyAn metaboloitumisessa
Pharmacokinetic profile (AUC)
Inter-patient variability in absorption of CyA
Siklosporiinin haittavaikutukset munaistoksisuus verenpaineen kohoaminen hermostosivuvaikutukset infektiot suurentuntu syöpäriski diabetes yhteisvaikutukset muiden lääkkeiden kanssa
Siklosporiinin metaboliitit Noin 30 eri metaboliittia, joiden immunosuppressiivinen aktiivisuus on alle 10% Merkittävää ristireaktiota anti- CyA vasta- aineiden kanssa on todettu metaboliiteilla: AM1, AM9, AM4N, AM19 ja AM1C
Siklosporiinin pitoisuusmääritykset pitoisuusmääritykset tarpeellisia hyljinnän ja toksisuuden välttämiseksi i kapea terapeuttinen alue imeytyminen vaihetelevaa tehtävä säännöllisesti mitataan yleensä pohjapitoisuus (trough) terapeuttinen taso n. 100-300 µg/l kokoveressä
Siklosporiinin pitoisuusmääritykset Tällä hetkellä maailmalla on ainakin 8 erilaista CA CyAn immunologista i määritysmenetelmää. ääi Niissä kaikissa on yleensä monoklonaalinen CyAlle spesifinen vasta-aine. Menetelmät ovat erilaisia kompetitiivisia immunomenetelmiä, joissa mittaus perustuu joko entsyymireaktioon, kemiluminometriaan tai fluoresenssipolarisaatioon (FPIA).
Siklosporiinin pitoisuusmääritykset Myös radioimmunomenetelmää on käytetty, mutta se on väistymässä. Mittaukset t ovat pitkälle automatisoituja, j, mutta vaativat aina jonkinasteisen esikäsittelyn punasolujen hajottamiseksi.
Siklosporiinin pitoisuusmääritykset Immunologiset menetelmät mittaavat vaihtelevasti myöskin CyA:n metaboliitteja Menetelmän spesifisyyden kannalta on tärkeää, että siinä käytetty vasta-aine mahdollisimman vähän ristireagoi metaboliittien kanssa Spesifisin menetelmä CyAn emolääkkeen määrittämiseen on nestekromatografia tandem-massaspektrofotometri (LC/MS/MS) HPLC ja LC/MS/MS toimivat referenssimenetelminä.
Suositukset CyA lääkeainemääritykseen Koko verinäyte ja EDTA antikoagulantti Menetelmän on oltava spesifinen emolääkkeelle ll Ulkoinen laadunvarmistus on tärkeää CyAn pohjakonsentraatio (trough level) l) on määritettävä Näyteenottoaika on vakioitava yhden tunnin sisään ennen seuraavaa lääkeannosta Tiedot lääkkeen viimeisimmästä annostuksesta ja ajankohdasta Suositeltava monitorointi heti elinsiirron jälkeen on kerran 24-48 48 tunnin sisällä
Suositukset CyA lääkeainemääritykseen Laboratorion pitää pystyä tarjoamaan määritykset saman päivän aikana heti elinsiirron jälkeisenä ajanjaksona CyA tulos tulee aina tulkita yhdessä muiden laboratoriotulosten, kliinisen tilanteen ja muun immunosuppressiolääkityksen kanssa On tarvetta kehittää menetelmiä jotka pystyisivät mittaamaan yksittäisen potilaan immunosuppressiivista tilaa
Suositukset tcya määritysmenetelmien t i Toistuvuus: suoritusominaisuuksille CyA konsentraatiossa 50 µg/l: CV% 10% CyA konsentraatiossa 300 µg/l: CV% 5% Oikeellisuus (menetelmän vertailu validoituun i LC/MC/MC menetelmään): regressiosuoran kulmakerroin k 1,00 00± 01 0,1, intercept 15 µg/l Hyväksyttävä ä tilastollinen t lli menetelmävertailu t on esim. Deming ja Passing Bablok metodi
CyA:n määritysmenetelmiä Menetelmän Määritys detektio Valmistaja Laite FPIA Fluoesenssipolarisaatio Abbott TDx FPIA Fluoesenssipolarisaatio Abbott AxSYM CMIA Kemiluminometria Abbott Architect RIA CYCLO- Trac SP Jodi 125 DiaSorin Gammalaskuri CEDIA PLUS Entsymaattinen Microgenics Emit Advia ACMIA Entsymaattinen Kemiluminometria Kolorimetria Siemens medical Siemens medical Siemens medical Olympus AU, Hitach Integra800 Centaur Dimension RxL Referenssimenetelmä LC/MS/MS nestekromatografia tandem massaspektrofotometri
CyA:n määritysmenetelmiä Suomessa Menetelmä Laite Tekopaikka ADVIA Centaur ADVIA Centaur OYS Lab/Pori/Jyväskylä CMIA Architect HUSLAB, ISLAB, TYKSLAB, Vaasa FPIA AxSYM Päijät-Hämeen shp Emit Integra800 Ph Pshp Lbk Lab.keskusk
CyA menetelmien suorituskyky Toitettavuus, sarjojen välinen CV% Menetelmä Low Medium High Advia 3,8 2,9 4,1 AxSYM* 6,7 4,4 7,2 CMIA 10,5 7,9 8,6 CMIA HUSLAB** 10,2 8,0 8,1 EMIT 6,5 4,8 *Sabaté et al., Ther Drug Monit. 2000 Aug;22(4):474-80. Muut: Pakkausselosteesta ** Validointiraportti
CyA menetelmien suorituskyky Regressio vs LC/MC/MC Menetelmä Siirto n Slope Intersept Mean d% Advia** Mun 105 0,98 16,0 Maksa 69 0,95 16,0 Sydän 68 0,89 20,0 AxSYM* Mun 99 1,17 13,2 32,0 Maksa 95 130 1,30 40,2 47,5 Sydän 97 1,09 30,0 33,9 CMIA** Kaikki 227 1,20-24,9 EMIT* Mun 99 1,07 16,2 23,9 Maksa 95 1,15 14,7 31,2 Sydän 97 101 1,01 40,44 20,22 *Schütz E et al., Clin Chem. 1998 Oct;44(10):2158-64 64. ** Pakkausseloste
CyA metaboliittien ristireaktiot FPIA TDx % RIA Meta- boliitti CYCLO- Trac % CMIA* ADVIA EMIT FPIA % % % AxSYM AM1 7 0.7 <1.7 NS <0.3 7 AM1C NS ND <3.33 NS ND NS AM4N NS 0.8 <3.1 NS <0.3 NS AM9 19 1.7 <1.9 15 7.3 11 AM19 NS <0.1 <2.1 NS 3.0 NS % NS = not signicant (lower than CV), ND = not determined * : Abbott pakkausseloste Muut: Steimer W., Clin Chem. 1999 Mar;45(3):371 81.
CyA:n määritys HUSLABissa HUSLABin Kirurgisen sairaalan laboratoriossa siirryttiin CyA-määrityksissä joulukuussa 2008 Abbottin TDxlaitteella tehtävällä FPIA-menetelmästä saman valmistajan CMIA-menetelmään Architect-analysaattorilla Samalla lopetettiin HUSLABin Naistenklinikan laboratoriossa tehty RIA-määritys. RIA-menetelmää käytettiin pääasiassa sydän-, keuhko ja luuydinsiirtopotilaiden CyA-määrityksiin. Tällä hetkellä HUSLABissa on siten käytössä yksi CyAmenetelmä CMIA. Sillä tutkitaan kaikkien elinsiirtopotilaiden ii il id CyA-näytteet.
CMIA Chemiflex TM 2-Step Testi
Architect detektiomekaniikka
Architect Siklosporiini
CMIA-menetelmä Architect- analysaattorilla Menetelmävaihdon yhteydessä teimme menetelmävertailut paitsi TDx:ään ja RIA-menetelmään myös LC/MS/MS:ään sekä pienimuotoisia vertailuja muualla Suomessa käytettyihin y menetelmiin (Emit ja ADVIA) Uusi menetelmä validoitiin tuorenäytteillä Architect vs TDx (n=149). Tasoero menetelmien välillä riippui pitoisuudesta Siksi tulokset jaettiin kahteen ryhmään, alle ja yli 300 µg/l, ja käsiteltiin tilastollisesti
CMIA-menetelmä Architect- analysaattorilla Alle 300 µg/l Yli 300 µg/l CMIA vs FPIA n = 93 n = 56 R 2 0,94 0,73 Bias plot -7,1 % 16,0 % Passing & Bablok y=1,07x-20,66 y=1,34x-70,23 CMIA vs LC/MS/MS n = 174 n =79 R 2 0,94 0,95 Bias plot 0,9 % 5,2 % Passing & Bablok 0,97x+3,05 1,08x-15,67
CMIA vs LC/MC/MC Pitoisuus alle 300 µg/l Pitoisuus yli 300 µg/l Scatter Plot with Passing & Bablok Fit Scatter Plot with Passing & Bablok Fit 350 1800 300 1600 250 200 1400 1200 CMIA 150 Identity CMIA 1000 800 Identity 100 50 LC/MS/MS, R2=0,94 (n=174) 0 0 50 100 150 200 250 300 350 Passing & Bablok (I) fit (3.05 + 0.97x) 600 400 LC/MS/MS, R2=0,95 (n=79) 200 200 700 1200 1700 Passing & Bablok (I) fit (-15.67 + 1.08x)
CyA vertailuja HUSLAB ja OYKS Menetelmä n R2 Slope Intercept Ero % *CMIA vs LC/MC/MC 229 0,98 1,04-3,39 2,2 *CMIA vs TDx 149 0,95 1,26-48,33 1,6 *CMIA vs Advia 13 0,92 1,24-9,07 11,2 *CMIA vs EMIT 17 0,98 0,92-0,37-7,5 **Advia vs TDx 485 0,92 0,74-4,53-28,5 *HUSLAB HUSLAB ** OYKS
CyA vertailuja CMIA vs FPIA HUSLAB Advia vs FPIA OYKS 900 800 900 700 800 600 700 CMIA µg/l 500 400 300 Advia µg/l 600 500 400 300 Identity 200 100 0 FPIA µg/l R2=0.95 (n=149) Passing & Bablok (I) fit (-44.50 + 1.24x) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 200 100 0 FPIA µg/l R2 =0,92 (n=485) 0 200 400 600 800 Passing & Bablok (I) fit (-4.53 + 0.74x)
CyA vertailuja HUSLAB CMIA vs Advia n = 13 HUSLAB CMIA vs EMIT n = 17 Ero 11,2% Ero -7,5% Passing & Bablok Fit Passing & Bablok Fit 300 600 250 500 200 400 CM MIA 150 Identity MIA C300 100 200 50 100 EMIT Advia Identity 0 0 0 100 200 300 0 200 400 600
CMIA-menetelmä Architect- analysaattorilla CMIA-menetelmällä pitoisuusalueella alle 300 µg/l CyA- tulokset ovat matalampia kuin FPIA-menetelmällä mitatut, mutta tämän yläpuolella tulokset ovat merkittävästi korkeampia. Tasovertailu referenssimenetelmään (LC/MS/MS) osoitti CMIA-menetelmän toimivan verrattain yhtenevästi alle 300 µg/l pitoisuusalueella, mutta yli 300 µg/l pitoisuusalueella CMIA-tulokset olivat n. 5% korkeampia ki kuin referenssilaiteen ilit tulokset. tlk t
UKNEQAS International Proficiency testing Sh Scheme kierros Yli 400 osallistujaa yli 30 maasta Pääasiassa Euroopasta Kerran kuussa
CyA hoitotasoja t munaissiirtopotilaille ii til ill 35:stä eri transplantaatioyksiköstä v. 1995 Lake Louise Consensus Conference on cyclosporin monitoring in organ transplantation: report of the consensus panel. Oellerich M et al., Ther Drug Monit. 1995 Dec;17(6):642 54.
UKNEQAS International Proficiency testing Scheme kierros Eri menetelmien tulokset esitettynä BOX and Whisker plotilla, näytteenä poolattu potilasnäyte
UKNEQAS International Proficiency testing Scheme kierros Eri menetelmien tulokset esitettynä BOX and Whisker plotilla, näytteenä kokoveri johon lisätty tietty määrä siklosporiinia (mittaa vain emolääkettä)
UKNEQAS eri CyA menetelmien osallistujamääriä v. 2009 Kierros CMIA RIA TDX AxSYM Advia EMIT 309 40 5 40 38 10 59 308 37 4 43 37 9 60 307 39 4 65 49 10 73 306 27 5 47 35 6 55 305 24 6 48 44 63 304 34 7 72 59 71 303 23 6 47 44 30 302 19 5 53 49 65 301 24 8 75 65 73 300 21 8 72 66 74 299 24 10 81 62 71 298 21 9 78 67 77
Lopuksi Suomessa elinsiirrot on keskitetty HYKSin alueelle, mutta potilaiden jatkohoidot ja CyA- seuranta tapahtuvat eri puolilla Suomea kotipaikkakuntien keskussairaaloissa, usein eri menetelmillä Koska immunologiset menetelmät voivat merkittävästi erota tulostasoiltaan ja potilaan hoito on elinikäistä, olisi toivottavaa, että käytössä olisi yhteinen valtakunnan kattava immunologinen menetelmä. Tämä ä ei aina toteudu, johtuen esim. labrotorioiden id erilaisesta laitekannasta
Lopuksi Yhteistoiminta menetelmien vertailussa on välttämätöntä Kansainvälisiin ii laaduntarkkailukierroksiin ki k ii osallistuminen i on tärkeää
Viitteitä Immunosuppressant drugs--the role of therapeutic drug monitoring. Johnston A, Holt DW. Br J Clin Pharmacol. 2001;52 Suppl 1:61S-73S. Cyclosporin therapeutic drug monitoring - an established service revisited. Morris RG. Clin Biochem Rev. 2003 May;24(2):33-46. 46 Lake Louise Consensus Conference on cyclosporin monitoring in organ transplantation: report of the consensus panel. Oellerich M et al., Ther Drug Monit. 1995 Dec;17(6):642-54. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Consensus Conference on cyclosporin and tacrolimus. Oellerich M et al., Clin Biochem. 1998 Jul;31(5):309-16.