Histopatologian värjäystekniikka: äjä tk kierrospalaute Pirkko Hirsimäki TYKS-SAPA SAPA liikelaitos l i patologian palvelualue 5.2.2010 2010 1
Ulkoinen laadunarviointikierros: Histopatologia 4/2008 Osallistujat saivat valmiit parafiinileikkeet (kaksi näytelasia), toisen PAS-värjäystä ja toisen D-PAS-värjäystä varten vuoden 2008 lokakuussa. Leikkeet oli valmistettu parafiiniin valetusta 10 %:seen puskuroituun formaliiniin fiksoidusta kudoksesta. 2
Molemmilla laseilla oli 4 kudoslieriötä: -maksa, -paksusuoli, -musinoosi adenokarsinooma paksusuolessa ja -nenän limakalvon levyepiteeli. Leikkeet oli leikattu Superfrost -laseille ll ja käsitelty 60 min + 56 o C:ssa. 3
Lasit värjättiin seuraavasti: PAS PAS + diastaasi (D-PAS) 4
Kierroksen näytteet arvioi patologian erikoislääkäri ja 2 sairaalasolubiologia Turun yliopistollisen keskussairaalan patologian yksiköstä. Esitetyt laboratoriokohtaiset arviointitulokset i i olivat konsensus. 5
VÄRJÄYSTEN ARVIOINTI Värjäyksen arviointiasteikko: 0-5 5 pistettä ttä = erinomainen i 4 pistettä = lähes moitteeton, lievää ali- tai ylivärjäytymistä, vähäistä epätasaisuutta jne. 3 pistettä = hyvä, diagnoosin kannalta riittävä, mutta selkeää ali- tai ylivärjäytymistä, epätasaisuutta, sakkaa jne. 2 pistettä = tulos on heikko ja diagnoosin kannalta epävarma 1 pistettä = epäonnistunut, värjäytymistä havaittavissa, i vaikka erittäin niukasti 0 pistettä = negatiivinen, epäonnistunut 6
Osallistumisaktiivisuus: PAS: 33 D-PAS: 28 7
PAS-värjäys PAS-värjäystä käytetään glykogeenin ja neutraalien limojen osoittamiseen. PAS (periodic acid Schiff)-reaktiossa muodostuu dialdehydejä. Värjäyksessä perjodihappo hapettaa glykogeenissa ja neutraaleissa limoissa olevien 1,2-glykolien tai niiden amino- tai alkyylijohdannaisten hiili-hiili-sidokset. 8
Dialdehydit reagoivat Schiffin reagenssin kanssa, joka sisältää emäksistä fuksiinia, natriummetabisulfiittia ja suolahappoa. Reaktiotuote on voimakkaan punainen. 9
Optimaalinen PAS-värjäys laadunvalvonnan näytteissä: Maksan glykogeeni ja nenän limakalvon levyepiteelin glykogeeni värjäytyivät purppuranpunaisiksi, paksusuolen kryptat ja musinoosi adenokarsinooma paksusuolessa värjäytyivät punaisiksi. Tyvikalvot (nenän limakalvo, paksusuoli), leukosyyttien sytoplasma ja Kupfferin solujen sytoplasma maksassa värjäytyivät punaisiksi. 10
Optimalinen PAS-värjäys : Maksan glykogeeni ja nenän limakalvon levyepiteelin glykogeeni värjäytyvät purppuranpunaisiksi 11
Nenän limakalvo: Optimalinen PAS-värjäys, leukosyytit ja tyvikalvo. 12
Optimalinen PAS-värjäys: paksusuolen kryptat ja musinoosi adenokarsinooma paksusuolessa värjäytyvät punaisiksi 13
PAS-värjäyksen palautti 33 laboratoriota, joista 27 laboratoriota osoitti glykogeenin sekä muko- ja glykoproteiinit luotettavasti (pisteitä 5-3), 13 laboratoriota erinomaisesti (5 pistettä), 4 lähes moitteettomasti (4 pistettä) ja 10 laboratoriota t hyvin (3 pistettä). ttä) 14
Kaavio 1. PAS, jakauma. lab. lu ukum 14 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 pisteet it t 15
Eniten ongelmia aiheutti glykogeenin alivärjäytyminen (16 laboratoriota, joista 4:ssä tapauksessa oli lievää alivärjäytymistä). Neljässä tapauksessa glykogeenin lisäksi leukosyytit alivärjäytyivät. Kolmessa tapauksessa näistä myös tyvikalvot värjäytyivät heikosti. Yhdessä tapauksessa paksusuoli värjäytyi heikosti. Kahdella laboratoriolla oli tausta ylivärjäytynyt. 16
Epäonnistunut PAS-värjäys: glykogeenin alivärjäytyminen maksassa ja nenän limakalvon levyepiteelissä. 17
Optimaalinen (A, B) ja heikko (C, D) PAS-värjäys maksassa ja nenän limakalvon levyepiteelissä A B C D 18
PAS + DIASTAASI (D-PAS) D-PAS-värjäyksessä glykogeeni poistetaan entsymaattisesti joko amylaasin (syljessä) tai diastaasikäsittelyn (ja joskus siihen yhdistetyn pankreatiinikäsittelyn) avulla. Tällöin glykogeenin ja liman värjäytyminen voidaan erottaa toisistaan. i Värjäys on muuten samanlainen kuin PAS-värjäys. 19
Optimaalinen D-PAS-värjäys: Maksan glykogeeni ja nenän limakalvon levyepiteelin glykogeeni eivät värjäydy. Paksusuolen kryptat ja musinoosi adenokarsinooma paksusuolessa värjäytyivät y punaisiksi (muko- ja glykoproteiinit värjäytyvät). y Tyvikalvot (nenän limakalvo, paksusuoli), leukosyyttien sytoplasma ja Kupfferin solujen sytoplasma maksassa värjäytyvät punaisiksi. 20
Optimaalinen D-PAS-värjäys: Maksan glykogeeni ja nenän limakalvon levyepiteelin glykogeeni eivät värjäydy. 21
Vertailu: PAS ja D-PAS PAS PAS D-PAS D-PAS D-PAS D-PAS 22
Optimaalinen D-PAS-värjäys: Paksusuolen kryptat (A) ja musinoosi adenokarsinooma paksusuolessa (B) värjäytyvät y punaisiksi (muko- ja glykoproteiinit värjäytyvät). A B 23
D-PAS-värjäyksen palautti 28 laboratoriota, joista 27 laboratoriota osoitti muko- ja glykoproteiinit luotettavasti (pisteitä 3-5) 5), 12 laboratoriota erinomaisesti (5 pistettä), 8 laboratoriota lähes moitteettomasti (4 pistettä) ja 7 laboratoriota hyvin (3 pistettä). 24
Kaavio 2. D-PAS, jakauma. lab. lu ukum 14 12 10 8 6 4 2 0 1 2 3 4 5 pisteet it t 25
Ongelmana oli tyvikalvojen lievä alivärjäytyminen (3 laboratoriota) tai heikko värjäytyminen (10 laboratoriota). Leukosyytit olivat vaaleita yhdessä tapauksessa. 26
Epäonnistunut D-PAS-värjäys Maksa Nenän limakalvon levyepiteeli Paksusuoli Paksusuoli, musinoosi adenokarsinooma 27
Onnistunut D-PAS-värjäys Maksa Nenän limakalvon levyepiteeli Paksusuoli Paksusuoli, musinoosi adenokarsinooma 28
Menetelmistä Ainakin 19 laboratoriota suoritti konevärjäyksen ja ilmeisesti 8 laboratoriota käsivärjäyksen. Kaikki laboratoriot eivät lähettäneet menetelmiä (3 laboratoriota) tai menetelmäkuvaukset k olivat puutteellisia. i Niistä ei selvinnyt, oliko kyseessä kone- vai käsivärjäys. 29
Molemmat värjäykset onnistuivat hyvin suurimmalla osalla osallistuneista laboratorioista. Myös huonosti onnistuneita värjäyksiä oli sekä kone- että käsivärjäysten joukossa. 30
Värjäyksissä käytetty perjodihappopitoisuus pp p vaihteli välillä 0.5 % - 1 % ja inkubointiaika 3 15 minuuttiin. Schiffin reagenssi oli suurimmassa osassa värjäyksistä kaupallista, ainoastaan kahdessa värjäyksessä ilmeisesti itse tehtyä. 31
Inkubointiaika vaihteli 4 30 minuuttiin, suurimmassa osassa värjäyksistä se oli 10 minuuttia (13 kpl). Pidempi inkubointiaika antoi paremmat tulokset kuin lyhyt inkubointiaika. Värjäysten onnistumisen kannalta tärkeää on vaihtaa perjodihappoliuos ja Schiffin reagenssi riittävän usein. 32
Vastavärinä käytettiin Mayerin hematoksyliinia (19 laboratoriota) Colen hematoksyliinia (2 laboratoriota), Harrisin i hematoksyliiniä iä (1 laboratorio), Gill II hematoksyliinia (1 laboratorio), Light greeniä (1 laboratorio D-PASäjä värjäyksessä) ä) 33
3 laboratoriota ei käyttänyt lainkaan vastavärjäystä. Kahden laboratorion ohjeista ei selvinnyt, mitä hematoksyliiniä käytettiin. Vastavärjäys tai sen puuttuminen ei oleellisesti vaikuttanut lopputulokseen. 34
D-PAS-värjäyksessä äjä ä käytettiin ttii sylkeä (amylaasia) glykogeenin hajottamiseen (15 laboratoriota), pankreatiinia ja diastaasia (3 laboratoriota), diastaasia i (4 laboratoriota) t ja pankreatiinia (1 laboratorio). 2 laboratoriota ei ilmoittanut entsyymiliuoksen koostumusta. Glykogeenin hajottaminen onnistui kaikilla tavoilla. 35
Yhteenveto tuloksista PAS D-PAS ka 3,7 4,1 hyväksyttäviä/lkm (5-3 p.) p) 27/33 27/28 hyväksyttäviä/ y % 81.8 96.4 max.pisteet/lkm 13 12 (5 p.) max.pisteet/ % 39.4 42.9 36