Näytteen laatuun liittyvät preanalyyttiset tekijät. Joanna Ilvesaro Sairaalasolubiologi Patologian osasto Fimlab Laboratoriot oy

Transkriptio

1 Näytteen laatuun liittyvät preanalyyttiset tekijät Joanna Ilvesaro Sairaalasolubiologi Patologian osasto Fimlab Laboratoriot oy

2 Näytteen kulku virhemahdollisuuksia riittää Näytteen kulku potilaasta patologin mikroskooppiin tarkasteltavaksi pitkä ja monipolvinen - Virheiden mahdollisuudet moninaiset Tavoitteena mahdollisimman edustava näyte potilaasta irrotetusta kudoksesta Tavoitteena näyte, jonka pohjalta tarkka ja oikea diagnoosi on mahdollista ja helppoa

3 Muutamia harkittavia seikkoja Arch Pathol Lab Med May;135(5): Effects of preanalytical variables on the detection of proteins by immunohistochemistry in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Engel KB 1, Moore HM.

4 Prefiksaatio eli kylmä iskeemia Aika siitä, kun näyte irrotetaan potilaasta siihen, kunnes se laitetaan fiksatiiviin eli kiinnitysaineeseen (Cold Ischemia) Lämpötila +4 C parempi kuin huoneenlämpö Mitä lyhyempi aika sen parempi; täysin antigeeni- ja kudosriippuvainen - Herkimmillä vasta-aineilla raportoitu jo 1 h RT kylmäiskeemisen ajan jälkeen jopa 13% intensiteetin heikkenemistä - Raportoitu jopa 8 h RT ja jopa 24 h +4C prefiksaatioajoista ilman vaikutusta immunovärjäytyvyyteen Pyrkimys alle 1 h prefiksaatioaikaan - ASCO-ohjeistuksessa ER- ja PR-värjäyksille suositus

5 Fiksaatio - koostumus Formaliinifiksointi ehdottomasti käytetyin kiinnitysmuoto patologian näytteille Fiksaatiossa lukuisa määrä muuttujia: konsentraatio, ph, puskurointi, tilavuus - Vaikutus immunovärjäysten onnistumiseen vaihtelee Fiksatiivin tuoreus tai kaupallinen vs. omatekemä ei eroavaisuuksia kirjallisuudessa 10% NBF yleinen suositus - Lukuisat raportit puoltavat puskuroitujen (ph 5 tai ph 7) formaliinien käyttöä verrattuna puskuroimattomiin: tasalaatuisemmat immunovärjäykset, parempi näytteiden säilyminen - Optimaalinen fiksatiivi kuitenkin antigeeniriippuvainen (EGFR 4% NBF, jopa puskuri vaikuttaa Tris vs. PBS: CD3, CD4, CD8) - PBS-puskuroitu formaliini suosittu ja yleisesti siteerattu paremmaksi (ph 7,2)

6 Fiksaatio: tilavuus ja aika Tilavuus: suositus 1:10 näyte suhteessa fiksatiivin tilavuuteen - 1:1-1:20 Aika: suuri vaihteluhaitari - Alifiksaatio vs ylifiksaatio - Kliininen merkittävyys immunovärjäysten onnistumiseen - Vaikuttaa värjäyksen intensiteettiin, herkkyyteen, spesifisyyteen, laikukkuuteen, reunaefektiin Konsensus: 24 h sopii niin biopsioille kuin resekaateille h (suuri vaihtelevuus, jopa 30 min fiksaatioajat mahdollisia) - Suorituspaineet nopeuden kanssa - Antigeenien vaihtelu: selvä laadun heikkeneminen vasta erittäin pitkissä ajoissa ( esim. ER jopa 57 päivää) Alifiksaatio suurempi riski kuin ylifiksaatio

7 Fiksaatio: kiire Lämpötilan nostaminen Fiksatiivin injektointi Mikroaallot: - Suositus min. 4 h fiksatiivissa ennen MW, mikrotus max 5 min (Clinical Laboratory and Standard Institute LSI) - Kirjallisuuden mukaan mahdollista päästä tunneista minuutteihin Ultraääni - Ei varsinaisia suosituksia koskien immunovärjäyksiä, kokeellista (CLSI) Sekundäärifiksaus - Automaattikudosprosessorit, ei varsinaisia aikasuosituksia, mutta suositellaan osaksi kudosprosessointia Näytteen koko, dissekointi, fiksaatio vapaana vs. kasetissa/pussissa, näytteen laatu

8 Pesut Kudoksen pesu: ehkä harvinaisempaa Suomessa, käytössä silti laajalti - Pesu vedellä: kirjallisuudessa suosituksia jopa 24 h juoksevan veden alla pesu ennen prosessointi fiksatiivin poistamiseksi - ei haitallista vaikutusta ab-värjäyksiin aina 24 h juoksevan veden alla - Pesu alkoholilla: ei raportteja haitoista tai hyödyistä - Ei tarpeellinen

9 Prosessointi: reagenssit Dehydraatio ja kirkastus - Rajallinen määrä kirjallisuutta, vaikutus immunoihin: 1. Isopropanoli 2. Etanoli 3. Metanoli 4. Asetoni Muita käytettyjä reagensseja 1. Kloroformi 2. Ksyleeni 3. HistoClear, JFC ja muut ksyleenikorvikkeet 4. Tolueeni 5. Hiilitetrakloridiyhdisteet

10 Prosessointi: dehydraatio ja kirkastus lämpötila ja aika Lämpötila ja aika dehydraatiossa ja kirkastuksessa - Ristiriitaisia raportteja puoltaen sekä korkeampaa että matalampaa lämpötilaa kuin RT - Yksin dehydraatiolämpötilan laskeminen lisäsi immunoiden intensiteettiä, molempien vaiheiden lämpötilan laskeminen lisäsi taustaisuutta ja molempien vaiheiden lämpötilan nostaminen taas lisäsi immunoiden intensiteettiä verrattuna RT inkubaatioihin - Dehydraatioajan nostaminen 10 h nosti immunoiden intensiteettiä ja vähensi taustaa lyhempiin aikoihin verrattuna, kirkastuksen ajalla ei raportoitua vaikutusta Ohjeistus h dehydraatio - 15 min 3 h alkoholisarja viidessä stepissä

11 Parafiinin impregnaatio Vahan laatu sinällään ei vaikuta immunoiden onnistumiseen - Hyviä tuloksia niin polymeeri-, nonpolymeeri- kuin mikrokristalliinivahoilla Parafiinin sulamislämpötilalla vaikutusta - Matalassa lämpötilassa (45C) sulavat vahat parhaimmat immunovärjäykset verrattuna korkeisiin lämpötiloihin (65C) Parafiinin imeyttämisvaiheen pituus voi olla merkittävä - Ristiriitaisia raportteja kummankin eduksi Suositukset: - 30 min 4,5 h 2-3 vaiheessa

12 Valu Valussa erinomaisen tärkeää kiinnittää huomiota kudoksen tasaiseen asettamiseen valumuottiin Mahdollistaa tai estää näytteen tasaisen leikkaamisen Näytteen säästyminen, lisäleikkeiden mahdollisuus Uudelleenvalu mahdollista, hidastaa prosessia

13 Näytteen leikkaus ja kiinnitys Terätyyppi ja vaihtotiheys Mikrotomin puhdistus ja huolto Parafiiniblokin lämpötila Näytelasin pinnoite/esikäsittely Vesihauteen olosuhteet Parafiininäytteen kiinnittäminen näytelasille: - 24 h RT - Yli yön 37C - 1 h 60C - Haittavaikutus nähtävillä jo 4 h +60C (23% tutkituista ab), 8 h 60C (69% tutkituista ab)

14 Parafiiniblokkien ja -leikkeiden säilytys Blokit: - Vähiten kriittinen vaihe vuotta tutkittua raportoitua tietoa - Antigeenin paljastusmetodeja muuttamalla erittäinkin vanhoista näytteistä saatavilla kunnon värjäyksiä - ikuinen säilytys viileässä raportoitu Leikkeet: - Suurempi vaikutus, riippuu näytteestä ja tutkittavasta antigeenista - Vaikutus molempiin suuntiin mahdollista - Suositus vain 7 vrk leikkaamisesta, raportoituja aina 300 vrk RT toimivuudesta - Antigeenien säilyvyys pidennettävissä lämpötilaa laskemalla -20C, ongelmana leikkeiden irtoaminen laseilta - Ristiriitaisia raportteja +4C säilytyksestä, onko todellista hyötyä kaikille vastaaineille? - Deparafinoidut lasit säilyvät huonommin, 10% sakkaroosi-pbs +4C voi auttaa

15 Värjäykset HE ja muut perusvärjäykset - Yleensä toimivuus hyvä näytteen fiksaatiosta/prosessoinnista huolimatta - Virheet nähtävillä, mutta yleensä näytteet silti katsottavissa - Laikukkuutta, tummuutta/vaaleutta, sinisyys, punaisuus

16 Dissekointi Kasetointi Fiksointi/Jäädytys Prosessointi Valu Leikkaus Perusvärjäykset Erikoisvärjäykset

17 Immunohistokemialliset värjäykset Immunovärjäykset - Vaativin - Heikoin lenkki - Kaikki virheet näkyvät Monta vaihetta laboratoriossa ENNEN varsinaisia immunohistokemiallisia (IHK) värjäyksiä Monta virhemahdollisuutta, joista osa korjattavissa, osa näytteen kannalta peruuttamattomia

18 Värjättävän kudoksen käsittely ENNEN varsinaista immunovärjäystä Näyte on pahentunut ennen fiksaatiota (kuivuminen, mädäntyminen, hajoaminen) Cold ischemic time Näytettä on fiksoitu liian kauan tai liian vähän aikaa (6h-)24h-72h (antigeenisyyden menetys vs. näytteen raakuus) Näytteeseen on tullut jäädytysartefaktoja Prosessoinnissa on epäonnistuttu (näytteeseen on jäänyt vettä, parafiinin impregnointi epäonnistunut)- lyhyemmät prosessointiajat, pikaprosessointi Ongelmat valussa (uudelleen valu) Huonot leikkeet pilaavat värjäyksen - ryppyisyys, repaleisuus, leikkeen paksuus (sakka, epätasainen värjäytyminen, solut monessa kerroksessa), epäluotettava värjäystulos

19 Automatisaation etuja immunohistokemiassa Toistettavuuden parantuminen Reagenssitilavuuksien minimointi Tietokoneohjaus- ja tallennus - Tietokone voi ohjata useampaa värjäysyksikköä - Ohjelmat tarkistettavissa jälkeenpäin - Monien ohjelmien yhtäaikaisajot, tuplavärjäykset jopa ISH Tietokonevalvonta reagensseista - Reagenssien määrä - Parasta ennen pvm valvonta - Virhepipetointien minimointi viivakoodimerkinnät sekä laseilla että reagensseista LIMSin kautta värjäyspyyntö siirtyy potilastietoineen (näytenumero) värjäysautomaatille virhenäpyttelyjen minimointi

20 IHK-värjäysprotokolla Lukuisia kohtia protokollassa muokattavissa 1. Parafiinin poisto lämmitys + parafiinia liuottava liuos (esim. ksyleeni, mutta IHKautomaattivalmistajilla omat liuoksensa) 2. Esikäsittely Antigen retrieval (AR), Epitope retrieval (ER), Heat-induced Epitope Retrieval (HIER) Tarkoitus katkoa formaliinifiksaatiossa tulleita sidoksia, jotka peittävät antigeenit ja estävät vasta-aine antigeeni kompleksin muodostumisen Tarkoitus poistaa proteiineja, jotka peittävät halutut antigeenit, jotta vastaaine pääsisi tunnistamaan halutun antigeenin esikäsittelyliuoksen ph, väkevyys ja lämpötila inkubaation kesto Tris-EDTA puskuri ph 9 ja Sitraattipuskuri ph 6 Mahdolliset entsyymikäsittelyt (pitoisuus, reaktiolämpötila ja aktiivisuus) yhdistelmät

21 Väärä esikäsittely Melan-A: Väärä pos. Alk ph + biotin CK-Pan: Väärä neg. vain entsymaattinen esikäsittely NordiQC

22 Värjäysprotokolla 3. Blokkaus - Epäspesifisen sitoutumisen estäminen, taustan vähentäminen 4. Vasta-aineinkubaatio - Kesto ja lämpötila - Vasta-aineen laimentaminen vs RTU 5. Detektiomenetelmä - Mitä vähemmän tunnistettavaa antigeenia näytteessä on, sitä herkempi menetelmä vaaditaan sen esille tuomiseksi - Mitä monivaiheisempi värjäysprotokolla on, sitä vähäisemmät määrät tutkittavaa antigeenia saadaan esille, signaalin monistaminen Pesut ja taustavärjäys!!!

23 Vasta-aineen konsentraatio Bcl-2 PAX-5 NordiQC

24 Vasta-ainekloonin valinta CK-HMW: Väärä pos. Ristireaktio tuntemattoman Ck-low kanssa NordiQC

25 Vasta-ainevärjäyksistä - Laaduntarkkailu Tarkoituksena, että vain tutkittava antigeeni värjäytyy KONTROLLIT!!! Kudos, jossa on tutkittavaa antigeenia (positiivinen kontrolli) Kudos, jossa ei ole tutkittavaa antigeenia (negatiivinen kontrolli) Kudos, jossa sekä positiviisia että negatiivisia soluja (sisäinen kontrolli) Positiivisen kudoksen inkubointi pelkällä diluentilla + osoituskitillä Kontrollimateriaalin käsittely IDENTTISESTI näytemateriaalin kanssa

26 Maan korvessa kulkevi Kivikkoja matkalla, tavoitteet korkealla

27 Theory is when you know everything but nothing works. Practice is when everything works but no-one knows why. In our lab, theory and practice are combined nothing works and no-one knows why. KIITOS!