In Situ Hybridisaatio - menetelmä patologian laboratorion työvälineenä Mervi Jumppanen sairaalasolubiologi Seinäjoen keskussairaala, patologian yksikkö
Sisält ltö Menetelmän n periaate FISH ja CISH Käyttöalueet patologiassa ISH näytteiden laaduntarkkailu
ISH menetelmän n periaate tunnistetaan nukleiinihappokoettimien avulla halutut jaksot solujen DNA:sta tai RNA:sta tunnistettava kohde voi olla kromosomi, kromosomin tietty alue, geeni jne. sitoutuneet koettimet visualisoidaan joko fluoresoivilla leimoilla tai leimattu koetin tunnistetaan immunohistokemiallisesti
Koetin Näyte DNA Leimaus + denaturaatio Denaturaatio 95ºC Hybridisaatio 37ºC
FISH vs. CISH Fluorescence in situ hybridization = FISH koetin leimattu fluoresoivalla merkkiaineella leima tarkasteltavissa suoraan fluoresenssimikroskoopin avulla Chromogenic in situ hybridization = CISH koetin leimattu esim. biotiinilla tai digoxigeninilla leimattu koetin tunnistettava immunohistokemiallisesti
Substraatti-kromogeeni liuos Polymeeri kompleksi (linkattu anti-laji X vasta-aineeseen ja entsyymiin Anti-DIG vasta-aine (laji X) Hybridisoitunut DIG-leimattu koetin
FISH vs. CISH
FISH vs. CISH FISH tarvitaan fluoresenssimikroskooppi analysoijalla oltava vankka kokemus fluoresenssimikroskopiasta ja FISH-näytteiden tulkinnasta valmistettu näyte n säilyy s vain muutamia kuukausia usean koettimen samanaikainen tunnistus mahdollista CISH pärjätään n valomikroskoopilla kudoksen morfologia tarkasteltavissa paremmin säilyy pitkää ään voidaan tunnistaa kaksi koetinta samanaikaisesti
Menetelmän n herkkyys riippuu nukleiinihappojen säilymisests ilymisestä kudoksessa fiksaatio: patologian laboratoriossa käytk ytössä 4% formaldehydi DNA on melko stabiili molekyyli toimii mrna hajotetaan nopeasti entsymaattisesti soluissa nopea fiksaatio/jää äädytys tärket rkeää nukleliinihappojen saavutettavuudesta esikäsittely sittely parantaa koettimien kulkeutumista kudoksessa kuumennuskäsittely sittely entsymaattinen käsittely koettimen leimauksen tehokkuudesta nick-translation random priming synteettiset koettimet + end labeling
Menetelmän n herkkyys ja spesifisyys riippuu hybridisaatio-tehokkuudesta tehokkuudesta koettimen suunnittelu (pituus, GC emäsparit) koettimen konsentraatio (liian korkea epäspesif spesif.) formamidi (liian alhainen epäspesif spesif.) suolakonsentraatio (liian korkea epäspesif spesif.) hybridisaatio lämpötila (liian alhainen epäspesif spesif.) ph pesulämp mpötila (liian korkea vääriä negatiivisia) leiman tunnistusmenetelmän n herkkyydestä autofluoresenssi tausta immunohistokemiallisessa leiman tunnistuksessa
Sovellukset patologiassa Monistumat Deleetiot Translokaatiot HER-2 onkogeenimonistuma Lymfoomat ja leukemiat Sarkoomat Virtsarakon välimuotoisen v epiteelin kasvaimet Aivokasvaimet: 1p 19 q deleetio Tulevaisuudessa esim. EGFR, topoisomeraasi,, PTEN geenien kopiolukujen tutkiminen tai esim. patogeenien tunnistaminen (papillooma virukset) jne.
CISH: HER-2 diploidi
CISH: HER-2 geenimonistuma
FISH: HER-2
HER-2 2 diagnostiikka HER-2 2 statuksen merkitys primää ääri vaiheen syöväss ssä jo useat faasi III vaiheen tutkimukset ovat osoittaneet, että varhaisen vaiheen HER-2 positiivisissa rintasyöviss vissä Herceptin yhdessä kemoterapian kanssa vähentv hentää huomattavasti uusiutumisriskiä verrattuna pelkkää ään kemoterapiaan
Vaikutukset HER-2 diagnostiikkaan HER-2 2 määm äärityksen tekeminen heti primää äärivaiheessa mahdollisimman nopeasti korostuu IHC vai CISH/FISH vai molemmat? HER-2 2 ja Ch17 CISH kaikista näytteistn ytteistä Ch17 vai IHC? corebiopsiasta vai tuumoriblokista?
FISH: Urovysion 1. 2. 3. 1. Normaalissa interfaasi solussa jokaista tutkittavaa kromosomia ja p16 geeniä on kaksi kopiota; CEP 3 (punainen), CEP 7 (vihreä), CEP 17 (sininen) and LSI p16 (keltainen). 2. Epänormaali tulos: kaksi kopiota kromosomia 3 (punainen), neljä kopiota kromosomia 7 (vihreä), viisi kopiota kromosomia 17 (sininen) ja yksi kopio p16 geeniä (keltainen). 3. Epänormaali tulos: kolme kopiota kromosomia 3 (punainen), 7 (vihreä) ) ja 17 (sininen) ja p16 geenin molempien kopioiden deleetio. www.urovysion.com
Translokaatio
Normaali Translokaatio www.dakocytomation.com
Knuutila; Suomen Lääkärilehti 17/2000
Knuutila; Suomen Lääkärilehti 17/2000
Ongelmakohdat ISH-tekniikoissa reagenssierien väliset v vaihtelut (etenkin entsyymi) esikäsittely sittely vanhat näytteetn fiksaatioajat? mahdollinen tausta immunovärj rjäyksessä (CISH) autofluoresenssi (FISH) riittämätön n koettimen pesu
ISH-näytteiden analysointi Oltava selkeät t kriteerit tulkinnoille solumää äärät signaalit Koulutus ja kokemus tärkeitt rkeitä Esim. HER-2 onkogeenimonistuma TAI >10% tumia, joissa 6 6 HER-2 2 geenikopiota HER-2 2 / kromosomi 17 kopiolukujen suhde 2 Solumää äärä: : 20? 100?
ISH - sisäinenlaaduntarkkailu inenlaaduntarkkailu Uuden entsyymierän n ja koettimen testaus ennen käyttk yttöönottoa Lämpötilojen seuranta (denaturaatio( denaturaatio, hybridisaatio,, pesu) Näytteiden kaksoisluenta ajoittain solublokit voivat olla hyviä kontrolleja
ISH - ulkoinenlaaduntarkkailu Nordic Quality Control UK NEQAS referenssi laboratoriot
DC-CISH CISH eli kaksiväri ri-cish digoxigenin ja biotiini leimattujen koettimien hybridisaatio yhtäaikaisesti Peroksidaasi ja alkaalinen fosfataasi entsyymit käytössä New Fuchin punainen kromogeeni TMB eli tetrametyylibentsidiini - vihreä kromogeeni
Laakso et al. J Pathol 2006; 210: 3 9.
DC-CISH CISH vs. FISH
Lopuksi In situ hybridisaatio menetelmä on kasvava osa-alue alue patologian laboratorioissa Kliinisesti merkittävi viä sovelluksia tulee luultavimmin koko ajan lisää ja tästt stä syystä patologian laboratorioissa tulisi olla hyvä tieto-taito taito ISH asioista